用于体外干细胞增殖和组织再生的生长基质的制作方法
【专利说明】
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请依照35U.S.C. 119(e)要求提交于2013年1月28日的美国临时申请第 61/757, 378号的权益，其内容以其整体并入本文。
[0003] 政府支持声明
[0004] 本发明在新泽西州脑损伤研究委员会授予的合同09-3207-BIR-E-2和 CBIR12FEL025的政府支持下完成。
技术领域
[0005] -般地，本发明涉及组织工程领域。特别地，本发明涉及重组蛋白-成纤维细胞生 长因子-2 (FGF-2)的稳定化，以促进其在干细胞中的生物学活性，以及用于培养干细胞的 方法。
【背景技术】
[0006] 干细胞疗法是组织工程和再生的有前景的领域，但是其在修复中枢神经系统 (CNS)尤其是严重损伤后的大脑中仅表现出了有限的成功。CNS损伤常引起广泛的特征在 于神经元和神经胶质细胞死亡的组织损伤，其中，存在实质上无功能的内源性神经干细胞 (NSC)的细胞替换。在中风动物模型中，据报道，少于1%的损毁神经元被室下区（SVZ)的内 源性神经前体所代替。在创伤性脑损伤（TBI)的动物模型中也获得了类似的结果。Salman 等人（JNeurotrauma21:283 - 292, 2004)观察到SVZ中的神经前体（NP)重新填充到机械 性损伤的皮层中。损伤区域附近的SVZ细胞产生了非常小比例的新神经元（未定量），而 大部分的移植细胞成为星形胶质细胞。直接移植NP到脑部病变的半影（penumbra)中产生 很小的进展（Sanberg等人，BrMedBull101:163-181,2012)。大多数移植的细胞不能存 活（Shindo等人，JMedInvest53:42 - 51，2006)或分化成神经胶质细胞而不是神经元 (Shear等人，BrainRes1026:11 - 22, 2004)。例如，Shear等人（2004)发现通过移植NP 产生了NG2阳性神经胶质细胞，并且Sun等人（ExpNeurol216:56 - 65, 2011)观察到他们 移植的大部分前体成为了 01ig2阳性细胞（可能的神经胶质细胞）。Ma等人（MolMedR印 4:849 - 856, 2011)报道了仅有4%的他们所移植的NP是NSC，从而仅有11 %分化成表达神 经元标记物的细胞。直接移植附着到支持基质上的干细胞到病变部位可能更有效地促进再 生。Tate等人（JTissueEngRegenMed3:208 - 217,2009)示出了在TBI后移植到支持 性纤连蛋白和层粘连蛋白基质中的NP的长期生存的改善。接受这些移植的动物相比于未 接受NP的受伤小鼠，在空间学习任务中显示出改善的能力（Tate等人，2009)。
[0007] 利用材料工程学和分子生物学的原理，组织工程师正在开发有机替代物以支持或 替换部分故障组织或器官以创建替代物。创建这些替代物的常见方法是使用活细胞、支架 和信号分子。Evans(SeminSurgOncol19:312 - 318, 2000)鉴定了对于神经组织支架而言 必要的四个组分：生长促进蛋白、细胞外基质（ECM)、支持细胞（通常是干细胞）和促进轴 突再生的分子。然而，干细胞不仅需要与细胞外基质以及生长促进蛋白相接触以增殖，还需 要保持干细胞的基本特性（干性（sternness))。通过整联蛋白受体发挥作用的细胞外基质 因子如层粘连蛋白和纤连蛋白已被证明对于干细胞自我更新是重要的。具有对于刺激胚胎 和成体干细胞的增殖而言所必要的生长促进蛋白，FGF-2,已被证明是至关重要的。
[0008]CNS的创伤性损伤适合于应用生物材料支架，这是因为存在细胞和ECM的广泛的 且局部的损失。支架可以作为移入的细胞和宿主组织的人造基质和支持性网络。此外，其 作为防止神经胶质疤痕的物理和化学屏障，其抑制轴突再生是公知的。ECM还是细胞功能的 重要调节物。ECM和整合素的相互作用管理着细胞过程如增殖、存活、迀移和分化。
[0009]因此，持续需要设计用于神经组织的再生疗法以开发模拟天然ECM的生物材料系 统。应设计这样的生物材料系统来获得高度适合作为用于细胞移植以修复创伤性脑损伤的 载体的支架。
【发明内容】
[0010] 由于上述问题、需求和目标，本发明人已设计了本发明的实施方式，其中多个干细 胞可以维持在2-D和3-D基质上，所述基质已被修饰以稳定其中的生长促进蛋白。因此，可 以使用这些基质（或生物材料支架），以例如促进CNS再生。
[0011] 在一个示例性实施方式中，培养干细胞群的方法依赖于将成纤维细胞生长因子 (FGF)固定于培养板的表面上。此方法通常有以下步骤：（i)用脱乙酰壳多糖溶液包被腔 室底部；（ii)干燥脱乙酰壳多糖溶液以形成脱乙酰壳多糖层；（iii)中和脱乙酰壳多糖层 的酸度；（iv)将肝素结合到脱乙酰壳多糖层；(v)使用京尼平（genipin)将肝素交联到脱 乙酰壳多糖层；(vi)结合生长促进蛋白；(vii)应用附着组分（例如，细胞外基质蛋白或细 胞外基质肽）的溶液；(viii)将附着组分结合到脱乙酰壳多糖，其创建多功能膜；和（ix) 将干细胞群接种到腔室并培养干细胞。方法还可以在添加各个组分间有洗涤/漂洗的步 骤。在一个优选的实施方式中，生长促进蛋白是一种或多种生长因子，如成纤维细胞生长因 子-2 (FGF-2)。不受理论束缚，铺在所公开的多功能基质上的干细胞能保持在多能和增殖 状态而不提供可溶性的生长促进蛋白。此外，相比于保持在补充有可溶性的生长促进蛋白 如FGF-2的培养基中的纤连蛋白包被的基质上的细胞，干细胞可以保持较小的成熟度和更 尚的增殖性。
[0012] 使用所公开的方法培养的干细胞高度适合于细胞移植以修复组织损伤，如创伤性 脑损伤。在一个实施方式中，本发明提供了通过向有治疗需求的受试者施用多功能基质来 修复受伤的哺乳动物组织的方法。多功能基质包含脱乙酰壳多糖_(京尼平）_生长促进蛋 白结合配偶体，其是固定其上的生长因子（优选FGF-2)上，单独的或与附着组分相组合。 在一个实施方式中，附着组分是纤连蛋白。在另一个实施方式中，附着组分是肽序列精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD)或异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸（IKVAV)。
[0013] 在示例性实施方式中，提供具有带有固定化的FGF-2、肝素、京尼平和脱乙酰壳多 糖的支架的多功能基质。在另一个示例性实施方式中，提供了具有脱乙酰壳多糖的支架、带 有固定化的FGF-2和纤连蛋白的京尼平连接的肝素的多功能基质。
[0014] 在一个实施方式中，提供了制造可注射的多功能微球支架的方法以获得高度适合 于作为细胞移植载体以修复创伤性CNS损伤的支架。在示例性实施方式中，作为细胞移植 的载体，脱乙酰壳多糖溶液被电喷雾到凝固浴中以产生微球（范围：30-100ym)，其随后可 进行修饰。接种到多功能微球中的原始神经前体可以在培养基中增殖，且包含细胞的微球 足够小，使得可以使用26直径（gauge)的汉密尔顿注射器将其注射进先前经历伤害的CNS 的区域。因此，这一多功能支架可以用作细胞和生长因子的递送载体以促进CNS损伤后的 神经组织损伤的再生。
[0015] 在下述实施例中描述了优选的方法和材料，其旨在说明而不是限制本发明。本领 域技术人员将获悉与本文所描述的相似或等同并且可以用于本发明的实践或测试中的方 法和材料。除非另有限定，所有本文所使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域 中的技术人员所通常理解的相同的含义。本发明的其它特征和优点将通过详细描述和权利 要求而呈现。
【附图说明】
[0016] 图1:对RG3. 6细胞的形态和增殖的基质效应。RG3. 6 (神经干细胞系）生长于补 充有B27和每天10ng/ml的FGF-2的DMEM/F12中5天。用F-肌动蛋白和DAPI染色细胞。 使用SigmaScanPro测量离核的突起长度。人工计数离核的突起数。误差棒表示SEM。用 Tukey'sposthoc通过AN0VA测定统计学显著性。（A)生长于具有各种吸附的肽的脱乙 酰壳多糖包被的皿中的RG3. 6细胞。20X放大。Ln:层粘连蛋白，Fn:纤连蛋白，Gel:明胶， PLL:聚-L-赖氨酸，Col:胶原蛋白，C:对照（仅脱乙酰壳多糖）（B)#* =P〈0. 001比对照 且???=P〈0. 001比层粘连蛋白和明胶。（C)*#P〈0. 001比PLL和对照，* =P〈0. 05比 PLL和对照，以及??=P〈0. 01比层粘连蛋白胶原和明胶。D)用核抗体Ki67和DAPI染色 细胞。比例尺，100ym。
[0017] 图2:固定化的FGF-2对NSC的增殖和存活的作用。次级NSC作为神经球生长 于补充有B27+/-10ng/ml的FGF-2的DMEM/F12中2天。解离后，细胞生长于有或没有肝 素（0. 5mg/mL)_京尼平（0.45mM)和FGF-2(1000ng/mL)的脱乙酰壳多糖-纤连蛋白包被 的96孔板上。对照每天仅接受FGF-2。（A)MTT分析（B)C-Fn-FGF-2 (可溶的）对照（C) C-H-G-Fn-FGF-2 (结合的）（D)CHG-Fn。C-Fn:脱乙酰壳多糖-纤连蛋白。CHG-Fn+ :脱乙酰 壳多糖-肝素-京尼平-纤连蛋白+结合的FGF-2。CHG-Fn-:脱乙酰壳多糖-肝素-京尼 平-纤连蛋白，无FGF-2。比例尺：100ym。
[0018] 图3:固定化的FGF-2对维持NSC的干性和分化的作用。原代NSC生长于补充 有B27土FGF-2的DMEM/F12中。用脱乙酰壳多糖和纤连蛋白包被皿，有或没有肝素-京 尼平-FGF-2固定化（1yg/mL)。对照每天仅接受FGF-2。在4DIV后收集细胞并分析分 化。㈧相衬图像20X。（B)在无FGF-2培养基中分化7DIV的二次传代NSC的三潜能 (Tripotentiality)。（C)分化条件的Western印迹分析：BLBP:脑脂质结合蛋白，TUJ1: 0 111-微管蛋白，GFAP:胶质纤维酸性蛋白，PCNA:增殖细胞核抗原，S0X2:SRY-盒2， MAP-2 :微管相关蛋白2。（D)图表代表了平均的I0D(积分光密度）比例尺，100ym。
[0019] 图4:可移植修饰的微球的表征。将通过离子凝结和电喷雾形成的微球与通过同 轴气流或无空气形成的球体比较大小。（A)微球制备的示意图。（B)电喷雾脱乙酰壳多糖 微球的20X相衬图像。（C)电喷雾微球的尺寸分布。（D)脱乙酰壳多糖微球直径的频率分 布。（E)共价交联至脱乙酰壳多糖微球的肝素的甲苯胺蓝染色。（F)NSC生长于用肝素-京 尼平-FGF-2修饰并用纤连蛋白吸附的电喷雾微球上。
[0020] 图5 :多功能微球很好地适合于CNS损伤的细胞替代疗法。（A)RG3. 6细胞在体外 分化并针对0IIITub( 0III-微管蛋白）、GFAP(胶质纤维酸性蛋白）和GFP(绿色荧光蛋 白）染色。（B)在创伤性脑损伤后7天，接受粘附有RG3. 6细胞的多功能微球支架移植物 的动物的脑切片的免疫荧光。针对GFP、巢蛋白和DAPI(4, 6-二脒基-2-苯基吲哚）染色。 (c)仅针对GFP染色的切片。（D)仅针对巢蛋白染色的切片。（A) 20X下，（B-D) 10X放大倍 数下获取。
[0021] 图6 :肝素在2D脱乙酰壳多糖膜和3D微球上的离子和共价固定。（A)脱乙酰壳多 糖、肝素和纤连蛋白的结构。（B)肝素固定于通过使用京尼平离子地和共价地脱乙酰壳多糖 包被的孔上。用甲苯胺蓝染料染色。（C)肝素、脱乙酰壳多糖和京尼平交联的脱乙酰壳多 糖-肝素复合物的FT-IR光谱。箭头指明来自京尼平交联的脱乙酰壳多糖-肝素复合物的 肝素和脱乙酰壳多糖的官能团。
[0022] 图7 :在京尼