专利名称：人类酸性纤维母细胞生长因子的修饰肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酸性纤维母细胞生长因子的修饰肽，其具有较佳的稳定性。
背景技术：
酸性纤维母细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)，其是最初 由活体组织中，包含脑及海马回，所分离的单链蛋白质，能够在体外影响许多细胞种类的生 长及分化。aFGF是肝素(h印arin)-依赖性细胞分裂剂(mitogen)，且能与目前已知的四种 生长因子受体及其剪接型态牢固地结合。此蛋白质可被定位在与运动及知觉功能相关的特 定神经子集合，且可自成人大脑中分离。分离的aFGF是一种神经母细胞的细胞分裂剂，并 促使神经轴突自脊椎神经延长。人类aFGF的天然肽自人类大脑中分离，包含有IM个氨基酸。然而，天然的人类 aFGF多肽氨基末端19个氨基酸已被鉴定为与人类介白质-Klnterlukin-l，IL-1)同源。 人类aFGF与IL-I相似的多肽区位可能会造成自发性免疫反应，包括巨噬细胞的活化及造 成细胞生长停滞(G. Venkataraman et al.，P. N. A. S. ,96 :3658-63,1999)。此外，促发炎细 胞激素IL-I及FGF-I (aFGF)/FGF-2 (bFGF)因具有相同的结构支架(scaffold)，将会相互竞 争酪胺酸激酶(tyrosine kinase)区位上相同的受体结合区域(A. J. Minteret al.，J. Cell Physil. ，167 :229-37,1996)。
发明内容
本发明提供一种人类酸性纤维母细胞生长因子的修饰肽，命名为aFGF135，包含天 然的人类aFGF，其是自该天然的人类aFGF氨基末端(N-terminal)删除20个氨基酸，并增 加一个丙氨酸在缩短的人类aFGF之前。特定而言，aFGF多肽包含如SEQ ID NO :1的氨基 酸序列，其具有相当高的稳定性且较已知的aFGF多肽好。本发明进一步提供一种医药组合物，其包含本发明的aFGF多肽以及医药上可接 受的载体。本发明的其它特色和优点将在下列说明中分别提出，且可从说明中分别显见，或 可通过本发明的实施而得知，而通过所述的要素和组合将能了解并达成本发明的特色和优
点ο应了解前述的发明内容和下列实施方式仅为示例和解释，并非为本发明的限制。
前文所述以及实施方式可通过附图达到更好的说明效果。为了加强本发明的说 明，将适当的实施例的附图列举于此。要注意的是，本发明并不受限于列举于此的说明。图1是表示aFGF多肽的分子量的图谱，其由LC-MS/MS方法确认为15^1Da。图2A是西方墨点法(Western blot)的图像，其表示aFGF多肽在37°C下48小时 间的降解情形；其中道1至道3分别是培养6小时、24小时及48小时后的情形，道4为分子标志，每个条带上的数字是其所代表的分子量。图2B是西方墨点法的图像，其表示aFGF多肽在下120分钟Q小时)间的降 解情形；其中道1至道3分别是培养10分钟、60分钟及120分钟后的情形，道4为分子标 志，每个条带上的数字是其所代表的分子量。图3是西方墨点法的图像，其表示下1小时间，aFGF多肽(道的标示 为〃 E")与商业上购得具有140个氨基酸的人类aFGF(道的标示为"P")的降解比较； 其中道"M"为分子标志，在道P的商业上购得人类aFGF有降解情形，其降解处以黑色箭头 标不。图4是一图谱，其表示由液态蛋白质核磁共振光谱分析仪检测aFGF多肽的 1H-15N-HSQC 光谱。图5A表示由附图4的1H-15N-HSQC光谱所预测的aFGF多肽的3D立体结构。图5B是具有140个氨基酸的人类aFGF多肽(PDB编码1RG8)的结构图。图5C是具有127个氨基酸的人类aFGF多肽(PDB编码1DZD)的结构图。
具体实施例方式除非另外定义，本文中所用的所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员 所通常明了的相同意义。在本文中，冠词“一”是指一个或一个以上(亦即，至少一个)的该冠词的文法客 体。举例而言，“一组件”意谓一个组件或一个以上的组件。本发明提供一种人类酸性纤维母细胞生长因子的修饰肽，命名为aFGF135，包含天 然的人类aFGF，其是自该天然的人类aFGF氨基末端删除20个氨基酸，并增加一个丙氨酸在 缩短的人类aFGF之前。特定而言，aFGF多肽包含如SEQ ID NO :1的氨基酸序列。出乎预 期地，修饰的aFGF135多肽在体温下具有相当高的稳定性，且具有与其它已知的aFGF不同 的立体结构。根据本发明，具有如SEQ ID NO 1的aFGF135多肽有相当高的稳定性。与天然的人 类aFGF相比，aFGF135多肽自天然的人类aFGF氨基末端删除20个氨基酸(称为「缩短的 aFGF」)，并在已删除20个氨基酸的aFGF前增加一个丙氨酸。根据本发明，因为人类aFGF 与人类IL-I之前19个氨基酸已被鉴定为同源，为了避免通过共同的路径产生类IL-I的 反应，该20个氨基酸由天然的人类aFGF中删除。令人意外的是，aFGF多肽在生理体温下， 较目前已知的aFGF，包括天然的aFGF，有较佳的稳定度。如本发明的一具体实施例所示， aFGF135多肽在体温下(例如约37°C )培养至少48个小时后，仍保有正确的折迭而无任何 降解的产生(如图2A所示)。在本发明的另一具体实施例中，aFGF135多肽在自我加速分 解温度下(例如约培养一小时后(如图2B所示)，仍保有其完整的结构。由此可 证，aFGF135多肽相较于已知的aFGF，例如具有140个氨基酸及127个氨基酸的人类aFGF， 有较佳的稳定度。为了显示aFGF135多肽与已知的aFGF的差异性，利用核磁共振图谱计算aFGF135 多肽在三维空间中的正确结构，并将其与已知的aFGF做比较。在与Bernett MJ et al. (Proteins, 57 (3) :626-34,2004)所公开的具 有140个氨基酸的人类aFGF(蛋白质数据库(PDB)编码为1RG8)，及与Lozano RMetal. (Biochemistry, 2 ；39 (17) =4982-93,2000)所公开的具有 127 个氨基酸的人类 aFGF (蛋 白质数据库(PDB)编码为1DZD)相比下，aFGF135多肽具有不同的结构特征，包括碳基末 端及氨基末端的裸露以及左下角一个显著的结合环(loop)，如图5A所示。可推测因为 aFGF135多肽具有修饰的序列(包含删除20个氨基酸及增加一个丙氨酸)，造成与其它已 知重组或天然aFGF相比有更稳定的结构。在本发明的一个具体实施例中，如图3所示，针 对稳定性进行与降解有关的比较，商业上购得的重组aFGF(Promega公司)在培养一小 时后在西方墨点试验中产生出降解的条带，而aFGF135则相对地稳定。本发明进一步提供一种医药组合物，其包含本发明的aFGF多肽以及医药上可接 受的载体。本发明的医药组合物可由传统上公知的方法与一种或一种以上的医药上可接受 的载体制备。术语“医药上可接受的载体”在本文中意指包含任何标准的医药上可接受的 载体。此种载体包含，但不限于食盐水、缓冲食盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇或上述的组合 物。本发明的医药组合物可以选择任何适合的形式给予。较佳为直接涂覆在手术部 位。本发明进一步由下列实施例说明，但其目的仅作为例示而非限制。实施例1 :aFGF135多肽的克降(cloning)人类全长aFGF多肽是购自于Clontech Laboratories, Inc.的快速克隆cDNA的 产品。在建构前，设计两个专一性引物序列如下SEQ ID NO 2 5，-ACTG 二 AATTCATGGCTGAAGGGGAA ATCA-3，SEQ ID NO 3 5，-AAGA二 AGCTTCAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3，在SEQ ID NO 2中具有一个EcoRI限制酶切割位置(其标示为^ )，而在SEQ ID NO :3中具有一个Hind III限制酶切割位置(其标示为τ)。将全长序列的产品利用上述引 物进行聚合酶连锁反应(PCR)可得到485个碱基对的PCR产物。将cDNA产物以EcoRI及 Hind III限制酶切割之后，其切割片段插入具有相同切割位的pUC18载体中，经DNA定序分 析后，得到含正确序列的重组质体pUC-haFGF。根据pUC-haFGF的模版，两段专一性引物设计如下SEQ ID NO 4 5，-GGCA 二 TATGGCTAATTACAAGAAGCCC-3，SEQ ID NO 5 5，-AAGA二 GATCTCTTTAATCAGAAGAGACTGGCAGG-3，在SEQ ID NO 4中具有一个Ned I限制酶切割位置(其标示为^ )，而在SEQ ID NO 5中具有一个Bgl II限制酶切割位置(其标示为，)。由SEQ IDNO 4及SEQ ID NO 5 放大的cDNA长度较全长缩短57个碱基对。aFGF135多肽仅有135个氨基酸，并保留了 aFGF 主要功能区域。此外，在氨基末端的第二个氨基酸-甘氨酸(G)被变更为丙氨酸(A)。如 SEQ ID NO 1 所示ANYKKH(LLY。自 pUC-haFGF 放大的 cDNA 片段与 Ned I 及 BglII 限制酶反应后，另外利用Nde I与BamH I限制酶作用一表达空载体pET3c (购自Novagen)，最后将 cDNA切割片段插入具有相同切割位的pET3c载体中。pET3c-haFGF因此而被建构。实施例2 表现并纯化aFGF135多肽在放大pET3c-haFGF 之后，利用感受态细胞(competentcell)BL21 (DE3) (Novagen，德国)将载体转化为DNA。在加入最终浓度为ImM IPTG(异丙基β-D-I-硫代 半乳糖苷)培养前，培养抗胺节青霉素(ampicillin)的大肠杆菌(E. coli)落并在LB培养 液中放大至OD6tltl到达0.3。在培养16个小时(士两个小时)后，搜集细菌并以27，OOOxg 离心以去除上清液。搜集到的细菌以PBS冲洗两次，接着以高压均质机(Niro Soavi型号 NS2006L,Daken Stainless Products Ltd.，UK)打破。打破的样本以 0. 22 μ m 孔径的筛过 滤并用于蛋白质的纯化。人类aFGF135多肽以色层分析法分离，如以下的步骤(1)阳离子交换层析法 (CMFF 管柱，RM197，购自 GE Healthcare Bio-Sciences USA Corp.) ； (2)亲和层析法，其系 对肝素(h印arin)专一 Ofeparin FF管柱，RM 244，购自 GE Healthcare Bio-Sciences USA Corp.) ； (3)大小排阻层析法(Superdex 75pre_grade 管柱，R1C45，购自 GE Healthcare Bio-Sciences USA Corp.)。上述管柱的缓冲液为磷酸盐溶液(Na2P04 NaHP04 = 51 49， 0. 1% EDTA-Na, ρΗ6· 8-7. 2)。最后所得的产物即为本发明的aFGF135多肽。aFGF135多肽 的分子量由LC-MSMS方法鉴定为15^1Da。实施例3 :aFGF135多肽之稳定件试验(1)西方墨点法纯化的多肽加入4-20或10-20%的梯度凝胶(gradient gel)中进行聚丙烯酰 胺胶体电泳，接着以电泳转印机(Polyblot Transfer System, ModelSBD-IOOO ；American Bionetics, Emeryville, CA)转印至硝酸纤维膜上(0. 05Am Jchleicher紹chuell，Inc.， Keene，NH)。为了检测aFGF多肽的稳定性，制备Laemmli缓冲液(2. 4ml IM Tris pH 6.8， 0. 8g SDS-基液，100%甘油，0.01%溴酚蓝，0.02% Iml β -巯乙醇(电泳等级)，以及 2. 8ml水)含有或不含8M尿素(用于打开潜在之聚结体)作为积层凝胶(stacking gel) 缓冲液，其中包含0. 0625M三羟甲基氨基甲烷CTris-base)，l% SDS基液以及15mM 二硫苏 糖醇(dithiothreitol)。样本置于室温1小时后，再置于4°C隔夜。进行聚丙烯酰胺胶体 电泳前将样本煮沸。在以含有3%奶粉的TBS转移及阻断非专一性蛋白质结合位置后，硝酸纤维膜与 以冲洗缓冲液(IOmM Tris-HCl,pH 8. 0,0. 15M NaCl,0. 05% Tween-20)适当稀释的不同抗 体(aFGF抗体以1 500稀释，购自R&D System，he.)在4°C下反应隔夜。使用适当的二 级抗体来与抗原-抗体组合物反应使其显影，并将其培养在I^rotoBlot Western Blot AP 系统中(Promega, Madison, WI)。(2)降解测试完整的aFGF多肽分别培养于37°C及下，其中为自我加速分解温度。接 着，将样本进行西方墨点法分析。培养于37°C下的样本的结果如图2A所示，其中道1至道 3分别为培养6小时、M小时及48小时后的结果，道4为生物标志且每个条带上的数字是其 所代表的分子量。aFGF135多肽在下培养120分钟O小时)间的结果如图2B所示； 其中道1至道3分别为培养10分钟、60分钟及120分钟的结果，道4为生物标志且每个条带上的数字是其所代表的分子量。如图2A所示，aFGF135多肽在体温下(约37°C )能保持完整的结构至少48小时。 这表示aFGF135多肽提供较长时间的神经保护效果，以及较佳的稳定性。如图2B所示，aFGF135多肽在下能保持完整的结构至少1小时。当培养于 下2小时后，aFGF135多肽会完全降解而不会转化为其它结构，该结构可能造成具有不
可预期的副作用。因此，aFGF多肽提供安全的储存及运输。在相同的实验条件下，同时使用商业上购得的重组aFGF(" Promega aFGF"，购 自Promega Corporation)进行稳定性测试。如图3所示，Promega aFGF条带中具有黑色 箭头所指的第二条带；相反地，aFGF135多肽则维持原来结构而无任何降解。同时，当加入 样本于微盘中时，Promega aFGF产生白色沉淀物而aFGF135多肽则保持澄清。此结果证明 aFGF135多肽比起商业上的aFGF有较佳的稳定性。实施例4 =1H-mN-核磁共振结构特征核磁共振光谱是最近用来确定生物上大分子，如蛋白质或核酸，在原子分辨率下 的结构的常用工具。因此委托高磁场核磁共振核心(中央研究院，台湾)针对aFGF135多 肽鉴定其结构特征。简而言之，光谱在下以Bruker AVANCE 600纪录。碳基末端及氨基末端的 化学位移以TALOS软件得到骨架扭转角(torsion angles) 0骨架的序列特异性共振归属 (sequence-specific resonance assignments) fflil HNCO> HN(CA) CO> HACNCB> CBCA(CO) NH、HNCA 及 HN(CO) CA 试验，侧链归属(side-chain assignments)通过 15N-T0CSY_HSQC 及 13C-N0ESY-HSQC 合并 15N-N0ESY_HSQC 及 13C-N0ESY_HSQC 而完成。骨架图如图 4 所示。为了结构计算，利用TALOS软件计算出平面二面角(dihedral angle)的讯息， 15N-NOESY-HSQC及13C_N0ESY_HSQC决定出距离限制，配合D20交换的实验结果列出沈个可 能的氢键。aFGF135多肽的3D结构构筑由CYANA软件计算出如图5A所示。aFGF135多肽 的核磁共振数据及结构计算统计皆详列于表一。表一 aFGF135多肽的核磁共振数据及结构计算统计
权利要求
1.一种人类酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)的修饰肽，包含天然的人类aFGF，其特征 是该天然的人类aFGF氨基末端删除20个氨基酸，并增加一个丙氨酸在缩短的该人类aFGF> . 、r -
2.如权利要求1所述的修饰肽，其特征是具有如SEQID NO :1所示的氨基酸序列。
3.如权利要求1所述的修饰肽，其特征是具有图5A的三维立体结构。
4.如权利要求1所述的修饰肽，其特征是具有相当高的稳定性。
5.一种医药组合物，其特征是包含如权利要求1所述的修饰肽以及医药上可接受的载体。
6.一种医药组合物，其特征是包含如权利要求2所述的修饰肽以及医药上可接受的载体。
7.—种医药组合物，其特征是包含如权利要求3所述的修饰肽以及医药上可接受的载体。
8.—种医药组合物，其特征是包含如权利要求4所述的修饰肽以及医药上可接受的载体。
全文摘要
本发明提供一种人类酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)的修饰肽，其包含天然的人类aFGF，其是自天然的人类aFGF氨基末端删除20个氨基酸，并增加一个丙氨酸在缩短的人类aFGF之前。
文档编号C07K14/50GK102086227SQ200910252409
公开日2011年6月8日 申请日期2009年12月4日 优先权日2009年12月4日
发明者郑宏志, 郭玟君 申请人:雅祥生技医药股份有限公司