的表达百分 比显示于每个直方图上。
[0038] 图15A至图15G显示了在根据实例9分化的细胞的S4第2天时，下述标志物的 FACS直方图表达谱。图15A:同种型对照；图15B:NKX6. 1 ;图15C:KI-67 ;图15D:嗜铬粒蛋 白；图15E:S0X2 ;图15F⑶X2 ;图15G 每种标志物的表达百分比显示于每个直方图 上。
[0039] 图16A至图16F显示了在根据实例9分化的细胞的S4第4天时，下述标志物的 FACS直方图表达谱。图16A:同种型对照；图16B:NKX6. 1 ;图16C:嗜铬粒蛋白；图16D: S0X2 ;图16E:⑶X2 ;图16F:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
[0040] 图17A至图17J显示了在根据实例9分化且在S1D3、S2D3、S3D4、S4D2和S4D4时 收获的人胚胎干细胞系HI的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图17A:CDX2 ;图 17B:HHex;图 17C:F0XE1 ;图 17D:IPF1(PDX-1);图 17E:NKX2. 1 ;图 17F:NKX2. 2 ; 图 17G:NKX6. 1;图 17H:PR0X1;图 171 :S0X2;图 17J:S0X9。
[0041] 图18A至图18G显示了在根据实例10分化的细胞的S3第3天时，下述标志物 的FACS直方图表达谱。图18A:同种型对照；图18B:NKX6. 1 ;图18C:嗜铬粒蛋白；图18D: S0X2 ;图18E:CDX2 ;图18F:KI-67 ;图18G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直 方图上。
[0042] 图19A至图19G显示了在根据实例10分化的细胞的S4第5天时，下述标志物 的FACS直方图表达谱。图19A:同种型对照；图19B:NKX6. 1 ;图19C:嗜铬粒蛋白；图19D: S0X2 ;图19E:CDX2 ;图19F:KI-67 ;图19G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直 方图上。
[0043] 图20A至图20J显示了在根据实例11分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，下述 基因表达的实时PCR分析。图20A:生长抑素；图20B:PDX1 ;图20C:Pax6 ;图20D:Pax4 ;图 20E:NKX6. 1 ;图 20F:NGN3 ;图 20G:胰高血糖素；图 20H:NeuroD;图 201 :胰岛素；图 20J:嗜 络粒蛋白。
[0044] 图21A至图21J显示了在根据实例12分化且在S4第2天、S5第2天和S5第9天 时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图21A: 生长抑素；图 21B:PDX1 ;图 21C:Pax6 ;图 21D:Pax4 ;图 21E:NKX6. 1 ;图 21F:NGN3 ;图 21G: NeuroD;图21H:胰岛素；图211 :胰高血糖素；图21J:嗜铬粒蛋白。
[0045] 图22A至图22L显示了在根据实例13分化且在S5第3天时收获的胚胎干细胞 系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图22A:Pax4;图22B:Pax6; 图 22C:PDX1 ;图 22D:PTFla;图 22E:胰高血糖素；图 22F:胰岛素；图 22G:NeuroD;图 22H: ngn3 ;图 221:Zicl;图 22J:CDX2 ;图 22K:白蛋白；图 22L:NKX6. 1。
【具体实施方式】
[0046] 将本发明的【具体实施方式】部分分成以下几个分部分，来描述或说明本发明的某些 特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
[0047]
[0048] 干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。 干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特 征还在于其在体外分化成来自多个胚层（内胚层、中胚层和外胚层）的多种细胞谱系的功 能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基 本上至大部分（如果不是所有的话）组织。
[0049] 干细胞通过其发育潜能分类为：（1)全能的，意指能够产生所有胚胎和胚胎外细 胞类型；⑵多能的，意指能够产生所有胚胎细胞类型；⑶多潜能的，意指能够产生细胞谱 系子系，但全部在特定组织、器官或生理系统内（例如造血干细胞（HSC)可产生的后代包 括HSC(自我更新）、局限于血细胞的寡能祖细胞、以及其为正常血液组分的所有细胞类型 和成分（例如血小板））；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子 系；以及（5)单能的，意指能够产生单细胞谱系（例如生精干细胞）。
[0050] 分化是未特化的（"未定向的"）或特化不足的细胞获得特化细胞（如神经细胞或 肌肉细胞）的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的 ("定型的"）位置的细胞。当应用于分化的过程时，术语"定型的"指在分化途径中已进行 到这样的点的细胞：其中在正常环境下，它继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，并 且在正常环境下，不能分化成不同细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。"去分化" 指细胞通过其回复到在细胞谱系内特化（或定型）程度较低的位置的过程。本文所用的 "细胞的谱系"限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将 细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特征性标志物指与目的谱系的细胞的表型明确 相关的特征，可用来评估未定向细胞向目的谱系的分化。
[0051] 如本文所用，"标志物"是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在这个情 形中，差异表达意思是阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多 肽的可检测水平，在目的细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域 公知的方法中的任何一种将目的细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
[0052] 如本文所用，当在细胞中检测到特定标志物时，细胞对于"特定标志物"是"阳性 的"或是"阳性的"。相似地，当在细胞中未检测到特定标志物时，细胞对于"特定标志物"是 "阴性的"或是"阴性的"。
[0053] 如本文所用，"第1阶段"和"S1"在本文中可互换使用，以鉴定表达定形内胚层 (DE)特征性标志物的细胞。
[0054] 如本文所用，"定形内胚层"指这样的细胞，其具有在原肠胚形成过程中起于上胚 层的细胞的特征，并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下述标志物中的至少一 种：HNF3 0、GATA4、S0X17、CXCR4、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit、CD99 和MIXL1。
[0055] 如本文所用，"肠管"指源自定形内胚层的细胞，所述细胞表达下述标志物中的至 少一种：HNF3_f3、HNFl_f3或HNF4_a。肠管细胞可产生所有内胚层器官，例如肺、肝、胰腺、 胃和肠。
[0056] 在本文中可互换使用的是"第2阶段"和"S2"，其鉴定表达原肠管特征性标志物的 细胞。
[0057] "前肠内胚层"指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的内胚层细 胞。
[0058] "后前肠"指可产生后胃、胰腺、肝和一部分十二指肠的内胚层细胞。
[0059] "中肠内胚层"指可产生肠、一部分十二指肠、盲肠和升结肠的内胚层细胞。
[0060] "后肠内胚层"指可产生横结肠远端三分之一、降结肠、乙状结肠和直肠的内胚层 细胞。
[0061] "第3阶段"和"S3"可互换使用，以鉴定表达前肠内胚层特征性标志物的细胞。如 本文所用，"表达前肠谱系特征性标志物的细胞"指表达下述标志物中的至少一种的细胞： PDX-1、F0XA2、CDX2、S0X2 和HNF4a。
[0062] 本文可互换使用的是"第4阶段"和"S4"，以鉴定表达胰腺前肠前体特征性标志物 的细胞。如本文所用，"表达胰腺前肠前体谱系特征性标志物的细胞"指表达下述标志物中 的至少一种的细胞：PDX-1、NKX6. 1、HNF6、F0XA2、PTFla、Proxl和HNF4a。
[0063] 如本文所用，"第5阶段"和"S5"可互换使用，以鉴定表达胰腺内胚层和胰腺内分 泌前体细胞特征性标志物的细胞。如本文所用的，"表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细 胞"指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6. 1、HNF1 0、PTF1a、HNF6、HNF4a、 S0X9、HB9或PR0X1。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞基本上不表达⑶X2或S0X2。
[0064] 如本文所用，"第6阶段"和"S6"可互换使用，以鉴定富含胰腺内分泌细胞的细胞。
[0065] 如本文所用，"胰腺内分泌细胞"或"胰腺激素表达细胞"或"表达胰腺内分泌谱系 特征性标志物的细胞"指能够表达下述激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生 长抑素、生长素释放肽和胰多肽。
[0066] "胰腺内分泌前体细胞"或"胰腺内分泌祖细胞"指能够变成胰腺激素表达细胞的 胰腺内胚层细胞。此类细胞可表达下述标志物中的至少一种：NGN3、NKX2. 2、NeuroD、ISL-1、Pax4、Pax6 或ARX。
[0067] 如本文所用，"功能胰腺0细胞"指能够是葡萄糖响应的并且对于PDX-1和NKX6. 1 是阳性的单一激素胰岛素阳性细胞。
[0068]本文可互换使用的是"(11"、"(11"和"第1天";"(12"、"(12"和"第2天";"(13"、"(13" 和"第 3天"等等。这些数字字母组合指定在本专利申请的逐步分化方案过程中的不同阶 段中的温育天数。
[0069] "抗坏血酸"和"维生素C"在本文中可互换使用，并且指人及其他动物物种的必需 营养物质。
[0070] "葡萄糖"和"D-葡萄糖"在本文中可互换使用，并且指右旋糖，在自然界中通常发 现的糖。
[0071] 对于特异性标志物"阳性"或其为标志物"+"（即rox-i+)的细胞是在其中可检测 到特定标志物的细胞。对于特异性标志物"阴性"或其为标志物（即NKX6. 1-)的细胞 是在其中通过本说明书中教导的方法无法检测到该标志物的细胞。
[0072] 在本专利申请中，"嗜铬粒蛋白"和"CHGN"可互换使用，以鉴定编码酸性分泌性糖 蛋白嗜络粒蛋白的基因。
[0073] 在本文中可互换使用的是"NeuroD"和"NeuroDl"，其鉴定在胰腺内分泌祖细胞中 表达的蛋白质及其编码基因。
[0074] 在本文中可互换使用的是"LDN"和"LDN-193189"，以指示可得自Stemgent(CA， USA)的BMP受体抑制剂。
[0075] 多能干细朐的分离、扩增和培养
[0076] 多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原（SSEA) 3和4以及可用称为Tra-1-60和 Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种（Thomson等人，Science282 :1145,1998)。 多能干细胞在体外的分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的丧失。未分化的多能 干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，所述碱性磷酸酶活性可通过用4%多聚甲醛固定细胞，然 后用矢量红（VectorRed)作为底物显色来检测，如由制造商（VectorLaboratories，CA， USA)描述的。如通过RT-PCR检测的，未分化的多能干细胞通常也表达0CT4和TERT。
[0077] 增殖多能干细胞的另一种希望表型是分化成所有三种胚层的细胞的潜能：内胚 层、中胚层和外胚层。多能干细胞的多能性可例如通过下述加以证实：将细胞注射到SCID 小鼠内，使用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后就来自三个胚层的细胞类型的证据对 它们进行组织学检查。作为另一种选择，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚 状体是否存在与三个胚层相关的标志物。
[0078] 增殖的多能干细胞系可以用标准G-显带技术进行核型分析并与所公开的相应灵 长类物种的核型相比较。希望获得具有"正常核型"的细胞，"正常核型"的细胞意指该细 胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有显著改变。多能细胞在培养物中可使用多 种饲养层或通过使用基质蛋白质涂布的容器容易地扩增。作为另外一种选择，与限定培养 基例如mTesr?l培养基（StemCellTechnologies，Vancouver，Canada))结合的化学成分 限定的表面可用于常规细胞扩增。多能细胞可使用酶促、机械或使用多种钙螯合剂例如 EDTA(乙二胺四乙酸）容易地从培养皿中取出。作为另外一种选择，多能细胞可在不存在任 何基质蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。
[0079] 多能干细朐的来源
[0080] 可使用的多能干细胞的类型包括源自妊娠后形成的组织的建立的多能细胞系，包 括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织（例如胚泡）、胚胎组织或胎儿组织，所述时间 通常但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干细胞（hESC) 或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCellResearchInstitute， Madison，WI，USA)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞 群体的细胞。还合适的是诱导多能细胞（IPS)或重编程的多能细胞，其可使用多种多能相 关转录因子的被迫表达而源自成人体细胞，所述转录因子例如0CT4、Nanog、Sox2、KLF4和 ZFP42(AnnuRevGenomicsHumGenet，2011，12:165-185)。在本发明的方法中使用的人胚 胎干细胞也可如由Thomson等人描述的进行制备（美国专利号5, 843, 780 ;Science，1998， 282 ： 1145 ；Curr.Top.Dev.Biol. , 1998,38 ： 133 ；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. , 1995 ：92 ： 7844)〇
[0081] 由多能干细朐形成表汰腠腺内怀层谱系特征件标志物的细朐
[0082] 多能干细胞的特征是本领域技术人员众所周知的，并且多能干细胞的附加特征不 断被鉴定。多能干细胞标志物包括例如下述中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、F0XD3、 C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、NAN0G、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60、 Tral-81〇
[0083]适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9 (NIH代码：WA09)、人胚 胎干细胞系HI(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7 (NIH代码：WA07)和人胚胎干细胞系 SA002(Cellartis，Sweden)。还适用于本发明的是表达下述多能细胞特征性标志物中的至 少一种的细胞：ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、NAN0G、 hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tral-60 和Tral-81 〇
[0084]定形内胚层谱系特征性标志物选自S0X17、GATA4、HNF3 0、GSC、CER1、Nodal、 FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白（E0MES)、DKK4、FGF17、GATA6、 CXCR4、C-Kit、⑶99和0TX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志 物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是原条前体细 胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面， 表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
[0085]胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、NKX6. 1、HNF1 0、PTF1a、HNF6、HNF4a、 S0X9、HB9和PR0X1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细 胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞，其 中rox-l和NKX6. 1的表达基本上高于⑶X2和S0X2的表达。
[0086] 胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUR0D、ISL1、PDX1、NKX6. 1、PAX4、ARX、 NKX2. 2和PAX6。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达下述激素中的至少一种：胰岛 素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征 性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞是胰腺 内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰腺内分泌 细胞可以是分泌胰腺激素的细胞。
[0087] 在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达P细胞谱系特征性标志物的细胞。 表达0细胞谱系特征性标志物的细胞表达roxi和下述转录因子中的至少一种：NKX2. 2、NKX6. 1、NEUROD、ISL1、HNF3 0、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达0细胞谱 系特征性标志物的细胞是0细胞。
[0088] 本发明描述了可生成单一激素胰岛素阳性细胞的体外方法和细胞群，所述单一激 素胰岛素阳性细胞也是rox-1和NKX6. 1阳性的。在本发明中使用的方法包括一系列阶段， 其以逐步方式指导人多能细胞通过下述中间阶段分化为单一激素细胞：
[0089] a)由未分化的人胚胎干细胞生成定形内胚层（DE)细胞，其包括在包含葡萄糖、 TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养多能细胞；
[0090] b)使DE细胞分化成肠管细胞，其包括在包含葡萄糖、维生素C和FGF配体的培养 基中培养DE细胞；
[0091] C)使肠管细胞分化成表达rox-i和S0X2的后前肠内胚层细胞。该分化通过在shh 抑制剂、BMP抑制剂、TGF-B配体、FGF配体、视黄酸、维生素C和PKC活化剂的存在下培养肠 管细胞来完成；
[0092]d)使后前肠内胚层细胞分化成胰腺前肠细胞，相比于后前肠细胞，所述胰腺前肠 细胞表达rox-l和NKX6. 1，并表达更低水平的S0X2。该分化通过在shh抑制剂、BMP抑制 剂、低剂量视黄酸、维生素C和PKC活化剂的存在下培养后前肠细胞来完成。
[0093]e)使胰腺前肠细胞分