）：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述 MCDB-131 培养基补充有 0. 1 %无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、2. 5mM D_ 葡萄糖和 50ng/mLFGF7。
[0187]c.第3阶段（前肠-3天）：第2阶段细胞用MCDB-131培养基进行处理，所述 MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL 碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、0.25yMSANT-l、50ng/mLFGF7、2yMRA、20ng/mL激活素-A 和lOOnMTPB，仅对于第3阶段的前2小时、6小时或24小时含有lOOnMLDN-193189。
[0188]d.第4阶段（胰腺前肠前体-3天）：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天， 所述MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0.0015g/ mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、25nMLDN-193189、2yMALk5 抑制剂、100nMCYP26A抑制剂 和 100nMTPB。
[0189]e.第5阶段（胰腺内胚层/内分泌前体-3天）：第4阶段细胞用MCDB-131培 养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IX GlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、和2yMALk5抑制剂。
[0190] 图12A至图12G示出了该实例中收集的数据的实时PCR分析。在第3阶段时用BMP 抑制剂处理至少2小时可触发促内分泌转录因子例如Ngn3(图12D)和NeuroD(图12E)的 表达，同时维持S0X2的极低表达（图12G)，并显著增加在S4-S5时的NKX6. 1 (图12A)和 H)X-1 (图12B)表达。然而，在第5阶段第3天时，⑶X2表达在用BMP抑制剂处理2或6小 时的细胞中高于用该抑制剂处理24小时的细胞中（图12F)。
[0191] 来自该实例的数据提示BMP途径的24小时抑制对于维持低水平的CDX2表达和 S0X2表达是最佳的，并且引发内分泌分化，同时维持胰腺内胚层标志物的高表达。
[0192]实例 8
[0193]第3阶段（前肠阶段）和第4阶段（腠腺前肠前体阶段）的最佳持续时间
[0194] 执行该实例，以测定在多能细胞逐步分化为胰腺内分泌谱系的细胞群中S3和S4 的最佳持续时间。
[0195] 在不同传代（第40代至第52代）时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100, 000细 胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGEL?(1 : 30稀释）涂布的皿上的补充有10yM Y27632的mTeSr?l培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
[0196]a.第1阶段（定形内胚层（DE)_4天）：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全 PBS(无Mg或Ca) -起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGEL? 涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充 有 0? 1%无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?;2.5mMD-葡萄糖；100ng/mL ⑶F8和1. 5yMMCX化合物（GSK3B抑制剂）。对于第2-4天，细胞随后用MCDB-131培养 基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA 0012g/mL碳酸氢钠；IX GlutaMax?;2. 5mM葡萄糖和 100ng/mLGDF8 ;随后
[0197]b.第2阶段（原肠管-2天）：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述 MCDB-131 培养基补充有 0. 1 %无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、2. 5mM D_ 葡萄糖和 50ng/mLFGF7。
[0198] c.第3阶段（前肠-2-3天）：第2阶段细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述 MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳 酸氢钠、2%无脂肪酸834、0.25 1^34犯'-1、50即/1^?6?7、2 1^狀、20即/11^激活素-八和 100nMTPB，含有100nMLDN-193189。细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-培 养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、2% 无脂肪酸BSA、0. 25yMSANT-l、50ng/mLFGF7、2yMRA、20ng/mL激活素-A和 100nMTPB。
[0199]d.第4阶段（胰腺前肠前体-2-3天）：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理两 或三天，所述MCDB-131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、 0.0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、25nMLDN-193189、100nMCYP26A抑制剂和 100nM TPB〇
[0200] e.第5阶段（胰腺内胚层/内分泌前体-2天）：第4阶段细胞用MCDB-131培 养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IX GlutaMax?、0. 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、和1yMALk5抑制剂。
[0201] f.第6阶段（胰腺内分泌前体/激素-2天）：第5阶段细胞用MCDB-131培养基处 理两天，所述MCDB-131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、 0.00158/11^碳酸氢钠和2%无脂肪酸85八。
[0202] 来自在第3阶段、第4阶段、第5阶段或第6阶段时收获的样品的实时PCR分析的 数据显示于图13A至图13G中。该数据显示当与具有两天S3和S4的培养物相比较时，使 S3和S4延长至三天增强NKX6. 1的表达（图13A)。当与其中S3和S4的持续时间仅两天 的培养物相比较时，在第3阶段时处理三天的细胞显示促内分泌标志物的表达的下调（图 13D和图13E)。此外，使第4阶段延长至三天的确显著增强S0X2的表达（图13G)。
[0203] 该实例中获得的数据符合先前实例中生成的数据，显示延长的BMP抑制使前肠偏 向高S0X2的群体。基于来自该实例和先前实例的数据，可得出结论第3阶段和第4阶段的 最佳持续时间为两天。理想方案将导致具有促内分泌标志物的高表达水平、高NKX6. 1、低 ⑶X2和低S0X2表达的分化细胞。
[0204] 实例 9
[0205]在高葡萄糖和B27补充剂的存在下，对BMP抑制的延长暴露显著增加在S3和S4 时的S0X2表汰
[0206] 执行该方案，以测定在多能细胞逐步分化成激素生成细胞的过程中影响在S3和 S4时S0X2表达的因子。
[0207] 人胚胎干细胞系H1的细胞在MATRIGEL?(1 : 30稀释）涂布的皿上进行培养，并 且在mTesr?l培养基中培养直至~70%汇合度时，并如下分化：
[0208]a.未分化的细胞在RPMI培养基（Invitrogen)中培养一天，所述RPMI培养基补充 有0. 2%FBS;100ng/mL激活素A;20ng/mLWNT-3a。细胞随后用RPMI培养基处理另外两 天，所述RPMI培养基补充有0. 5 %FBS; 100ng/mL激活素A(第1阶段）。
[0209] b.第1阶段细胞用DMEM/F12培养基处理三天，所述DMEM/F12培养基补充有2 % FBS;50ng/mLFGF7 (第 2 阶段）。
[0210] c.第2阶段细胞在DMEM-高葡萄糖培养基中培养四天，所述DMEM-高葡萄糖培养 基补充有1%827;0.25 1^5八犯'-1;2 1^狀；10〇1^/1^头蛋白（1?&〇878七61118，丽，1]5八）（第 3阶段）。
[0211] d.第3阶段细胞用DMEM-高葡萄糖培养基处理四天，所述DMEM-高葡萄糖培养基 补充有 1%B27 ;100ng/mL头蛋白；1yMALK5 抑制剂II(AxxoraCA，USA);和 50nMTPB(第 4阶段）。
[0212] 图14A至图14H描述了对于下述标志物获得的，对于在第3阶段第4天时收获的细 胞的FACS直方图：同种型对照（图14A)、嗜铬粒蛋白（图14B)、KI-67(图14C)、NKX6. 1 (图 14D)、S0X2 (图 14E)、HNF3B(图 14F)、CDX2 (图 14G)、PDX-1 (图 14H)。每种标志物的表达百 分比显示于每个直方图上。在第3阶段时的大多数细胞对于H)X-1 (图14H)和HNF3B(图 14F)的表达是阳性的，对于NKX6. 1(图14D)的表达是阴性的，并显示嗜铬粒蛋白（图14B) 和⑶X2(图14G)的低表达。然而，超过90%的细胞对于S0X2也是强阳性的（图14E)。这 指示在第3阶段时，大多数细胞对于H)X-1和S0X2是阳性的，并且对于NKX6. 1是阴性的， 提示在胰腺的rox-i域前的符合前肠群体的内胚层群体的建立。
[0213] 此外，在使用该实例概述的方案生成的细胞群中，其在第3阶段时是S0X2+的细胞 百分比显著高于在使用实例1概述的方案生成的细胞群中其为S0X2+的细胞百分比。该差 异可归于在该实例的第3阶段时，在培养基中对BMP拮抗剂头蛋白的延长暴露、FGF7和PKC 活化剂的缺乏。
[0214] 图15A直到图15G显示了在根据实例9分化的细胞的S4第2天时，下述标志物的 FACS直方图表达谱：图15A:同种型对照，图15B:NKX6. 1，图15C:KI-67,图15D:嗜铬粒蛋 白，图15E:S0X2,图15F:CDX2,图15G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图 上。
[0215] 图16A至图16F显示了在根据实例9分化的细胞的S4第4天时，下述标志物的 FACS直方图表达谱。图16A:同种型对照，图16B:NKX6. 1，图16C:嗜铬粒蛋白，图16D:S0X2， 图16E:⑶X2,图16F 每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
[0216] 下表V概括了对于根据该实例中概述的方案分化的细胞，对于在S3和S4时内胚 层标志物的％表达获得的数据。
[0217]麦1
[0218]在S3-S4时内怀层标志物的％表汰
[0219]
[0220] 图17A至图17J描述了在根据实例9分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，下 述基因表达的实时PCR分析的结果。图17A:CDX2,图17B:HHex，图17C:F0XE1，图17D: IPF1 (PDX-1)，图 17E:NKX2. 1，图 17F:NKX2. 2,图 17G:NKX6. 1，图 17H:PR0X1，图nT:S0X2， 图 17J:S0X9。
[0221] 如图14至17和表V中可见，在第4阶段的第2-4天时，存在NKX6. 1表达的显著 增加，同时维持rox-l的高表达。尽管S0X2的表达从第3阶段到第4阶段下降，但~75% 的细胞仍为S0X2+。与图5中相同，CDX2+细胞、S0X2+细胞和NKX6. 1+细胞与嗜铬粒蛋白 群体相互排斥。这暗示使用实例9中概述的方案生成的第4阶段第4天细胞群具有~50% NKX6. 1+S0X2+PDX-1+⑶X2-嗜铬粒蛋白阴性馏分。这与实例1中生成的细胞群形成对比，所 述细胞群具有40-70%TOX-1+NKX6. 1+S0X2-、CDX2-、嗜铬粒蛋白阴性馏分，并且在S4-S5时 具有2-25%PDX-1+NKX6. 1+S0X2+。明确的是，相比于实例9中生成的细胞，使用实例1中 的方案生成的细胞具有高得多的胰腺内胚层百分比，如定义为其为TOX-1+和NXK6. 1+同时 对于S0X2和⑶X2很低或阴性的群体。
[0222] 该实例中获得的数据提供了下述支持：在高葡萄糖和B27补充剂的存在下，对BMP 抑制的延长暴露显著增加在分化的第3和4阶段时的S0X2表达。
[0223]实例 10
[0224] 先前公开的方案导致在阶段3-4时显著数目的S0X2+群体形成
[0225]Kroon等人已公开用于由人胚胎干细胞制备胰腺内胚层谱系的细胞的方案 (NatureBiotech2008,26 :443-452 ;下文"Kroon"）。在此处提供的实例中，人胚胎干细胞 遵循Kroon方案进行分化，并测定不同分化阶段的特征性标志物的表达。
[0226] 人胚胎干细胞系H1的细胞在MATRIGEL?(1 : 30稀释）涂布的皿上铺平板，并且 在mTesr?l培养基中培养直至~70%汇合度时，并如下使用先前由Kroon公开的方案进行 分化：
[0227]a)使未分化的细胞暴露于RPMI培养基一天，所述RPMI培养基补充有0. 2%FBS、 100ng/mL激活素A、20ng/mLWNT-3a，随后用补充有 0? 5%FBS、100ng/mL激活素A的RPMI 培养基处理另外两天（第1阶段）。
[0228] b)使第1阶段细胞暴露于补充有2%FBS、50ng/mLFGF7的RPMI培养基三天（第 2阶段）。
[0229]c)第2阶段细胞用DMEM-高葡萄糖培养基处理三天，所述DMEM-高葡萄糖培养基 补充有1%827、0.25 1^5八犯'-1、2 1^狀、50即/1^头蛋白〇?&〇878七61118，]\^)(第3阶段）。
[0230]d)第3阶段细胞在补充有1 %B27的DMEM-高葡萄糖培养基中培养三天（第4阶 段）。
[0231]e)第4阶段细胞从孔中刮取，并作为簇重悬浮于补充有1%B27的DMEM-高葡萄 糖培养基中两天。
[0232] 图18A至图18G显示了在根据实例10分化的细胞的S3第3天时，下述标志物的 FACS直方图表达谱：同种型对照（图18A)、NKX6. 1 (图18B)、嗜铬粒蛋白（图18C)、S0X2(图 18D)、CDX2 (图18E)、KI-67 (图18F)、PDX-1 (图18G)。每种标志物的表达百分比显示于每 个直方图上。
[0233] 图19A至图19G显示了在根据实例10分化的细胞的S4第5天时，下述标志物的 FACS直方图表达谱。同种型对照（图19A)、NKX6. 1 (图19B)、嗜铬粒蛋白（图19C)、S0X2(图 19D)、CDX2 (图19E)、KI-67 (图19F)、PDX-1 (图19G)。每种标志物的表达百分比显示于每 个直方图上。
[0234] 如图18和19中所示，到第4阶段结束时（第5天），悬浮中的细胞簇为~20% NKX6. 1+PDX-1+S0X2-和~20%PDX-1+NKX6. 1+S0X2+。这些结果指示根据实例10生成的在 第4阶段时其为NKX6. 1+的细胞群的显著部分也是S0X2+。
[0235] 下文显示的表VI概括了在该实例中生成的细胞的S3-S4时的内胚层标志物百分 比。
[0236]表VT
[0237]在枏据Kroon分化的细朐中，在S3-S4时的内怀层标志物表汰
[0238]
[0239] *最后两天在悬浮培养物中。
[0240]实例 11
[0241]抗坏血酸的添加导致多激素数目中的显著降低和单一激素腠岛素阳件细朐数目 中的伴随增加
[0242] 测试了抗坏血酸对多能细胞分化为激素生成细胞过程中的标志物表达的作用。如 下在每一个分化步骤补充有葡萄糖并在第3、4和5阶段形成时补充有抗坏血酸的培养基中 培养细胞：
[0243] 在不同传代（第40代至第52代）时的人胚胎干细胞系HI的细胞以100, 000细 胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGEL? (1 : 30稀释）涂布的皿上的mTeSr?l培养基 和10yMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
[0244]a.第1阶段（定形内胚层（DE)_3天）：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全 PBS(无Mg或Ca) -起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGEL?涂 布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有 0? 1%无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、lXGlutaMax?、5mMD-葡萄糖、100ng/mL⑶F8 和 1yMMCX化合物（GSK3B抑制剂）。对于第二天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所 述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mM葡 萄糖、100ng/mL⑶F8和100nMMCX化合物，随后为在补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/ mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mM葡萄糖和100ng/mL⑶F8的MCDB-131培养基中的另外一 天。
[0245]b.第2阶段（原肠管-2天）：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所 述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mM D-葡萄糖和 25ng/mLFGF7。
[0246]c.第3阶段（前肠-2天）：第2阶段细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述 MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL 碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、10ng/mE激活素A、25ng/mLFGF7、0.25yMSANT-l、lyMRA、 200nMTPB(PKC活化剂）、lOOnMLDN-193189(BMP受体抑制剂）。细胞随后用MCDB-131 培 养基处理另外一天，所述MCDB-131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、 1父61扯&]\&?1'0.00158/1^碳酸氢钠、2%无脂肪酸834、101^/1^激活素4、251^/1^?6卩7、 0? 25yM