化成胰腺内胚层细胞，相比于胰腺前肠细胞，所述胰腺内胚 层细胞表达rox-l、更高水平的NKX6. 1和更低水平的S0X2。该分化通过在补充有shh抑制 剂、TGF-B抑制剂、低剂量视黄酸和维生素C的培养基中培养胰腺前肠细胞来完成；和 [0094]f)使胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌前体细胞，随后为单一激素胰腺内分泌细 胞。该分化通过在补充有shh抑制剂、低剂量视黄酸和维生素C的培养基中培养胰腺内胚 层细胞来完成。
[0095] 在一个实施例中，在逐步分化的所有阶段中的细胞在含有少于25mM葡萄糖的培 养基配方中进行培养。在一些实施例中，葡萄糖浓度在约8mM至约20mM葡萄糖的范围中。
[0096] 在一些实施例中，用于生成肠管阶段细胞和所有后续步骤的培养基配方均含有抗 坏血酸（也称为维生素C)。在一个实施例中，抗坏血酸浓度为约0.OlmM至约ImM。在一个 实施例中，抗坏血酸浓度为约0.ImM至约0. 5mM。
[0097] 本发明通过下述实例进一步举例说明，但并不受其限制。
[0098] 实例 1
[0099] 在不存在胎牛血清-BMP/TGF-B涂径调节的情况下，细朐系H1的人怀胎干细朐分 化为腠腺内分泌前体细朐导致改善的腠腺内怀层群体牛产和减小百分比的S0X2+群体
[0100] 执行该实例，以显示可生成具有极高表达水平的rox-l和NKX6. 1，同时具有低水 平表达的⑶X2和S0X2的胰腺内胚层培养物。
[0101] 人胚胎干细胞系Hl(hESCH1)的细胞在不同传代（第40代至第52代）时 进行收获，并且以100,000细胞/〇11 2的密度作为单细胞接种到獻了1^^1^(1:30稀释； BDBiosciences，NJ，USA)涂布的皿上的mTeSRl! 1 培养基（StemCellTechnologies， Vancouver，Canada)中，所述niTeSRA:1 培养基补充有 1〇yMY27632(Rock抑制剂，目录 #Y0503,SigmaAldrich，M0,USA)。接种后四十八小时，将培养物洗涤并在不完全PBS(不含 Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水）中温育大约30秒。如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
[0102] a.第1阶段（定形内胚层（DE)_3天）：细胞在下述第1阶段培养基中培养一 天：MCDB-131 培养基（目录 #10372-019,Invitrogen，CA，USA)，其补充有 0? 1%无脂肪酸 85八（目录#68700，？『〇11&拉，1厶，1^厶）、0.00128/1111碳酸氢钠（目录#53187,51 811^厶1办1。11， M0,USA)、1XGlutaMax?(目录 #35050-079,Invitrogen)、5mMD-葡萄糖（目录 #G8769， SigmaAldrich，M0,USA)，含有 100ng/mL⑶F8(R&DSystems，MN，USA)和 1yMMCX化合物 (GSK3B抑制剂，14-丙-2-烯-1-基-3, 5, 7,14,17, 23, 27-七氮杂四环[19. 3. 1. 1 ~2， 6 ~? 1 ~8,12 ~]二十七-1 (25)，2 (27)，3, 5,8 (26)，9,11，21，23-壬烯-16-酮，美国专利 申请序列号12/494,789 ;该专利申请全文以引用的方式并入本文）。细胞随后在MCDB-131 培养基中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸 氢钠、IXGlutaMax?、5mMD-葡萄糖、100ng/mL⑶F8和100nMMCX化合物。细胞随后在 MCDB-131培养基中培养一天，所述MCDB-131培养基中已添加0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/ mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mMD-葡萄糖和 100ng/mLGDF8。
[0103] b.第2阶段（原肠管-2天）：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述 MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、5mMD葡 萄糖和 25ng/mLFGF7。
[0104] c.第3阶段（前肠-2天）：第2阶段细胞在下述第3阶段培养基中培养一 天：MCDB-131培养基，其补充有1 : 200稀释的ITS-X(Invitrogen)、2.5mM葡萄糖、IX GlutaMax?、0? 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、25ng/mLFGF7、10ng/mL激活素-A(R&D systems)、0? 25yMSANT-1(shh抑制剂，SigmaAldrich)、1yM视黄酸（RA) (SigmaAldrich) 和 200nMTPB(PKC活化剂；目录 #565740 ;EMD，NJ，USA)，含有 100nMLDN-193189(BMP受体 抑制剂；目录#04-0019 ;Stemgent，CA，USA)。细胞随后在补充有lOnMLDN-193189的第3 阶段培养基中培养另外一天。
[0105] d.第4阶段（胰腺前肠前体-2天）：第3阶段细胞在MCDB-131培养基中培养两天， 所述MCDB-131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0.0015g/ 1^碳酸氢钠、2%无脂肪酸854、0.25 1^54犯'-1、5〇11]\1狀、20〇11]\11?8和5〇11]\10^-193189。
[0106] e.第5阶段（胰腺内胚层，2-7天）：第4阶段细胞在MCDB-131培养基中培养 2-7天，所述MCDB-131培养基补充有1 : 200稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、 0. 0015g/mL碳酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、0. 25yMSANT-1 和 50nMRA。
[0107] 在指定阶段时，收集样品并通过实时PCR、免疫组织化学或荧光激活细胞分选 (FACS)进行分析。
[0108] 对于FACS分析，通过在TrypLEExpress(目录号 12604，Invitrogen)中在 37°C 下温育3-5分钟，使hESC衍生的细胞释放成单细胞悬浮液。随后将细胞在染色缓冲液（含 有0? 2%无脂肪酸BSA的PBS)(目录号554657，BDBiosciences，NJ，USA)中洗涤两次。对 于细胞内抗体染色，首先使细胞在4°C下与绿色荧光活/死细胞染料（Invitrogen目录号 L23101) -起温育20分钟，以允许在分析过程中的活/死细胞区分，随后为在冷PBS中的单 次洗涤。将细胞在 250ylCytofix/Cytopern缓冲液（BDBiosciences目录号 554722)中 在4°C下固定20分钟，随后为在BDPerm/洗涤缓冲溶液（BDBiosciences目录号554723) 中的两次洗涤。将细胞重悬浮于100y1染色/封闭溶液中，所述染色/封闭溶液由补充有 2%正常血清（具有二抗的适当种类）的Perm/洗涤缓冲液组成。细胞随后在4°C下与以凭 经验预定的稀释度的一抗一起温育30分钟，随后为在Perm/洗涤缓冲液中的两次洗涤。最 后，使细胞在4°C下与适当的二抗一起温育30分钟，随后为在BDFACSCantoII上分析之 前，用Perm/洗涤缓冲液的两次洗涤。
[0109] 使用下述一抗稀释度：兔抗胰岛素（1 : 100;目录号C27C9;CellSignaling， MA，USA)、小鼠抗胰岛素（1 : 100 ;目录号ab6999,Abeam，MA，USA)、小鼠抗胰高血糖 素（1 : 1250 ;目录号G2654 ;Sigma-Aldrich)、兔抗突触小泡蛋白（1 : 100 ;目录 号八0010,0&1?)，〇八，1]5八）、兔抗嗜铬粒蛋白厶（1:800;0&1?))、小鼠抗疆父6.1(1:50 ; DSHB，UniversityofIowa，IA，USA)、小鼠抗CDX2(1 : 250 ;Invitrogen)、山羊抗 NeuroD(1 : 500 ;R&DSystems)、小鼠抗S0X2 (BD，CA，USA)、小鼠抗NKX2. 2 (DSHB)、小鼠 抗Pax6(BD，CA，USA)、小鼠抗H)X-1(BD，CA，USA)。二抗以下述稀释度使用：山羊抗小鼠 Alexa647(l: 500;Invitrogen)、山羊抗兔PE(1 : 200;Invitrogen)、驴抗山羊（1 : 800; Invitrogen)。在加入二抗后使样品在4°C下温育30分钟，随后为在Perm/洗涤缓冲液中的 最后一次洗涤。使用BDFACSDiva软件与获得的至少30, 000次事件，在BDFACSCanto II上分析细胞。
[0110] 图1A至图1G描述了根据实例1分化并在S3第2天时分析的细胞的同种型对照 (图 1A)、嗜铬粒蛋白（图 1B)、KI_67(图 1C)、NKX6. 1(图 1D)、S0X2(图 1E)、CDX2(图 1F)、 PDX-1 (图1G)的FACS直方图表达谱。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。在 第3阶段的第2天时，超过95%的细胞对于roX-1 (图1G)的表达是阳性的，并且群体中约 60%的细胞对于3(?2(图1￡)的表达是阳性的，而少于10%的细胞对于00乂2(图1?)或 NKX6. 1 (图1D)、或嗜铬粒蛋白（图1B)的表达是阳性的。如由高百分比的KI-67阳性细胞 所示，在第3阶段时显著百分比的细胞处于活跃细胞周期中（图1C)。
[0111] 图2A至图2G描述了如通过根据实例1分化且在S4的第2天时收获的细胞的FACS 染色测定的，同种型对照（图2A)、嗜铬粒蛋白（图2B)、KI-67(图2C)、NKX6. 1 (图2D)、 S0X2 (图2E)、⑶X2 (图2F)、H)X-1 (图2G)的表达谱。每种标志物的表达百分比显示于每 个直方图上。类似于第3阶段，超过95%的细胞对于H)X-1表达是阳性的（图2G)，而约 10%的细胞对于⑶X2表达是阳性的（图2F)，并且约40%的细胞对于NKX6. 1表达是阳性 的（图2D)。约45%的细胞对于S0X2表达是阳性的（图2E)，由在S3时的60 %下降。嗜 铬粒蛋白表达为大约3% (图2B)。如由高百分比的KI-67阳性细胞所示，在第4阶段时显 著百分比的细胞处于活跃细胞周期中（图2C)。
[0112] 图3A至3G描述了如通过遵循该实例中概述的分化方案在第5阶段的第2天收 获的细胞的FACS分析测定的相对表达谱。图3A:同种型对照；图3B:嗜铬粒蛋白；图3C:KI-67 ;图3D:NKX6. 1 ;图3E:S0X2 ;图3F:CDX2 ;图3G:PDX-1。每种标志物的表达百分比显 示于每个直方图上。类似于第3和4阶段，超过95%的细胞对于H)X-1表达是阳性的，而大 约10%的细胞对于⑶X2表达是阳性的，并且超过67%的细胞对于NKX6. 1表达是阳性的。 当与第3阶段相比较时，以大约50%的SOX2表达更低，但类似于其在S4时的表达。
[0113] 图4A至图4G描述了如通过遵循该实例中概述的方案在第5阶段的第7天时收获 并分析的细胞的FACS染色测量的，PDX-1 (图4G)、NKX6. 1 (图4D)、CDX2 (图4F)、S0X2 (图 4E)、Ki-67(增殖标志物；图4C)和嗜铬粒蛋白（泛内分泌标志物；图4B)的表达。类似于第 3和4阶段，>90%的细胞对于PDX-1表达是阳性的，而⑶X2表达少于10%，并且NKX6.1 表达显著增至> 70%，并且S0X2表达急剧降至约2%。
[0114] 此外，大多数表达S0X2、⑶X2和NKX6. 1的细胞对于嗜铬粒蛋白的表达是阴性的 (参见图5A至图5C)。因此，遵循该实例中概述的方案制备的S5培养物导致这样的细胞群， 其中至少50 %的细胞表达rox-l和NKX6. 1，同时对于⑶X-2、S0X2和嗜铬粒蛋白是阴性的。 表I概括了在S3-S5时的多种内胚层标志物的表达百分比。
[0115]表I
[0116]在S3 .肓至丨丨S5时的平均内怀层fe：志物表达
[0117]
[0118] *自从分化开始以后的总天数。
[0119] 图6A至图6T描述了通过遵循该实例中概述的分化方案分化的S2、S3、S4和55细 胞的实时PCR测量，并报道为超过未分化H1细胞中的表达的倍数变化的mRNA表达谱。在 第3阶段时，存在前前肠标志物例如FOXel(图6C)和NKX2. 1 (图6E)的极低表达。然而，在 第3阶段时，标志肠管的胃区的S0X2(图6M)和0SR1 (图6H)是显著上调的并且其表达在 S4-S5时下降。胰腺内胚层标志物例如PTFla(图6K)、NKX6. 1 (图6G)和H)X-1 (图61)在 培养的S5第2天时达到最大表达水平。PCR数据指示在第3阶段时，细胞在变成在S4-S5 时的H)X-1+NKX6. 1+S0X2-CDX2-之前通过H)X-1+S0X2+群体过渡。（参见图61、图6G、图 6M和图6A。）内分泌标志物（嗜铬粒蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素）的表达在S5 结束时达到最大表达水平。胰腺内分泌前体标志物NKX2. 2、NeuroD和NGN3的表达在S4-S5 时达到最大表达水平。其他谱系标志物例如ZIC1和S0X17的表达在S4-S5时保持很低。
[0120] 总之，遵循该实例中概述的方案分化的在第5阶段第2天时的细胞表达低水平的 ⑶X2和S0X2,同时维持高表达水平的NKX6. 1和roX-1。认为适时BMP抑制、在S4-S5时使 用低剂量的RA、在S1-S2时使用高葡萄糖的独特组合导致实例1中所述的细胞群。
[0121]实例 2
[0122] BMP抑制和PKC活化对在S3-S4时的S0X2表汰的作用
[0123] 执行该实例中概述的方案，以阐明BMP抑制、FGF7的添加连同PKC活化一起对在 S3-S4时的S0X2表达的作用。
[0124] 人胚胎干细胞系H1的细胞在不同传代（第40代至第52代）时进行收获，并且以 100, 000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGEL?(1 : 30稀释）涂布的皿上的补充 有10yMY27632的mTeSr?l培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分 泌谱系的细胞：
[0125]a.第1阶段（定形内胚层（DE)_3天）：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全 PBS(无Mg或Ca) -起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGEL? 涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充 有 〇? 1%无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?和 2.5mMD-葡萄糖、100ng/ mL⑶F8和1. 5yMMCX化合物（GSK3B抑制剂）。对于第2-3天，细胞随后用MCDB-131培 养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0. 1%无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IX GlutaMax?、2.5mM葡萄糖和 100ng/mLGDF8。
[0126]b.第2阶段（原肠管-3天）：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述 MCDB-131 培养基补充有 0. 1 %无脂肪酸BSA、0. 0012g/mL碳酸氢钠、IXGlutaMax?、2. 5mM D_ 葡萄糖和 50ng/mLFGF7。
[0127]c?第3阶段（前肠-3天）：在存在或不存在50ng/mLFGF7、50nM或200nM LDN-193189和/或200nMTPB的情况下，第2阶段细胞用MCDB131培养基进行处理，所述 MCDB131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/mL碳 酸氢钠、2%无脂肪酸BSA、0. 25yMSANT-l、20ng/mL激活素-A、2yMRA。使用下表II中列 出的组合，使细胞在培养基中温育三天：
[0128]表II
[0129]第3阶段处理
[0130]
[0131]d.第4阶段（胰腺前肠前体-3天）：第3阶段细胞用MCDB131培养基处理三天， 所述MCDB131 培养基补充有 1 : 200 稀释的ITS-X、2. 5mM葡萄糖、IXGlutaMax?、0. 0015g/ 11^碳酸氢钠、2%无脂肪酸85八、0.25 1^5八犯'-1、20011]\11?8、40011]\1〇^-193189、2 1^八1^5 抑制剂（SD-208,公开于MolecularPharmacology2007, 72 :152-161 中）和 100nMCYP26A 抑制剂（N-{4-[2-乙基-1-(1H-1，2,4-三唑-1-基）丁基]苯基}-1，3_苯并噻唑-2-胺， Janssen,Belgium)〇
[0132]mRNA对于上文列出的所有条件在S2-S4时进行收集，并使用实时PCR进行分析。在 S3时的对照条件指其中FGF7、AA、SANT、RA和200nMLDN-193189以上文步骤c时列出的浓 度使用的培养物。如图7A至图7G中所示的PCR数据所证实的那样，在S3时去除LDN-193189 导致内分泌标志物例如NGN3 (图7D)、和泛内分泌标志物例如嗜铬粒蛋白（参见图7C)的显 著降低。在S3时添加PKC活化剂和去除LDN-193189还降低内分泌标志物，同时增强NKX6. 1 的表达（参见图7A至图7G)。此外，添加50nMLDN-193189在诱导内分泌标志物（嗜铬粒 蛋白和NGN3)方面与200nMLDN-193189 -样有效。在S3时去除LDN-193189并且添加TPB 增强⑶X2(图7E)和白蛋白（图7F)的表达，同时抑制S0X2(图7G)的表达。此外，相比 于其中去除了LDN-193189并保留FGF7的培养物，去除FGF7和LDN-193189两者显著增强 S0X2的表达（图7G)，并减少白蛋白的表达（图7F)。这些数据证实BMP抑制、FGF活化和 PKC活化的精确调节可导致富含H)X-1和NKX6. 1，同时对于CDX2、S0X2和白蛋白很低的内 胚层域。最后，在S3-S4时的持续BMP抑制增强了促内分泌基因的表达加上S0X2表达的上 调。这突出BMP抑制必须被精确调谐，以增加胰腺内分泌基因，同时不上调S0X2表达，所述 S0