SANT-1、1yMRA、200nMTPB(PKC活化剂）、10nMLDN-193189。对于第 3 阶段的持 续时间，一些培养物用〇. 25mM抗坏血酸（目录#A4544,Sigma，M0,USA)进行处理。
[0247]d.第4阶段（胰腺前肠前体-2天）：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天， 所述MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0.0015g/ mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、0.25yMSANT-l、50nMRA、200nMTPB、50nMLDN-193189,连 同或不连同0. 25mM抗坏血酸。
[0248] e.第5阶段（胰腺内胚层，2-7天）：第4阶段细胞用MCDB-131培养基处理2-7天， 所述MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0.0015g/ 1^碳酸氢钠、2%无脂肪酸834、0.25 1^3六犯'-1、5〇11]\1狀，连同或不连同0.251111抗坏血酸。
[0249] 图20A至图20J描述了在根据实例11分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，下述 基因表达的实时PCR分析。图20A:生长抑素，图20B:PDX1，图20C:Pax6,图20D:Pax4,图 20E:NKX6. 1，图 20F:NGN3,图 20G:胰高血糖素，图 20H:NeuroD，图 201 :胰岛素，图 20J:嗜 铬粒蛋白。该图显示在第3阶段时或在第3和4阶段时添加抗坏血酸显著降低在第4-5阶段 时生长抑素和胰高血糖素的表达，同时增加胰岛素的表达（参见图20A、图20G和图201)。 此外，在第4-5阶段时，胰腺内胚层标志物例如H)X-1和NKX6. 1的表达通过添加0. 25mM抗 坏血酸并未显著改变（参见图20B和图20D)。在第4-5阶段时，Pax6表达下调，并且Pax4 表达维持（参见图20C和图20D)。在第5阶段结束时，在S3-S5时用+/-抗坏血酸处理的 培养物对于胰岛素、胰高血糖素和生长抑素激素进行免疫染色。表VII概括了胰岛素阳性 细胞、胰高血糖素和生长抑素阳性细胞、以及多激素细胞（一个细胞中的两种或更多种激 素表达）的平均百分比。
[0250]表VII
[0251]作为整体激素计数百分比的激素表汰
[0252]
[0253]实例 12
[0254]在第3阶段时抗坏血酸的最佳剂量
[0255] 执行该实例，以测定用于生成胰岛素阳性细胞的抗坏血酸的最佳剂量，所述胰岛 素阳性细胞是单一激素、PDX-1阳性和NKX6. 1阳性的。
[0256] 在不同传代（第40代至第52代）时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100, 000细 胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGEL? (1 : 30稀释）涂布的皿上的mTeSr?l培养基 和10yMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
[0257]a.第1阶段（定形内胚层（DE)_3天）：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全 PBS(无Mg或Ca) -起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGEL?涂 布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有 0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mMD-葡萄糖和 100ng/mLGDF8 加上1yMMCX化合物（GSK3B抑制剂）。对于第二天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处 理，所述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、 5mM葡萄糖和100ng/mL⑶F8加上100nMMCX化合物，随后为在补充有0. 1%无脂肪酸BSA、 0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mM葡萄糖和 100ng/mL⑶F8 的MCDB-131 培养基中 的另外一天。
[0258]b.第2阶段（原肠管-2天）：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所 述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mM D-葡萄糖，连同或不连同0. 25mM抗坏血酸和25ng/mLFGF7的添加。
[0259]c.第3阶段（前肠-2天）：对于第1天，第2阶段细胞用MCDB131培养基进行 处理，所述MCDB131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、 0. 0015g/mL碳酸氢钠、2 % 无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0. 25yM SANT-1、+/-0.25mM抗坏血酸、lyMRA、200nMTPB、100nMLDN-193189,随后用MCDB131 培养基处理另外一天，所述MCDB131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、 lXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、 0.25yMSANT-l、+/-0.25mM抗坏血酸、lyMRA、200nMTPB、10nMLDN-193189。
[0260]d.第4阶段（胰腺前肠前体-2天）：第3阶段细胞用MCDB131培养基处理两天， 所述MCDB131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/ mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、0.25yMSANT-l、50nMRA、200nMTPB、50nMLDN-193189,连 同或不连同0. 25mM至ImM抗坏血酸的添加。
[0261]e.第5阶段（胰腺内胚层，2-9天）：第4阶段细胞用MCDB131培养基处理2-9天， 所述MCDB131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/ 1^碳酸氢钠、2%无脂肪酸834、0.25 1^3六犯'-1、5〇11]\1狀，连同或不连同0.251111抗坏血酸 的添加。
[0262] 图21A至图21J描述了在根据实例12分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下 述基因表达的实时PCR分析的数据。图21A:生长抑素，图21B:PDX1，图21C:Pax6,图21D: Pax4,图 21E:NKX6. 1，图 21F:NGN3,g图 21G:NeuroD，图 21H:胰岛素，图 211 :胰高血糖素， 图21J:嗜铬粒蛋白。符合得自实例10的数据，在第2-4阶段时添加抗坏血酸显著减少生长 抑素、胰高血糖素和Pax6的表达，同时维持在第5阶段时的胰岛素和Pax4的表达。此外， 相比于与0. 25mM抗坏血酸，在S4时使用0. 5-lmM抗坏血酸没有显著有益效果。最后，在第 2阶段时添加抗坏血酸还证明在降低在第S3-5阶段时的胰高血糖素和生长抑素表达，同时 维持胰岛素表达方面是有效的。因此，抗坏血酸以阶段特异性方式起作用，以调节单一激素 细胞的表达。抗坏血酸的添加在分化方案的早期阶段中是重要的，而在晚期阶段时，其未证 明在减少多激素细胞数目中是有效的。
[0263]实例 13
[0264] 视昔酸和抗坏血酸的组合是牛成单一激素腠岛素阳件细朐所需的
[0265] 执行该实例，以阐明在多能细胞的分化过程中生成单一激素胰岛素阳性细胞的需 求。
[0266] 在不同传代（第40代至第52代）时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100, 000细 胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGEL? (1 : 30稀释）涂布的皿上的mTeSr?l培养基 和10yMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
[0267] a.第1阶段（定形内胚层（DE)_3天）：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全 PBS(无Mg或Ca)-起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGEL?涂 布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有 0.1%无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mMD-葡萄糖、100ng/mL⑶F8 和1yMMCX化合物（GSK3B抑制剂）。对于第二天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理， 所述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、碳酸氢钠、GlutaMax?、额外的5mM葡萄 糖、100ng/mL⑶F8和100nMMCX化合物，随后为在补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0.0012g碳 酸氢钠、IXGlutaMax?、5mM葡萄糖和100ng/mL⑶F8的MCDB-131培养基中的另外一天。
[0268]b.第2阶段（原肠管-2天）：细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131 培养基补充有〇. 1%无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mMD-葡萄糖、 0. 25mM抗坏血酸和25ng/mLFGF7,随后
[0269]c.第3阶段（前肠-2天）：对于第1天，细胞用MCDB131进行处理，所述MCDB131补 充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪 酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25mM抗坏血酸、0.25yMSANT-l、lyMRA、200nM TPB、lOOnMLDN-193189,随后用tMCDB131 处理另外一天，所述tMCDB131 补充有 1 : 200 稀 释的ITS_X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、10ng/ mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25mM抗坏血酸、0.25yMSANT-l、lyMRA、200nMTPB、10nM LDN-193189。
[0270]d.第4阶段（胰腺前肠前体-2天）：细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述 MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL 碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、0.25yMSANT-l、50nMRA、200nMTPB、50nMLDN-193189、0.ImM 抗坏血酸，随后
[0271]e.第5阶段（胰腺内胚层，3天）：细胞用MCDB-131培养基处理3天，所述MCDB-131 培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、 2%无脂肪酸BSA和下述培养条件：
[0272] ? +0.ImM抗坏血酸
[0273] ? 0?ImM抗坏血酸 +50nMRA
[0274] ? 0?ImM抗坏血酸 +50nMRA+0. 25yMSANT-1
[0275] ? 0?ImM抗坏血酸 +50nMRA+0. 25yMSANT-l+50nMLDN-193189
[0276] ?0?ImM抗坏血酸 +50nMRA+0. 25yMSANT-1+1yMAlk5 抑制剂
[0277] ?0?ImM抗坏血酸 +50nMRA+0. 25yMSANT-1+1yMAlk5 抑制剂 +50nM LDN-193189。
[0278] 图22A直到图22L显示了在根据实例13分化且在S5第3天时收获的胚胎干细 胞系H1的细胞中，来自下述表达的实时PCR分析的数据：Pax4(图22A) ;Pax6(图22B); PDX1 (图 22C);PTFla(图 22D);胰高血糖素（图 22E);胰岛素（图 22F);NeuroD(图 22G); ngn3(图 22H);Zicl(图 221) ;CDX2(图 22J);白蛋白（图 22K) ;NKX6. 1(图 22L)。
[0279] 在第5阶段结束时，用上文列出的组合处理的培养物对于胰岛素、胰高血糖素和 生长抑素激素进行免疫染色。表VIII概括了胰岛素阳性细胞、胰高血糖素和生长抑素阳性 细胞、以及多激素细胞（一个细胞中的两种或更多种激素表达）的平均百分比。
[0280] 如图22和下表VIII中所示，相比于在S5时仅用维生素C处理的培养物，在第5 阶段时添加低剂量的视黄酸加上抗坏血酸显著减少激素阳性细胞的总体数目，同时增加单 一激素胰岛素阳性细胞的百分比。此外，相比于仅用抗坏血酸（维生素C)处理的培养物， 视黄酸、抗坏血酸、音猬蛋白抑制剂和ALK5抑制剂的组合还增加单一激素胰岛素阳性细胞 的数目。该数据指示因子的独特组合是生成单一激素胰岛素阳性细胞所需的。
[0281]表VIII
[0282]作为在S5第3天时的整体激素计数百分比的激素表汰。
[0283]
【主权项】
1. 由多能细胞的逐步分化获得的胰腺内胚层细胞的体外分化群体，其中每个分化步骤 中的细胞在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中进行培养。2. 根据权利要求1所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中大于30%的所述分化的胰 腺内胚层细胞是 H)X-1+NKX6. 1+、SOX2-和 CDX2-。3. 根据权利要求1或2所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述分化群体中大于 10%的细胞是单一激素胰岛素阳性细胞。4. 根据权利要求1-3所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还 补充有TGF-B配体的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞。5. 根据权利要求1-4所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还 补充有WNT活化剂的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞。6. 根据权利要求1所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补 充有FGF配体的培养基中培养定形内胚层细胞。7. 根据权利要求1-4所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还 补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养 基中培养肠管细胞。8. 根据权利要求5所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补 充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养后前肠细胞。9. 根据权利要求1-6所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还 补充有抗坏血酸的培养基中培养细胞。10. 用于使多能细胞逐步分化成胰腺内胚层谱系的细胞群的体外方法，所述体外方法 包括在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中培养每个分化阶段中的所述细胞。11. 根据权利要求10所述的体外方法，还包括通过在补充有TGF-B配体和WNT活化剂 的培养基中培养所述多能细胞来使所述多能细胞分化成定形内胚层（DE)细胞。12. 根据权利要求11所述的体外方法，还包括通过在补充有FGF配体的培养基中培养 所述DE细胞来使所述DE细胞分化成肠管细胞。13. 根据权利要求12所述的体外方法，还包括通过在补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC 活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养所述肠管细胞来使所述肠管细 胞分化成后前肠内胚层细胞。14. 根据权利要求13所述的体外方法，还包括通过在补充有PKC活化剂、shh抑制剂、 类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养所述后前肠内胚层细胞来使所述后前肠内胚层细 胞分化成胰腺前肠细胞。15. 根据权利要求14所述的体外方法，还包括通过在补充有shh抑制剂、TGF-B抑制剂 和类视色素的培养基中培养所述胰腺前肠细胞来使所述胰腺前肠细胞分化成胰腺内胚层 细胞。16. 根据权利要求15所述的体外方法，还包括使所述胰腺内胚层细胞分化成胰腺P细 胞群。17. 根据权利要求10-16所述的体外方法，其中在至少一个步骤中，所述培养基还补充 有抗坏血酸。18. 根据权利要求10-17所述的体外方法，其中所述分化群体中大于10%的细胞是单一 激素胰岛素阳性细胞。19. 根据权利要求18所述的体外方法，其中培养物中大于30%的胰腺内胚层细胞是 PDX-1+、NKX6. 1+、SOX2-和 CDX2-。20. 用于使人胚胎干细胞分化成胰腺P细胞的体外方法，包括： a) 在补充有葡萄糖、TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养未分化的人胚胎干细 胞，以生成定形内胚层（DE)细胞群； b) 在补充有葡萄糖和FGF配体的培养基中培养所述DE细胞以生成肠管细胞群； c) 在补充有葡萄糖、shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP 抑制剂梯度的培养基中培养所述肠管细胞以生成表达I3DX-I和SOX2的后前肠内胚层细胞 群； d) 在补充有葡萄糖、PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养 所述后前肠细胞以生成相比于所述后前肠细胞，表达I 3DX-I和NKX6. 1并表达更低水平的 SOX2的胰腺前肠细胞群； e) 在补充有葡萄糖、shh抑制剂、TGF-B抑制剂和类视色素的培养基中培养所述胰腺 前肠细胞以获得相比于所述胰腺前肠细胞，表达roX-1、更高水平的NKX6. 1和更低水平的 SOX2的胰腺内胚层细胞群；和 f) 使所述胰腺内胚层细胞分化成胰腺P细胞群。21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述胰腺P细胞群是H)X-1+、NKX6. 1+、 SOX2-和 CDX2-。22. 根据权利要求20或21所述的方法，其中在至少一个步骤中，所述培养基还补充有 抗坏血酸。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述胰腺P细胞群是单一激素胰岛素生成细 胞，所述单一激素胰岛素生成细胞也是NKX6.1+和rox-i+。
【专利摘要】本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地，本发明提供了生成细胞群的方法，其中群体中大于10%的细胞表达单一激素胰腺β细胞特征性标志物。
【IPC分类】C12N5/0735, C12N5/02
【公开号】CN105143446
【申请号】CN201280070187
【发明人】A.雷扎尼亚
【申请人】詹森生物科技公司
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2012年12月7日
【公告号】CA2860107A1, EP2794857A1, EP2794857A4, US20130189777, US20150353895, WO2013095953A1