专利名称：编码纤维母细胞生长因子的质粒用于治疗与高胆固醇血症或糖尿病相关的血管生成缺陷的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码纤维母细胞生长因子质粒的应用，其作为预防和治疗与高胆固醇血症(hyperchelesterolemia)或糖尿病(diabetes)相关的心肌或骨骼血管生成缺陷的治疗药物。本发明也涉及用于患有高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者，增强其心肌和骨骼的缺血组织的侧支血管和小动脉生成的方法。本发明进一步涉及促进缺血心肌或骨骼组织中的侧支血管生成的方法，该方法不诱导VEGF-A因子表达，也不引起被治疗肌肉的水肿。
背景技术：
血管形成一个起于并止于心脏的闭合的供血系统，包括三类主要的血管种类，即动脉、毛细血管和静脉。随着心脏搏动，血液由心室被压入大动脉。大动脉分支成为中等大小的动脉，这些动脉分支成为更小的动脉，将血液输送到身体各部分。动脉一次又一次分支，直至达到最小的分支，即小动脉。当小动脉进入组织中，它们分支成为微观的血管，称为毛细血管，其位置在组织细胞附近。毛细血管壁很薄。氧气和营养物质离开毛细血管里的血液，进入组织细胞，二氧化碳和其他废物离开细胞，进入毛细血管中的血液。毛细血管在离开组织之前汇聚形成较小的静脉，称为小静脉。小静脉汇聚逐渐形成更大的静脉，最后回流入将血液返回心脏的大静脉。
除毛细血管外，所有血管的管壁都由3层组成，其环绕着管腔。内衬管腔的最内侧的一层称为内膜，主要由内皮细胞组成。中间的一层，即中膜，主要由环形排列的平滑肌细胞组成。血管壁最外侧的一层，即外膜主要由弹性纤维和胶原纤维构成，它们保护血管并使血管锚着于周围结构。外膜有神经纤维穿过，而且较大的动脉和静脉中还有微小的血管系统穿过。
小动脉是最小的动脉，其管腔直径小于50um。小动脉的管壁由内膜和环绕内膜的含有散在的平滑肌纤维的中膜组成。小动脉调节由动脉到毛细血管的血液流量。在小动脉壁进行血管收缩过程中，流入毛细血管的血流受限，由该小动脉供血的组织可能暂时被绕过。小动脉壁进行血管舒张时，流入毛细血管的血流显著增加。
相反，毛细血管管壁极薄，只包含一层内皮细胞，只具有内膜。它们形成了广泛的网络，遍及全身几乎所有的组织，几乎靠近几乎全身每一个细胞。毛细血管的平均管腔直径是0.01mm(10μm)，大小仅够红细胞以单列滑过。极薄的血管壁对于毛细血管的作用非常适合，即与身体细胞交换营养物质，氧气以及废物。
侧支血管对于器官的供氧起着重要作用，特别是在脉管系统正常是，疾病导致氧气供应不足时。侧支血管可以作为预存的血管，正常情况下血流很少或没有。正常血管的急性闭塞(如，大动脉血栓)可以引起血管床内压力重新分配，因而使侧支血管中产生血流。侧支血管在冠脉和骨骼肌(如，人类腿部)的循环中尤其重要。在心脏中，侧支血管可以协助给心外膜动脉狭窄或闭塞导致的缺血区域提供血流。侧支血流是限制梗死面积的重要机制。侧支血管的形成是治疗性的血管生成中触发的。
血管生成是复杂的过程，涉及内皮细胞增生、基底膜分解、迁移通过周围基质，以及排列、分化为管状结构以形成血管壁，从而形成新的毛细血管网。
动脉生成是指长出侧支小动脉，这也被认为是恢复血流灌注的最有效过程，因为与毛细血管网相比这些血管容量更高(Carmeliet et al.，Nat.Med.，2000；6389-395；Van Royen et al.，Cardiovasc.Res.，2001；49543-553)。在作用效果方面，可以认为小动脉是成熟的健全的功能性血管，因为它具有内膜和中膜，即由一层平滑肌细胞支撑一层内皮细胞。小动脉形成是长期有效的新生血管化的优选形式。
与血管内皮功能异常有关的病理状态包括高胆固醇血症，该疾病的特征有异常血管形成、组织灌注调节受损、血流空间分配异常以及微血管功能异常。而且，血管生长的动力学以及由此产生的血管的性质也与正常组织中不同。这些改变可能是血管内皮受损的结果，表现为信号转导的减少；L精氨酸可利用性减少；eNOS表达减少；来源于吞噬细胞其他炎症细胞的superoxyde阴离子使得NO灭活增加；某些血管收缩因子如内皮缩血管肽的释放；以及平滑肌血管反应。在患有高胆固醇血症的受试者中，动脉壁的毛细血管密度及分布发生了明显的变化。最后，它们表现为密集的外膜微血管丛，具有显著的不规则性。据信这是由于可以引起血管生成反应增强或减弱的不同刺激所导致的。人类的高胆固醇血症引起血管内皮功能异常，最终导致主要动脉的进行性狭窄。在静息时和应激时的冠状动脉血流不平衡产生隐匿的肌肉功能不良，导致疼痛和收缩力低。通常在静息时血供正常，但当发生应激时，需求增加而由于动脉阻塞性病变导致血供不能增加。因此为了达到模仿该人类的病理过程的目的，不仅要在例如主要冠状动脉中建立狭窄，而且使用应激试验来显示应激时由此狭窄产生的不平衡。也已知I型和II型糖尿病患者中血管功能的特征是内皮依赖的舒张功能受损。糖尿病的特征是提早发生微血管和大血管疾病(Kannel et al.，Diabetes Care，1979，2412035-2038)。因此，患有外周动脉疾病(PAD)，外周动脉阻塞性疾病(PAOD)或冠心病(CAD)的患者中，高胆固醇血症、糖尿病和高血压所致的如此严重的内皮损伤和异常是否能使用治疗性的血管生成来挽救尚无定论。
已有提议使用给予某些血管生成因子，如VEGF，aFGF及bFGF，HIF-1α/VP16和TGF-3来促进侧支血管，即治疗性的血管生成来治疗缺血性心血管疾病和外周缺血性疾病。但是，对多种细胞类型的潜在多向效应可能使其中某些化合物的治疗可用性受到限制。例如，VEGF-A是最强的备选血管生成因子之一。但是VEGF-A曾有引起水肿和产生无序、曲折而易渗漏的血管，这种血管与肿瘤中发现的血管很类似(Lee et al.，Circulation2000，102898-901；Springer et al.，Mol Cell，1998，2549-559).。
治疗性的血管生成有两种不同策略。蛋白治疗是一种可能的选择，涉及将生长因子直接递送到缺血组织。血管生成基因治疗是另外一种可能的选择，目的是通过将核酸转移到体细胞，促进侧支血管生成并纠正灌注缺损以及相关的缺血(8-10)。
动物试验显示，许多生长因子都有局部的血管生成效果，包括例如，重组人VEGF，重组PDGF或重组FGF。但是，重组的蛋白递送以及全身给予大剂量的重组蛋白会导致多种其他不良副反应。而且，所需的重组蛋白的量很重要。如果使用了过多的蛋白，会导致形成无序的血管床和杂乱的血管生成(promiscuous angiogenesis)。
已研究通过给予核酸的治疗性血管生成，所述核酸可以以裸露形式和经由脂质体和病毒载体表达血管生成蛋白。用病毒载体传递编码血管生成的序列允许高效递送，但具有许多与使用病毒载体相关的缺点，如免疫反应的产生以及整合和播散的可能性。例如，1999年9月，宾夕法尼亚大学的Jesse Gelsinger接受了表达正确形式的人的乌氨酸转氨甲酰酶的、E1和E4缺失的重组腺病毒的肝内动脉输注后死亡，此后腺病毒基因治疗方法遭到置疑。病理分析显示死亡的正式原因是由于全身应用腺病毒引发的全身性炎症反应，导致了成人呼吸窘迫综合症，继发出现多器官功能衰竭。最近，一项意在治疗患有严重联合免疫缺陷病(SCID)的儿童的试验报道了两例由于使用逆转录病毒作为载体而导致白血病的病例。
包含编码血管生成多肽的DNA的脂质体和裸露DNA也有一个主要缺点，即转移效率较病毒低，难以达到要取得治疗效果所必需的蛋白水平。
关于裸DNA策略，有结果出出人意料地显示给患有终末期外周动脉阻塞性疾病(PAOD)的患者肌内注射NV1FGF，即编码酸性纤维母细胞生长因子或1型纤维母细胞生长因子(FGF-1)的质粒，可以满足安全方面的要求。Camerota等人(J Vasc.Surg.，2002，35，5930-936)描述了51名不可重建的终末期PAD患者，他们都伴有静息时疼痛或组织坏死，对缺血的前腿或后腿经肌内注射单次或重复给予剂量渐增的NV1FGF。随后评价各种参数，如经皮氧分压、踝及趾的肱指数、疼痛评分和溃疡的愈合情况。观察发现给予NV1FGF后，肱指数显著增加，疼痛减轻，溃疡面积缩小而且灌注改善。
也证实了下肢缺血患者中的VEGF基因转移诱导的血管生成。在患不可治愈的缺血性溃疡和/或由于外周动脉疾病导致静息时疼痛的患者中，编码VEGF-165同种型的裸露质粒DNA被给予缺血的肌肉。治疗8周后血管造影可以观察到有新生成的侧支血管和灌注改善，也可观察到毛细血管。但是，在治疗后5至6周时也可以观察到血清VEGF水平有显著的提高(Isner etal.，Lancet，1996；348370-4)。这种血清VEGF水平的提高可以引起紊乱的有害血管生成，产生严重不良副反应如水肿(26)。
Vincent等人(Circulation，2000；102(18)2225-61)报道编码低氧诱导的因子Ia(HIF-1a)转录因子的裸露DNA质粒的给药与后腿血压比值、血管生成评分、局部血流和毛细血管密度的显著增加有关。但是，也有报道HIF-1a活化了内源性VEFG基因的表达，提示VEGF途径依赖的血管生成的增强以及体内的数个靶点。
Taniyama等人(Gene Therapy，2001，8181-189)进一步报告了在大鼠和兔的缺血性后肢模型中使用肌内注射编码了人肝细胞生长因子(HGF)的DNA质粒的方式的治疗性血管生成。用血管造影鉴定侧支血管的增加，用碱性磷酸酶做内皮细胞的标记物显示毛细血管密度。HGF最初曾作为肝细胞的促细胞分裂剂，现在已发现它是某一类细胞的促细胞分裂剂，包括黑色素细胞、肾小管细胞、角化细胞以及某些内皮细胞和上皮起源的细胞(Matsumoto et al.，BBRC，1991，17645-51)。HGF也能激活内皮细胞的生长而不伴随血管平滑肌细胞的复制(Nakamura et al.，Hypertension，1996；28409-413；Hayashi et al.，BBRC，1996；220539-545)。最后，还发现HGF也可以起到“分散因子(scatter factor)”的作用，具有促进上皮细胞和血管内皮细胞分离的活性(Giordano et al.，PNAS，1993，90649-653)。因此，公知HGF参与了肿瘤的形成。
相反，经过证实，给予编码酸性纤维母细胞生长因子(aFGF或FGF-1)的质粒不会增加FGF-1的血清水平，因此显示出在安全性方面，使用这种表达人FGF-1的质粒具有显著的优势，因为没有无序血管生成或不良副反应。没有循环的FGF-1，是优于其他血管生成因子例如，VEGF或FGF-2的一个显著优势，据称后者都有渗漏入循环中导致远端水肿(Baumgartner etal.，Circulation，1998，971114-23)。
纤维母细胞生长因子(FGF)家族包括至少23种结构上相关的蛋白(FGF1-23)，其中最为人所熟悉的是FGF-1，FGF-2，FGF-4，FGF-7和FGF-9。该家族的成员可以刺激来源于中胚层和神经外胚层的大多数细胞进行晚期有丝分裂，并影响其他生物学过程，包括血管生成、神经轴突延伸、成骨细胞生长、神经元存活以及成肌细胞分化。一般而言，FGF对肝素具有高亲和性。在它们的术语命名尚未确定之前，某些FGF被称为肝素结合性生长因子-1，-2等等，而且有许多是纤维母细胞的促细胞分裂剂，但并非全部如此。FGF家族的成员在核心序列中有约25-55％的氨基酸序列同一性，而某些FGF之外有明显延伸，可能在C端、N端或两者均有。这种结构同源性提示，编码已知FGF的不同基因可能都来源于相同的祖基因。
除FGF家族的已知的23种成员之外，因为同一基因产生几种FGF分子形式而导致了另外的复杂性。例如，aFGF(FGF-1)的初级翻译产物包含155个残基。但是，天然来源(如牛脑)的FGF-1最长的形式包含154个残基。这一154个残基形式的FGF-1较155个残基的形式缺失了NH2端蛋氨酸，而具有乙酰化氨基末端。体内或纯化过程中的蛋白水解过程会产生FGF-1的较小活性形式，其中缺失了氨基末端的15个(des 1-15)或21个(des 1-21)氨基酸。按照本文定义，FGF-1是指154个残基的FGF-1及它的稍短的生物学活性形式，如上文所述缺失氨基末端的15个(des 1-15)或21个(des 1-21)氨基酸的形式。过去FGF-1的154个残基的形式称为β内皮细胞生长因子(3-ECGF)，des 1-15的形式称为aFGF或FGF-1，des 1-21的形式称为alpha-ECGF。在这一组生长因子的术语尚未标准化之前，曾将这些蛋白冠以某些其他命名，包括眼源性生长因子和肝素结合性生长因子1。bFGF(FGF-2)的类似形式也有描述。除裂解的形式之外，还描述了bFGF的扩展形式，这是由于在ATG翻译起始密码子上游的几个不同的GTG密码子开始翻译，产生了155个残基的bFGF形式。所有这些FGF的不同形式都包含结构同源的核心区，这是FGF家族的特征。各种FGF分子中有许多已被分离出来，用于各种心肌缺血的动物模型，产生了不同的而且通常相反的结果。
体内试验提示了FGF-1的血管生成活性(Comerota et al.，J.Vasc.Surg.，2002，35，5930-936)。肌内注射表达FGF-1的质粒，显示灌注改善，依据为踝的肱指数升高、疼痛缓解和经皮氧分压升高。
申请者吃惊地发现，肌内注射表达FGF-1的质粒不会在血管内皮细胞中诱导VEGF，因此可以作为非常安全的血管生成疗法，而与其他血管生成因子包括其他FGF因子、VEGF、HIF-1a/VP16和HGF不同。
大多数治疗性血管生成研究都在肢体缺血的动物模型中进行确证，用正常的健康动物进行试验，而很少研究它们对于高胆固醇血症或糖尿病背景中的血管生成缺陷的逆转能力，在前述情况下内皮功能显著受损。
在这一点上，在接受了股动脉切除的高胆固醇血症的兔模型进行试验时，已知的治疗性血管生成还未被令人信服地证实，因为给予VEGF后观察到侧支血管形成受损和毛细血管密度被部分逆转(26)。此外，在糖尿病模型中检测时，治疗性血管生成也未被令人信服地证实，如Roguin A.等人(Cardiovascular Diabetology 2003，218)发现，在糖尿病性缺血的小鼠中，使用表达VEGF的质粒，不能提高血流，也不能促进侧支生成。
相反，申请者惊讶地发现，在患有高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者中，将表达人类FGF-1的质粒经肌内注入缺血的心肌或骨骼肌肌内，能够有效逆转高胆固醇血症或糖尿病相关的侧支血管缺陷，并促进成熟的血管如小动脉的形成。
此外，申请者发现与类似的血管生成因子不同的是，表达FGF-1的质粒肌内注射不会引起所治疗的骨骼肌或心肌中的水肿，因此在恶化的情况如高胆固醇血症或糖尿病的背景中可以使用足以挽救缺血肌肉的血管生成缺陷的剂量。
发明内容
本发明涉及治疗与高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼血管生成缺陷的方法，包括将药物组合物给予受试者，所述药物组合物中含有载有编码某种纤维母细胞生长因子的基因的质粒，其剂量可以促进内皮功能异常和血管生成缺陷的逆转。
本发明也涉及治疗与高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼血管生成异常或缺陷的方法，包括使用有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒，其中不会在心肌或骨骼肌中诱导VEGF-A因子表达。
本发明进一步涉及治疗与高胆固醇血症或糖尿病相关的血管内皮功能不良的方法，其通过将一定量编码纤维母细胞生长因子的质粒给予骨骼肌或心肌内来进行，其中所述的量足以有效逆转心肌或骨骼肌的血管生成缺陷，其中不会在这些肌肉中诱导VEGF-A因子表达，也不会发生水肿。
本发明还有一个目的，即提供刺激和/或促进在高胆固醇血症或糖尿病的背景中缺血肌肉中的缺血心肌或骨骼肌组织中成熟侧支血管形成的方法，包括在上述受试者的上述组织中注射有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒，其中不会诱导VEGF-A因子表达，并且/或者不会发生水肿。
本发明的另一个目的是提供治疗患有高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者中的缺血疾病诸如PAD，PAOD或CAD的方法，其中不会诱导VEGF因子的表达，也不会引起水肿的形成。
本发明另一个目的是提供一种方法，用于促进缺血组织中侧支血管和小动脉的形成，其中内皮功能受损。
本发明另一个目的是一种逆转高胆固醇血症或糖尿病引发的血管生成缺陷的方法，其用于需要此类治疗的患有高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者中，且不会诱导VEGF因子的表达。
本发明另一个目的是提供一种方法，用于促进血管生成的VEGF非依赖途径。
本发明的另一个目的是提供一种促进血管生成的方法，前提是VEGF在所治疗细胞中不会被上调。
对于逆转高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼肌的血管生成缺陷，心肌内或肌肉内注射FGF表达的质粒是优选的方式。本发明的实践中优选的纤维母细胞生长因子是FGF-1，而最优选的是人类全长FGF-1。
通过结合以下附图对本发明的优选实施方式进行详细描述以便达到公开的目的，本发明的其他及进一步目的、特性及优点将变得更加清楚。
附图的简单描述
图1为本试验的设计示意图。
图2(A)-(C)代表经HES染色后，仓鼠肌肉(股薄肌和内收肌)的横切面(放大X100倍)；图2(A)为非缺血(对侧)肌肉的横切面；图2(B)和(C)是缺血肌肉的横切面；图2(B)中的虚线表示轻度坏死的存在；图2(C)中的箭头指示中央成核现象(centronucleation)。
图3(A)-(C)列出典型的血管造影片，其是在LC(A)；HC/21(B)；和HC/28(C)仓鼠的非缺血(左)和缺血(右)后肢中记录的。
图3(D)显示后肢缺血后对侧支形成量化得出相应的血管造影评分图4(A)-(D)显示用平滑肌α肌动蛋白(SMA)免疫化学法标记的成熟血管的典型横切面(放大X100倍)，所述血管来自诱导缺血后21天(A和B)或28天(C和D)取下的非缺血(A和C)及缺血(B和D)肌肉(股薄肌和内收肌)。
图4(E)和(F)图示肌肉面积和＜50μm的SMA阳性小动脉的定量。空白区非缺血的后肢；阴影线区缺血后肢。NS不显著；**相对于任何组p＜0.01。
图5(A)和(B)显示用盐水(A)或NV1FGF(B)处理的仓鼠的非缺血和缺血下肢的典型的血管造影片。
图5(C)定量显示下肢缺血后的侧支形成，其通过血管造影评分观察。
图6(A)和(B)显示用盐水(A)或NV1FGF(B)处理的仓鼠的缺血肌肉(股薄肌和内收肌)的典型的横切面(放大X100倍)，显示用平滑肌α肌动蛋白(SMA)免疫化学法标记的成熟血管。
图6(C)和(D)图示肌肉区域和＜50μm的SMA阳性小动脉的定量。空白条非缺血的下肢；阴影线条缺血下肢。NS不显著；*p＜0.01；**盐水组相对于NV1FGF组p＜0.01。
图7为股后部肌肉(股薄肌和内收肌)的典型照片(放大X100倍)，其中用抗-FGF-1多克隆抗体进行免疫化学染色，所述肌肉取自非缺血(对侧)经注射的下肢和注射了盐水(B)或NV1FGF(C)的缺血下肢。箭头指示免疫反应性纤维，其根据免疫复合物被染为褐色可以识别。
图8(A)-(C)为胫前肌(Tibialis Cranialis muscles)的组织学切片，用鼠VEGF抗体染色。(A)注射NaCl的肌肉的切片，肌纤维阳性为马赛克(mosaic)表现。(B)注射pCOR-CMV-空白的肌肉切片，表现相似。(C)用mVEGF-A多肽吸收抗mVEGF-A抗体后，注射NaCl的肌肉切片。
图8(D)和(E)为注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的胫前肌的连续组织切片，用mVEGF-A(D)或FGF-1(E)的抗体染色。
图9A显示模板，表示患高胆固醇血症的兔心脏中的13处注射点的位置图9B为用HES染色的取自患高胆固醇血症的Watanabe兔的左旋冠状动脉切片的显微照片，放大倍数为X100倍。A外膜；M中膜；箭头尖端指内膜；箭头指动脉粥样硬化斑块；图10显示人类静息时的心电图，其根据人类应激试验中ST段改变命名(出自Braurwald et al.心脏病学，第5版，p159)。图10的左侧显示人类静息时的ECG，右侧由上到下为程度逐渐加重的ST段改变，根据该段的倾斜程度分别为上斜型、水平型和下斜型。最下方显示的抬高为最严重的情况。
图11A显示兔在多巴酚丁胺应激试验中的ECG。
图11B显示I导联的放大图。QRS复合波为一个大的垂直的峰，其后清晰可见ST段水平型压低。
图12显示高剂量的多巴酚丁胺时的ECG评分。
图13A显示兔静息时的典型12导联ECG。
图13B显示同一只兔在最大的应激下的严重缺血状态。
图142D超声心动描计术的命名法示意图。
图15显示在注射NV1FGF后3天，健康兔心的心肌显微镜下病灶以及相关的FGF-1表达。HES染色显示心肌变性和坏死以及活动的慢性炎性反应(A)和相关FGF-1表达(箭头，B)。背景(*)对应于二级抗体(抗兔)与内源IgG偶联。放大倍数x100。
图16显示应激试验中，将兔用空质粒(灰色区)或NV1-FGF质粒(阴影区)处理，最大ECG评分的变化情况。
图17显示16个正常部分(灰色)和14个异常部分(黑色)的定量。正常/异常的判定为通过肉眼观察评价。
图18显示ECG最大评分与Echo最大评分比较图。回归曲线用黑色表示，两个主要区域(异常ECG和异常echo，正常ECG和正常echo)用灰色覆盖。
图19显示治疗后超声心动图评分随时间的演变。NV1-FGF处理的动物用阴影表示，空质粒处理的动物用灰色表示。*表示组间有显著性差异(p＜0.05)图20表示制备心脏横切面样本的标准步骤，该样本用于按照3个短轴切片(axis slice)例如心尖部、中部和心底部节段，对心脏的不同区段进行组织学分析。
图21显示对疤痕及远离疤痕的存活心肌中的血管密度的定量分析。
发明的详细描述本发明提供了一种方法，其用于治疗或修复高胆固醇血症或糖尿病背景相关的心肌或骨骼的血管缺陷，其中内皮功能受损或不良。
在直接肌内给药以促进心肌或骨骼肌中血管网形成增加后，本方法和化合物对于逆转高胆固醇血症或糖尿病相关的内皮功能异常特别有用。本发明包括使用编码具有生物活性的纤维母细胞生长因子的质粒及其可药用的盐类和衍生物。
本发明也提供一种方法，其用于促进需要此类治疗的哺乳动物受试者中缺血的心肌或骨骼肌组织中成熟侧支血管的生成，包括在所述受试者的所述组织中注射有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒，其中不会在所述受试者中诱导VEGF-A产生。具体地说，使用表达FGF的质粒可以诱导缺血心肌和骨骼肌组织中的侧支血管形成以及小动脉形成，而不会诱导VEGF-A因子的表达。根据本发明，表达FGF的质粒不会引起诸如水肿之类的副作用。
本发明也提供了一种方法，其可以逆转高胆固醇血症或糖尿病引起的血管生成缺陷，而不会诱导VEGF-A因子表达和/或引起水肿形成，包括在上述患者在心肌或骨骼肌组织中注射有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒，以促进侧支血管和小动脉的形成。
本发明也提供了一种方法，其用来增强再血管化，该方法通过促进高胆固醇血症或糖尿病背景中的哺乳动物受试者的缺血组织中的侧支血管和小动脉来进行，包括再上述受试者的上述组织中注射有效量的表达FGF的质粒，以逆转血管生成缺陷。上述质粒的递送和表达意外地导致了整个缺血肌肉的血液灌注的显著的提高。
术语“受试者”包括哺乳动物，如狗、猫、马、牛、猪、大鼠、小鼠、猿和人类，但不止于此。
术语“生物学活性序列”指一种核苷酸序列，其编码天然存在的多肽或它的任何有生物学活性的类似物或片段。自然界中存在不同的形式，编码具有相同生物学功能的多肽的结构基因序列有各种变异。生物学活性序列类似物包括天然或非天然存在的类似物，其具有一个或多个氨基酸取代、删除、增加或置换。所有这些等位基因变体的修饰及其类似物使得保持了一种或几种天然的活性特征的衍生物包含在本发明范围内。
因此编码FGF的质粒包括编码所需FGF蛋白的核苷酸序列。这些分子可以是cDNA、染色体组DNA、合成DNA或它们的杂和体或RNA分子，如mRNA。优选，所述质粒包含编码FGF-1的核苷酸序列，因此包括编码154个残基的FGF-1酸性生长因子的核苷酸序列，如US专利4,686,113所述。
DNA分子基因表达所必须的调节元件可以包含启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷酸信号。此外，基因表达还经常需要增强子。这些元件都必须与编码目的蛋白的序列相连接，而且调节元件在用药的受试者的心肌中必须能够可操作。
一般认为起始密码子和终止密码子是编码目标蛋白的序列的一部分。但是，这些元件必须在接受基因构建体的受试者中能够行使功能。起始密码子和终止密码子必须与编码序列一起在框内。
所用的启动子和多聚腺苷酸信号必须在受试者的心肌细胞中能够行使功能。
本发明实践中可用的启动子的示例包括来自猿病毒40(Simian Virus40)(SV40)的启动子、鼠乳腺病毒(Mouse Mammary Tumor Virus)(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus)(HIV)如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒(Moloney virus)(ALV)、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)(CMV)如CMV立即早启动子、Epstein Barr病毒(EBV)、鲁斯氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)(RSV)以及来自人类基因的启动子，如人alpha肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和人金属硫蛋白，但不止于此。
另一优选的实施方案是，FGF基因的表达由肌肉特异性启动子来驱动，如鼠或人的CARP基因上游序列，在US公开2003/0039984中有描述，或是心α肌动蛋白启动子序列，在国际公开WO 01/11064中有描述。
本发明实践中特别是在人类基因疫苗生产中可用的多聚腺苷酸的实例，包括SV40多聚腺苷酸信号、牛或人生长激素多聚腺苷酸信号和LTR多聚核苷酸信号，但不止于此。特别地，使用了pCEP4质粒(Invitrogen，SanDiego Calif.)中的SV40多聚腺苷酸信号(称为SV40多聚腺苷酸信号)。
除DNA表达所需的调节元件之外，DNA分子中还需要包含其他元件。这些附加的元件包括增强子。增强子可以从包括但不止于人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强子例如来自CMV、RSV和EBV组成的组选择。
基因构建体可具有哺乳动物复制起点，以便保持该构建体位于染色体外，并在细胞中生产该构型的多个拷贝。来自Invitrogen(San Diego，Calif.)的质粒pCEP4和pREP4包含Epstein Barr病毒复制起点和编码核抗原EBNA-1的区，其导致大量的附加型复制(episomal replication)而不会发生整合。其他适用的质粒均为本领域方法人员所熟知，如质粒pBR322，其具有复制子pMB1，或质粒pMK16，其携带复制子ColEl(ubel，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，New York(1988)111.5.2.)。
在一项优选的实施方案中，编码FGF的质粒显示条件复制起点pCOR(conditional origin of replication)，如国际申请WO 97/10343及Soubrier等人(GeneTher.1999；61482-1488)所述。pCOR质粒含有优化的表达单元盒，它编码插入原始主链中的人类FGF-1(sphFGF-1)的分泌形式。产生的质粒具有尺寸小的优点，为2.4kb。编码sphFGF-1的序列是序列融合体，所述序列分别编码来自人成纤维母细胞干扰素的编码分泌信号肽(sp)和天然存在的人FGF-1的氨基酸21到154的截短形式(US 4,686,113；US 5,849,538)。sphFGF-1的表达由人巨细胞病毒(CMV)立即即早增强子/启动子(核苷酸-522到+72)驱动。来自猿病毒40的晚期多聚腺苷酸化信号(SV40基因组的核苷酸2538到2759，GenBank基因座SV4CG；US5,168,062)插在sphFGF-1融合体的下游，以保证转录终止和随后的sphFGF-1转录物的多聚腺苷酸化正确而有效。优选的质粒命名为NV1FGF，且没有任何抗生素抗药基因。质粒的选择依赖于自养受体株中的抑制子转移RNA基因(suppressor transfer RNA gene)。维持较高的拷贝数和严格限制的质粒的宿主范围是利用R6Ky复制起点获得的。编码该蛋白的序列在细菌不常见，而是人工插入所选的宿主株的基因组中。因此，质粒的潜在的传播受到极大限制。
根据本发明的质粒可通过任何将可注射药物递送到心肌细胞的方法来给予脊椎动物。优选地，所给予的质粒是裸DNA质粒，因为这种质粒不含有任何用于帮助进入细胞的转移载体，例如，所述多聚核苷酸序列不含有病毒序列，特别是任何可能携带基因信息的病毒颗粒。类似地，它们也不合有促进转染的物质，例如脂质体配制剂，带电荷的脂质如LipofectinTM或沉淀剂如CaPO4。另外质粒也可以用可药用的液体载体递送给动物。在优选的申请中，液体载体是水性或部分是水性，包括经消毒的无致热源的水。制剂的PH值经适宜地调整并缓冲。或者，质粒也可以应用脂质体，如阳离子或带正电荷的脂质体来注射。
以下例子清楚地显示质粒NV1FGF使得所编码的FGF-1蛋白缓慢释放，达到的浓度足以促进持续的血管生成反应，该反应是通过毛细血管和成熟血管如小动脉的生成实现的。另外，NV1FGF显示特别有效，因为证明它在不可测量的浓度下可以有效促进所治疗的肌肉中的仍血管生成。因此NV1FGF使用的浓度可以在一定治疗窗内，这样就避免了由于分布到周围组织或器官或杂乱的血管生成所引起的副反应。
另外，有证据显示由于在安全性及有效性方面的优越的特性，在高胆固醇血症或糖尿病引起的恶化的疾病中，NV1FGF对于治疗性血管生成特别有用。
因此预期本发明可以逆转任何原因导致的血供减少引起的血管生成缺陷，所述缺陷在诸如高胆固醇血症或糖尿病的疾病中加重。
在本发明的内容下，靶组织包括已出现或可能出现缺血损害的肌肉组织，产生这种损害的原因是这些组织缺乏足够的氧合血供应，在高胆固醇血症或糖尿病背景中会进一步恶化。如实施例所显示的，肌内注射NV1FGF质粒在与基因治疗必须的安全性相一致的治疗窗内可以有效使用，其也能够在进一步诱导显示内皮功能受损的缺血组织中的血管生成。
关于本发明的一个实施方案，NV1FGF质粒以局部方式用于靶肌肉组织。但是，在本发明的上下文中，可以利用任何将NV1FGF质粒用于靶组织的适宜的用药方法，优选地，这种局部注射入靶肌肉组织的方式通过使用针将NV1FGF直接注射入肌肉来完成。
使用术语“注射”，意指NV1FGF被加压导入靶组织。按照本发明，任何适宜的注射装置均可使用。
虽然给予一个剂量NV1FGF质粒可以通过一次注射入靶组织来完成，但优选的剂量给药方式是通过NV1FGF多次注射。多次注射可以是2，3，4，5或更多次重复注射，优选为5次或更多次注射入患有高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者的缺血肌肉。多次注射相对与单次注射的优点在于其可以通过参数来控制，所述参数如在靶组织中每次注射的位置所决定的特定几何学(specific geometry)。通过多次注射来注射单个剂量的NV1FGF可以更好地控制，给予的每任何剂量的效力可以最大化。
多次注射的特定几何学也可以在两维空间中确定，每个位置均给予NV1FGF(where the each application of the NV1FGF is administered)。多次注射可以在缺血组织内或其周围进行，优选诸如注射点间相隔2或3cm。
按照本发明的另一实施方案，多次注射进行的每次注射之间相隔约5到10分钟。
将NV1FGF用于受血管生成缺陷影响而且其中内皮功能严重受损的靶组织时，要求给药的方式保证NV1FGF能够接触到的这样的区域，其合理地接近侧支血管形成的起点和终点，以及两者之间的区域。
给药按照本发明的组合物以达到治疗的目标可以通过经局部、肌内、胃肠外、静脉、心肌内、心包、心外膜的方式或经冠状动脉内对目标心肌组织给药。优选地，经心肌内、心外膜、心包或冠状动脉内给药时使用针或导管进行。
优选地，肌内注射NV1FGF可以在大腿远端肌肉或小腿(leg)远端肌肉进行，也可以在靠近缺血区域或缺血区域周围进行。
而且，用直接心肌内注射的方式用药时，所述给药可以在开胸外科手术时进行或通过导管的辅助进行。心脏给药的导管在本方法领域为人熟知，包括例如US专利5,045,565或4,661,133所描述的针式导管；带有位置感受装置的如US专利6,254,573和6,309,370所描述的；或者US专利6,346,099和6,358,247所描述的带有螺旋形针的导管。
本发明的一个有利的方面是，给予有效治疗剂量的NV1FGF来逆转高胆固醇血症或糖尿病背景中的血管生成缺陷。虽然有效量根据患有除高胆固醇血症或糖尿病受试者外的血管生成缺陷的给定受试者的体重和疾病而不同，但本领域技术人员能确定对于给定受试者和疾病的适当剂量。
按照这方面的一项优选实施方案，治疗使用的质粒剂量为约8000μg到约16000μg，在严重的血管生成缺陷疾病中，所述质粒通过多次注射给予，优选在约1到2周或更长的时间间隔里重复给予2到4次NV1FGF的肌内注射，以促进侧支血管和小动脉的持续形成，从而使得患高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者中的缺血所致的血管生成缺陷得以逆转。
所需的NV1FGF以药剂组合物的形式用于目标缺血肌肉，该组合物包括可药用的载体和NV1FGF质粒。
在本发明上下文中，任何可药用的载体都可以使用，这些载体在本领域已知。载体的选择部分地由该组合物用药的具体位置和该组合物用药的具体方法决定。适用于注射的配方包括水性和非水性溶液或等张灭菌注射溶液，其中可能包含抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂和使得配方与目的受者血液达到等张的溶剂，以及含水和非含水灭菌悬液，包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。所述配制剂可以以单一剂量或多个剂量存在于密封容器如安瓿和小瓶中，可以以冰冻干燥(冻干)状态储存，只需用药前另加灭菌液体载体，例如水。可以用上述药物的灭菌药粉、颗粒和药片制备临时的注射溶液和悬液。优选地，可药用的载体是缓冲盐溶液。最优选地，药用组合物含氯化钠溶液(0.9％)。
一个优选的实施方案中，本发明的组合物通与低分子肝素(LMWH)联合使用。LMWH分子和制备方法在本领域熟知，具体地在以下文献描述US5,389,618；US 4,692,435，和US 4,303,651，欧洲专利EP 0 040 144，而且Nenci GG也曾讨论(Vasc.Med，2000；5251-258)，此处引文中包含此文献。
第二个实施方案中，在对所治疗的骨骼肌给予电刺激之前或之后将表达FGF的质粒注射于高胆固醇血症或糖尿病的患者的骨骼肌中。本实施方案中使用的电刺激在US2002/0031827中描述，而且所采用的电压和频率不会引起骨骼肌收缩，也不会引起患者疼痛，因为其低于肌肉收缩的阈值。例如，采用的频率为约50HZ，电压为约0.1伏。在与表达FGF的质粒联合使用时，电刺激在增加血流方面产生协同增强作用。
在第三个实施方案中，表达FGF-1的质粒是BB，其与一种或多种促血管生成的因子联合给予。血管生成因子不做限制，包括PDGF-AA，M-CSF，GMCSF，VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C.VEGF-D，VEGF-E，neuropilin，FGF2(bFGF)，FGF-3，FGF-4，FGF-5，FGF-6，血管生成素1，血管生成素2，15促红细胞生成素，BMP-2，BMP-4，BMP-7，TGF-β，IGF-I，骨桥蛋白(Osteopotin)，多效蛋白(Pleiotropin)，Activin，内皮素-1以及它们的组合。
优选地，NV1FGF与表达PDGFBB的质粒联合注入骨骼肌或心肌，导致在高胆固醇血症或糖尿病背景中，侧支血管和小动脉的形成更好。因此这一实施方案涉及促进侧支血管和小动脉的方法，包含NV1FGF和表达PDGF-BB的质粒给予组织的局部区域，其剂量可以有效地在组织区域中诱导血管生成。促进血管生成的因子的递送在将编码该因子的分离的DNA递送到组织局部区域后，通过自该DNA表达而进行的。
本发明还涉及治疗还患有高胆固醇血症和糖尿病的患者中的PAD和PAOD，CAD或CHF的病理学的方法。
PAD的病因是一条或多条大血管的堵塞导致的下肢灌注受损。在早期阶段，这会导致步行时腿部肌肉不适感，到晚期就发展为溃疡和坏疽(1)。在已经患有缺血疾病如PAD的患者中，慢性心血管疾病是使其恶化的因素，作用的机制包括内皮功能不良(2，3)。为开发PAD的试验模型，将高胆固醇血症、高血压和糖尿病等病理改变作为可能的靶点进行研究(4-7)。然而，在这种下肢缺血的模型中，重要的一点是要抑制自发的血管生成反应，使任何再血管化治疗起效，以便模拟下肢缺血的临床状态。
高胆固醇血症的遗传模型也用于评价高胆固醇血症或糖尿病疾病中的血管生成特性，但是在这种遗传模型中，产生了单个受体(Watanabe遗传性高脂血症兔的LDL受体缺陷)或蛋白(ApoE-/-小鼠中糖蛋白ApoE缺陷导致VLDL和IDL水平升高)发生单个改变，实际上不能再现该病理学情况。
相反，在与患者的病理学情况相当类似的动物模型中，经证明NV1FGF质粒逆转高胆固醇血症引起的缺陷的效果尤其有效。实际上，由于富含胆固醇的饮食所造成的整体脂质超负荷的病理与患有高胆固醇血症的PAD患者的情况类似。
按照本发明，经证明NV1FGF通过促进侧支血管和小动脉的生长，对于挽救患PAD的患者的胆固醇引起的血管生成损害特别有效。
本发明还有另外一个目的是提供一种方法，其用于促进缺血组织中侧支血管和小动脉的形成，其中内皮功能受损。
如以下举例所示，NV1FGF能够有效诱导股后部的缺血损伤的肌肉中的成熟大传导血管(＞150μm侧支血管)以及小阻力动脉(＜50μm小动脉)的形成，这些血管对于传输和转运血液到组织都是必需的。诱导产生这种成熟血管在多数严重病例中都代表非常有效的治疗，这类病例中不良血管生成缺陷是由高胆固醇血症或糖尿病引发的。
在治疗性血管生成中，侧支和小动脉的生长是特别感兴趣的。实际上，侧支是在小动脉网之间形成的桥血管，而小动脉是成熟的血管，由一层内皮细胞和保护其稳定性的壁层细胞(外膜细胞或平滑肌细胞)组成，给组织提供大量的血供。因此毛细血管网依赖于它们的存在才能保证血流分布。(Carmeliet等.，Nat.Med.，2000；6389-395；Van Royen等.，Cardiovasc.Res.，2001；49543-553)。
本方面进一步的目的是提供一种促进血管生成的方法，前提是VEGF在所治疗细胞中不会被上调。
以下例子证明肌内注射NV1FGF不会导致注射的肌肉中局部鼠VEGF-A的诱导，也不会导致接受注射的小鼠的循环血液中鼠VEGF-A的分泌。这是本发明的一个重要方面，即其涉及在VEGF非依赖性途径中，促进侧支血管和小动脉生成，而不会诱导VEGF-A因子的新方法。实际上，已经知道VEGF-A会引起严重的不良副反应如杂乱的有害血管生成、水肿和潜在的致肿瘤性。
本申请自始至终参考了各种出版物、专利和专利申请。因此这些出版物、专利和专利申请的全文的教导和公布以参考文献的形式包含在本申请中，以便更完整地描述本申请所属技术领域的情况。
可以理解和预料，本发明在此处的范例实施方案中公布的规律可以由本领域方法人员进行改变，意图将这种修饰、变化和代替包含于本申请的范围中。
实施例实施例1动物及其饮食本试验使用11-12周的叙利亚金仓鼠(n＝50)(CERJ，Le Genest St Isle，France)。试验方案开始前至少7天，允许动物在标准环境中达到平衡。在整个试验过程中所有动物可以自由接触到水。所有动物操作经AventisPharma动物使用委员会(Animal Use ommittee of Aventis Pharma)认可，按照美国国立卫生研究院出版的指南进行操作。(NIH 出版物No.85-23，1985修订)。
试验1中，仓鼠(n＝37)随机分为3组(图1)。低胆固醇组(LC)仓鼠(n＝13)用标准食物随意饲养(参见A04-C，UAR，Epinay-sur-Orge，France)。对于两个高胆固醇(HC)组中的仓鼠，分别在治疗21天(HC/21)和28后(HC/28)(HC/21n＝12；HC/28n＝12)每天给予每只动物20g富含胆固醇的食物，这种食物是在标准食物中添加3％的胆固醇和15％的可可黄油制备的(参见1414C，UAR，Epinay-sur-Orge，France)。试验2中，仓鼠(n＝13)随机分配到2组中(图1)，盐水组(n＝5)和NV1FGF组(n＝8)的仓鼠用富含胆固醇的食物饲养，如试验1所述。
实施例2诱导下肢缺血LC或HC饲养35天后，按照下述进行外科操作，动物易于发生下肢缺血。诱导下肢缺血是在用N2O(0.81.min-1)，O2(0.41.min-1)和异氟烷(2％)的气体麻醉下，按照其他动物物种使用的程序进行操作的。在无菌外科手术的环境中，在右下肢的股内侧做一条纵行切口，从腹股沟韧带到髌骨近端的点。通过该切口，使用外科绳结(surgical loops)，分离股动脉并电凝(coagulate)其主要分支。将股动脉完全切断，其近端为自外髂动脉分出的起点，其远端为其分成隐动脉和腘动脉两个分支处(20)。用4.0号丝线单层缝合切口。
实施例3下肢骨骼肌的基因转移试验2中，在诱导缺血后14天对盐水组(n＝5)或编码NV1FGF的质粒组(180gag DNA，n＝8)盲性给予3次注射，每次50μL，注射位点分别在缺血下肢的胫前肌(Tibialis cranialis)、内收肌和四头肌。
实施例4血浆总胆固醇和甘油三酯水平的测定在相对于手术日的第-35，-7，和+21或+28天，在N2O(0.81.min-1)，)O2(0.41.min-1)和异氟烷(2％)的气体麻醉下，用眶后穿刺的方式从HC/21，HC/28，盐水组和NV1FGF组的仓鼠取血。利用市售试剂盒(OlympusDiagnostica GmbH，Hamburg，Germany)用酶学方法测定血浆总胆固醇和甘油三酯水平。
实施例5用血管造影定量侧支血管形成在诱导缺血后的第21天(HC/21group)或第28天(LC，HC/28，盐水组和NV1FGF组)，进行血管造影如下。
经插入腹主动脉的导管注射～300μL的对比介质(0.5g.ml-1硫酸钡水溶液)后即刻，用过量的戊巴比妥钠处死仓鼠。将仓鼠置于仰卧位，进入造像装置(MX-20型，Faxitron X光公司，惠灵，IL，USA)，搜集双下肢的脉管系统尸检(post-mortem)图像并进行数字化(软件示范，DALSAMedOptics，图森，AZ，USA)。该X光照像系统可以显示直径大于150μm的血管。由对治疗不知情的研究者离线分析图像，使用如前所述的专用软件(22)。
简单地说，对于缺血和非缺血肢体，用分析区域的百分数来评价股后部的侧支血管程度。血管程序作为缺血/非缺血百分数的比值来评分。为检验该方法的可信度，在6只分别按年龄配对的非下肢缺血的仓鼠中，进行血管造影评分。与预期那样，用右肢/左肢百分数比值计算的血管造影评分为1.04±0.18，反映双侧肢体的血管形成相似。
实施例6用免疫组化法定量小动脉的形成以及通过切除高胆固醇血症的仓鼠的股动脉产生的下肢缺血所致的典型肌肉损伤在诱导缺血后的第21天(HC/21group)或第28天(LC，HC/28，盐水组和NV1FGF组)，由缺血下肢获取骨骼肌，用PBS-3.7％福尔马林溶液固定。非缺血下肢的肌肉也同样采样，作为对照肌肉。由每个大腿的后部处理得到不同肌肉(股薄肌、半膜肌、内收肌、半腱肌、股二头肌)的两张横断切片。切片经脱水，包埋于石蜡中，制备成5μm厚的切片以便免疫组化分析。用直接抗平滑肌α肌动蛋白的小鼠单克隆抗体(SMA；克隆1A4，1∶200倍稀释，Dako，Carpinteria，CA，USA)作为血管平滑肌细胞(VSMCs)的标记物，因为其在成熟血管中持续表达。采用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶方法，用市售试剂盒(EnvisionTM+System/Horse RadishPeroxidase，Dako，Carpinteria，CA，USA)检测SMA抗体。SMA阳性(SMA+)的血管按其大小(外直径)分级，计数内收肌和股薄肌中直径＜50μm的小动脉。
选用这些肌肉是因为它们与股后部的其他肌肉(半膜肌、半腱肌和股二头肌)相反，容易受到我们的下肢缺血的仓鼠模型中的组织病理学损伤。
股动脉切除引起的典型损伤在图2中显示。诱导缺血28天后获取股后部的肌肉，即股薄肌和内收肌，然后将肌肉的5μm的切片用HES染色后观察。图2B和2C分别显示缺血肌肉中存在轻度坏死(虚线)和中央成核现象(箭头)。图2A显示没有病灶的非缺血对侧肌肉的放大X100倍的横切面，其作为对照。确定内收肌和股薄肌的总面积以便观察缺血对肌容量的影响。确定总肌肉区域内SMA+小动脉的数目。对这两个参数，计算缺血/非缺血数值的比值。所有操作由对治疗不知情的研究人员完成。
实施例7缺血肌肉中NV1FGF基因转移后FGF-1的表达在试验2中，注射盐水或NV1FGF基因转移后14天(即诱导缺血后28天)，对取自缺血和非缺血肢体股后部的肌肉(股薄肌和内收肌)做如下处理。用检测FGF-1表达经典的链霉抗生物素-生物素分析来进行FGF-1免疫组化分析。用一级多克隆抗-FGF-1兔抗体(参见AB-32-NA，1∶30倍稀释，R&D Systems，Abingdon，UK)保温，再用生物素酰化的驴抗兔免疫球蛋白(1∶200倍稀释，Amersham，白金汉郡，UK)保温。在加入偶联于链霉抗生物素的过氧化物酶后，用产色的二氨基联苯为底物来定位免疫复合物。5μm厚的切片用苏木精复染，脱水及用永久包埋介质包埋。免疫反应的纤维(染为褐色)在显微镜下可以鉴别(Axioplan 2，Zeiss，Hallbergmoos，Germany)。
统计分析结果用平均值SD表示。统计学显著性公知为P＜0.05。
在试验1中，在各个时间点比较HC/21和HC/28两组的血浆脂质水平，任意2数值间的比较先用ANOVA方法再采用Tukey-Kramer post-test来进行。LC、HC/21和HC/28三组间的血管造影评分用ANOVA方法再采用Tukey-Kramer post-test来比较。HC/21和HC/28两组的非缺血及缺血的肌肉面积和SMA阳性小动脉的数值，以及相应的比值，用非配对t检验比较。
在试验2中，在各个时间点比较盐水组和NV1FGF组两组的血浆脂质水平，任意2数值间的比较先用ANOVA方法再采用Tukey-Kramer post-test来进行。盐水组和NV1FGF组两组的血管造影评分、非缺血及缺血的肌肉面积和SMA阳性小动脉的数值，以及相应的比值，用非配对t检验比较。
实施例8测量低胆固醇和富含胆固醇食物组的血浆脂质表1和表2分别总结了试验1和试验2中的血浆脂质水平，在给予富含胆固醇的食物前(第-35日)以及食物改变后的各个时间点(第-7日和+21或+28日)。富含胆固醇的食物引起了血浆总胆固醇和甘油三酯水平随时间依赖性的升高。
表1.试验1中的血浆脂质水平
N.A.不可应用***P＜0.001相对于饮食前表2.试验2中的血浆脂质水平
N.A.不可应用**P＜0.01相对于饮食前***P＜0.001相对于饮食前实施例9富含胆固醇的食物对下肢缺血后侧支发育和小动脉密度的影响(试验1)如图3所示，LC组(图3A)下肢缺血28天后侧支形成较多，因此血管造影评分为0.93±0.45(图3D)。
相反，下肢缺血后21或28天，两个HC组的侧支形成显著受损，血管造影评分分别下降至0.35±0.38和0.37±0.21(见图3B和3C)。两个HC组与LC组相比血管造影评分均显著下降(P＜0.01)。然而，在HC/21和HC/28两组之间，血管造影评分没有显著差别(P＞0.05)，如图3D所示。
图4A-4D显示放大X100倍的横切面，描绘用平滑肌α肌动蛋白(SMA)免疫化学法标记的成熟血管，所述血管来自诱导缺血后21天(A和B)或28天(C和D)获取的非缺血(A和C)及缺血(B和D)肌肉(股薄肌和内收肌)，以及肌肉面积和＜50μm的SMA阳性小动脉的定量。
如图4E-F所示，缺血21天后，缺血下肢与非缺血下肢相比，前者内收肌和股薄肌的面积下降(P＜0.01)。下肢缺血28天后也观察到同样的趋势，尽管其没能达到统计学显著性(P＝0.0538)。另外，缺血后21天和28天缺血下肢均与非缺血下肢相比，前者中＜50μm的小动脉数量显著降低(P＜0.01)。在开始改变食物后21天和28天，尽管在计算小动脉密度的中间步骤中有这些统计学水平具有显著性，但是小动脉密度本身却没有显著差异。在21天和28天时，用缺血/非缺血下肢比值表示的肌肉面积、SMA+小动脉和小动脉密度也没有显著差异。
这些结果清楚显示，下肢缺血后21天和28天，高胆固醇血症对侧支血管发育的抑制，大小血管水平的慢性血管生成疾病(如血管造影定量所示)，和由组织学方法定量的＜50μm的小动脉的诱导程度相同(图2B和2C)。
此外，本研究所使用的高胆固醇血症仓鼠提供了一个特别严重的模型，因为用于我们的模型的脂质超负荷增加，明显导致了下肢缺血后的内皮功能损害和血管生成反应的缺陷。另外开始富含胆固醇的饮食4周后取自仓鼠的动脉的组织病理学分析显示存在泡沫细胞。而且，总胆固醇和甘油三酯水平连续升高，并在下肢缺血恢复的期间持续存在，因此在内皮损害和血管生成缺血的严重程度方面该模型为最严重的病例情况。
实施例10肌内用药14天后(即下肢缺血28天后)NV1FGF基因转移对于高胆固醇血症仓鼠中侧支发育和小动脉密度的影响(试验2)如图5B所示，诱导下肢缺血14天以后肌内给予NV1FGF基因转移，与用盐水处理的仓鼠相比，显著改善了缺血肢体的侧支形成(图5A)。实际上NV1FGF基因转移后的血管造影评分(0.75±0.47)也显著高于(P＜0.01)盐水处理的仓鼠(0.22±0.05)。
图6A和6B是用盐水和NV1FGF处理的仓鼠的缺血肌肉的典型的横切面(放大X100倍)，显示用平滑肌α肌动蛋白(SMA)免疫化学法标记的成熟血管，并定量表示肌肉区域和＜50μm的SMA阳性小动脉。
盐水组和NV1FGF组的缺血下肢中均可观察到内收肌和股薄肌面积减少(分别为P＝0.2404和P＝0.0846)。如图6C和6D所示，用缺血/非缺血肢体比值表示的肌肉面积在盐水组和NV1FGF组中相似(P＝0.4584)。盐水处理的动物中，＜50μm的小动脉的数目在缺血下肢中较非缺血下肢中显著减少(P＝0.0333)，然而在NV1FGF组差异不显著(P＝0.1347)。计算缺血/非缺血下肢的比值显示，NV1FGF处理的肌肉中的所述值与盐水处理的肌肉中的所述值相比在统计学上更高(P＝0.0187)。但是，任一组的非缺血与缺血下肢的肌肉中小动脉密度没有差异(盐水组和NV1FGF组分别为P＝0.9320和P＝0.1586)。用缺血/非缺血比值表示的小动脉密度在盐水组和NV1FGF组间没有差异(P＝0.2724)。
实施例11NV1FGF基因转移后缺血肌肉的FGF-1表达与涉及其他血管生成因子如VEGF或FGF-2的基因治疗不同的是，发明者已经证明，FGF-1的表达有利地局限于用NV1FGF处理的动物的缺血肌肉。
而且，如非缺血(对侧)未经注射的下肢(图7A)和注射盐水的缺血下肢(图7B)或注射NV1FGF的缺血下肢(图7C)的股后部肌肉(股薄肌和内收肌)中，如用抗-FGF-1多克隆抗体免疫化学染色的代表照片(放大×100倍)所示，令人吃惊的是，在盐水处理的动物的缺血肌肉和盐水及NV1FGF处理的动物的非缺血(对侧)肌肉中都没有FGF-1的表达。这清楚表明NV1FGF质粒的优越特性，即使得所编码的FGF-1蛋白在治疗窗内缓慢释放，其足以通过成熟血管的形成产生持续的血管生成反应，而该浓度不允许出现传播和杂乱血管生成或不良副反应。由此可证明NV1FGF非常有效，因为它可以在不可检出的浓度下，促进所治疗肌肉内的血管生成，因此在特征性表现为内皮功能不良恶化的疾病中，允许使用包含在治疗窗内的NV1FGF浓度。由于在安全性和有效性方面的这一优越特性，NV1FGF可以有效地用于高胆固醇血症或糖尿病引起的加重的疾病中的血管生成治疗。
这些结果清楚地显示NV1FGF基因治疗能够通过侧支血管和小动脉的增加来挽救受损的肌肉。事实上，在股后部的肌肉中，血管造影已经证实有＞150μm的侧支血管的生长，免疫组化证实了＜50μm的小动脉的生长，这些肌肉包括股二头肌、内收肌、股薄肌、半膜肌和半腱肌。出乎意料的是，申请人还证实，在NV1FGF基因转移后14天，在该区域内侧支血管明显受到刺激而形成，这正如血管造影评分所强调的(图5C)。
尽管没有进行组织氧合的原位测量来评价股动脉切除后该区域发生的缺血，但发现存在组织病理学损伤如中央成核现象、萎缩、坏死和炎症(图2)。更精确地说，这些损伤局限在内收肌和股薄肌，而股二头肌、半膜肌和半腱肌不易受损。因此专门在内收肌和股薄肌进行＜50μm的小动脉的定量，位置正在内收肌管的上方。如图6D所显示，NV1FGF基因转移增加了进入缺血下肢中这些肌肉的小动脉的绝对数量。
因此这些数据明确显示了NV1FGF在股后部缺血损伤的肌肉中具有诱导成熟的大传导血管(＞150μm的侧支血管)和小阻力动脉(＜50μm的小动脉)的形成的能力，它们是给组织运送和提供血液所需要的。
实施例12在NV1FGF治疗的肌肉中没有VEGF-A的诱导本试验的目的是评价经肌内(IM)给予编码鼠FGF-1的裸DNA后，小鼠体内的VEGF-A诱导。研究小鼠VEGF-A(mVEGF-A)的循环水平和基因表达。循环中的水平用ELISA法，在IM给药后3天和7天时测量，局部mVEGF-A基因的表达在第7天使用两种分析方法测定针对这种蛋白的免疫组化法(IHC)以及通过实时逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测mRNA。
本研究中使用40只雌小鼠。1到3组(每组n＝8)分别接受pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1、pCOR-CMV空白(无FGF-1基因)或NaCl 0.9％的IM用药，所述注射在左右胫前肌都进行。pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1对应NV1FGF质粒，其中人FGF-1用相应的大鼠来源的编码序列替换。用药后第7天获取被注射的肌肉，并对其进行mVEGF-A和FGF-1免疫组化(右侧肌肉)或mVEGF-A实时RT-PCR(左侧肌肉)。在1至3组中，用药后第3天(D3)和第7天(D7)取血进行ELISA检测，检测在新鲜制备的血浆样品中的mVEGF-A。
如图8所示，在注射了pCOR-CMV空白I(图8B)和注射了盐水(图8C)的肌肉中都没有检测到FGF-1阳性的肌肉纤维。在注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的肌肉(图8E)中，确认每张切片平均有25条表达FGF-1的肌纤维。
利用免疫组化法，在两组对照组肌肉中(NaCl和pCOR-CMV.空白)均观察到类似且微弱的mVEGF-A的标记，提示内源性的mVEGF-A表达，免疫染色定位在肌纤维内，显示马赛克的图案，因为某些纤维的标记较另外一些的密度更大。注射后第7天时，与注射NaCl或pCOR-CMV.空白的肌肉相比，在注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的肌肉中，没有观察到mVEGF-A免疫标记增多。观察到的免疫染色的马赛克图案相同。
使用实时RT-PCR方法，证明用NaCl和pCOR-CMV.空白处理的肌肉的mVEGF-A mRNA水平表达相同(每2ng总RNA中有6.84×103和4.31×103个cDNA拷贝)，提示内源性mVEGF-A表达。用药后第7天，在注射了pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1的肌肉中，与注射了NaCl或pCOR-CMV.空白的肌肉相比，没有发现mVEGF-A的mRNA的水平升高。
这些结果清楚地提示肌内注射pCOR-CMV.大鼠-spFGF-1不会导致被注射肌肉中局部的VEGF-A诱导，也不会导致被注射的小鼠循环血液中的mVEGF-A分泌。
实施例13高胆固醇血症Watanabe兔冠状动脉疾病的动物模型基因治疗产品作为有效疗法的合法性部分依赖于其生物学活性。为了评价这一问题，所选的动物模型应该顾及解剖和功能，尽可能接近其所模拟的人类疾病。
解剖学相关性基于所用的物种，在冠状动脉网络方面，其应该尽可能接近人类的心脏。而且，动物种类越大就越合适，因为这使得各种方法步骤易于进行。另一方面，也要注意其他因素，如成本，操作设备，动物状况的偶然性(contingency)，动物设备的依从性等。本研究找到的最佳的折衷方案是兔，它足够小，可以易于处理和稳定(stabulated)，也足够大，可以保证较好地对具体动脉进行定位，进行精确的冠状动脉造影，各种解剖和功能问题也类似人类。
当然，在此功能的相关性基于动物发生病理学改变的能力，这种病理学改变应尽可能与所对应的人类疾病即高胆固醇血症相关的血管生成缺陷类似。
人类高胆固醇血症导致血管内皮功能不良，而且最终进展为主要冠状动脉的狭窄。冠脉血流在静息和应激情况下的不平衡产生隐匿的心肌功能不良，导致疼痛和伸缩性降低。通常在静息时血供适宜，但发生应激时，由于冠脉阻塞性病变，需求增加而血供不能增加。所以为了达到模拟这种人类的病理的目的，既要在主要冠状动脉建立狭窄又要使用应激试验来显示由该狭窄应激导致的不平衡。
Watanabe可遗传性高脂血症兔(WHHR)缺乏LDL受体，因此它可以出现自发的动脉粥样硬化症，引起冠脉动脉粥样化(coronary atheroma)，因此用来评价缺血和评估开胸手术过程中心肌内注射NV1FGF对其缺血状态的影响。
所有试验均依照由动物管理及使用委员会批准的草案的进行，而且遵守NIH关于试验动物的使用和管理指南。
由Covance获得体重在3000到3500g之间的一年龄的WHH兔(PO Box7200，Denver，PA，17517，USA)。
依照优良的动物管理惯例，在使用之前将所有动物在我们的动物房中保持至少8天。在此期间，每笼圈养一只动物，它们可以自由获得食物(来自UAR的112C型)和适宜的经过滤饮用水。动物居所保持12小时的昼/夜节律(6a.m.起照明)，环境温度保持在20-24℃，湿度设定在35-75％。
Watanabe兔的胆固醇水平较野生型动物高7到10倍，而其甘油三酯水平较正常高4到5倍。
处死后，其中的4只进行油红O染色，这种染色显示主动脉内存在的脂质斑块，冠状动脉开口和二尖瓣。
而且，它们中有一只送交组织学分析。对回旋冠状动脉HES染色的切片进行显微镜检查，确定所研究的两只兔中有一只的动脉粥样硬化斑块占据了管腔近15％(兔#CAD98R2，参见图9B)Watanabe可遗传性高脂血症兔有两点有趣的特性其心脏的大小变得很适于进行多点心肌内注射，而且它的冠状动脉网布满了动脉粥样硬化斑。后者可以解释冠脉血流在静息时正常(通过ECG正常和收缩正常而如此评价)而麻醉下的多巴酚丁胺应激试验会导致缺血的显著表现。
实际上，两种分析方法，如心电图和超声心动图，都显示了可与其人类相应情况相比较的应激征象，例如ST段压低或运动低下。
实施例14手术使用手术来用直接注射的方式将基因治疗产品递送入心肌内。手术过程在消毒环境下进行。动物通过肌内注射氯胺酮(ketamine)(70mg/Kg)+甲苯噻嗪(Xylazine)(7mg/Kg)混合物(1ml/Kg)的方式麻醉。动物备皮后，对于咽部喷以气化的5％利多卡因，以便易于进行气管内插管，整个试验过程中用机械通气维持麻醉(西门子，Servo呼吸机900D)，条件如下 通气量1，4L/分 呼吸频率40/分 氟烷0.4到0.6％ 氧30-35％
进行耳缘动脉插管，以便给动物连续输注5％葡萄糖。使用ECG监护来保证整个手术中心率稳定。在第4肋间隙施行左侧胸廓切开术。打开心外膜后，心脏显露，可以进行质粒注射。
在左室游离壁的13个不同位置进行注射，使用自制的针250μl汉密尔顿注射器连接一根Stériflex G19导管(参见167.10)，用短斜针BD(26G3/8)固定。我们在每个位置注射1mg/ml的质粒溶液25μl。图1A显示每次注射的位置。
注射后，在胸腔置引流管，并将肋骨用两根Mersurtures(1.0)丝线并排固定。停用氟烷，维持氧气至动物苏醒。关闭胸腔期间引流设置在约200-400毫巴。两层肌肉用Vicrylg(4.0)丝线缝合，皮肤用Suturamide(2/0)丝线缝合。最后一针缝合完成后，拔除引流管之前，用机械通气提高肺的呼气末正压，以便在引流管刚拔除时，肺在胸腔里充分膨胀。
在伤口使用聚维酮碘胶并用绷带包扎。动物苏醒后，停止机械通气。
实施例15手术后治疗动物苏醒后立即注射以下化合物-抗聚集药物和抗凝药物，以避免手术中和手术后可能出现的冠脉血栓形成Vetalgine 0.375ml(手术前一天，以及此后5天)肌内肝素0.1ml(自手术次日起用4天)皮下-广谱抗生素以预防感染2％Baytril 0.2ml(5天)皮下-强镇痛剂以便动物可以耐受大手术操作吗啡0.5ml(2天)皮下实施例16心电图尽可能按相应的人类的情况进行心电图检查。四个电极安置在四肢，6个电极(VI到V6)安置在心前区。用HP Pagewriter II 4565A记录常规典的12导联心电图。使用ECG以便监测(1)手术中心律(2)多巴酚丁胺应激试验中的心律(3)检测心肌梗死以及(4)检测缺血征象。
4.1手术中监测心律全麻下的开胸手术可能引起各种手术相关per-operatory问题，可以通过ECG监测发现。处理心动过缓通过注射阿托品治疗，心律失常通过注射0.5％利多卡因(0.5到1ml)治疗，心跳骤停通过电(energic)心肺复苏，包括异丙肾上腺素治疗。
4.2多巴酚丁胺应激试验中监测心律尽管多巴酚丁胺的主要药理学影响是变力性的作用，该产品也有变时性，因此心律增快似乎是监测应激试验的最简便方法。
4.3检测心肌梗死心肌电活动记录为一系列心搏，每搏是顺序出现的几个波主要部分为p，q，r，s和t。p波用来代表心房活动，qrs综合波为心室活动，t波用来作为复极化的标志。
人类心肌梗死最典型的ECG征象是深大的q波。用兔也可以得到类似结果，因为对一批用于探察的兔分析显示，经历冠状动脉的机械性关闭后，其中大部分出现这种q波。
4.4检测缺血征象这种隐匿的现象通常在静息时不能发现。在应激试验中则描述了各种改变。我们假定兔心脏在受到机械/化学应激时显示的电模式是相同的。事实上，人类中真正的缺血会导致ST段抬高或压低，或/和T波倒置(图10)。人类应激试验中，两个主要的征象是ST段压低和负相的深T波，如图10所示为。其相应的兔的示例在图11中表示。
图12显示对缺血征象的评分方法。给图12所示每个导联评分为0(正常ECG)到3分(显著缺血)，并记予记录。任何导联出现显著的变异与出现变异的导联数目同样重要。因此最初记录所有得分之和，以后只记录具体ECG的最高得分并用于缺血动物的纳入。唯一的排除标准是出现q波(宽超过1格，深超过3格)，它提示出现了透壁的坏死。
图13A显示静息时典型的正常12导联ECG，而同一只动物在应激最强时(见图13B)，显示I，II，aVF，VI，V2，V3，V4导联出现明显的下斜型压低，以及III，V5和V6导联出现不明显压低。这一ECG显示相当严重的缺血。
总之，ECG是发现排除标准(即坏死)或纳入标准(对多巴酚丁胺的缺血反应)的最佳一线方法。
实施例17超声心动图使用Acuson Sequoia 256和线性8L58MHz探头来评价心肌收缩力，这是因为兔胸腔区域小，在这一项特定的分析中可以使用这种表面的探头。
对每只动物，在手术前进行一次超声心动描计，然后每周在应激试验前和当中进行一次。每一病例中，检查心脏的总体动力表现，尽可能沿长轴和短轴两个方向逐一测量多个段。然后标记(spotted)长轴中的最大直径，调整仪器到M型，确认左室运动正常。
应激试验的每一步均进行类似的2D分析。记录所发现的任何异常并进一步评价用以下(图14)术语记录出现的位置，并且给运动缺陷的类型分级1为正常，2为运动低下(hypokinesy)，3为无运动，4为运动障碍。如果缺陷的存在不明确，用M型计算增厚分数。如下顺序评分如果所有节段增厚分数均正常(30％以上)为1，如果有运动低下(一个或更多节段低于30％)为2，如果无运功(至少一个节段没有增厚)为3，如果运动障碍(一个节段增厚分数为负，即收缩期心肌舒张)为4。
在最后的分析中只保留最高的缺陷得分。
实施例18多巴酚丁胺应激试验本试验利用多巴酚丁胺的变力性和变时性，来模拟心脏对应激的反应。由于缺血是隐匿的现象，通常在应激过程中发生，其揭示要通过由ECG上的电征象和其对心肌收缩力的影响来检测，如超声心动描计所显示的那样。该试验的方法步骤如下-麻醉不使用异氟烷，因为它引起静息时心率快。不使用氟烷，因为其与阿托品联用时导致心室异位(ectopies)的表现。因此选用甲苯噻嗪-氯胺酮Xylazine-Ketamine，因为其心率升高的动力学好。
-阿托品在耳导管内注射阿托品甲基硝酸盐0.5mg/Kg，作为预备步骤。不使用阿托品硫酸盐，因为它引起一定程度的心率升高。
-剂量增加首次剂量为2μg/Kg/min，每3分钟增加剂量至5、10、20、30和40μg/kg/min。如果没有达到最大心率，最高剂量为80μg/kg/min。
每一步骤均记录ECG和超声心动图。麻醉的兔静息时心率为203±22(试验n＝61)，剂量为40μg/kg/min时心率为280±31(n＝59)，而剂量为80μg/kg/min时心率为299±19(n＝29)。仅当剂量为40μg/kg/min、心率在300bpm以下时，才决定由40增至80。
总之，本试验用来显示化学应激过程中心肌的活动，从而揭示心脏的缺血部分。
实施例19组织学分析-检出动脉粥样硬化斑块，耐受性和FGF-1表达。
在试验最后检查两只兔的回旋冠状动脉是否存在粥样硬化斑块。移除心脏，切取左室样本，其中包含回旋冠状动脉的上部分，浸于PBS缓冲的3.7％福尔马林以便进一步分析。每个样本用石蜡包埋。每隔30μm切5μm切片，用苏木精-伊红-番红花(saffron)(HES)染色以便进行显微镜检查。
另外两只兔用来评价在左室壁内注射编码FGF-1的质粒的有效性和安全性。最后的一只在第3天施以安乐死，移除心脏并清洗，观察其前壁，在福尔马林中保存1小时。然后它被分为5份样本，每份样本在石蜡包埋前置于PBS缓冲的3.7％福尔马林中固定过夜。
对每个心脏，有肉眼可见的病灶的或可能包括注射位点的5个样本被收集起来，在石蜡包埋前置于PBS缓冲的3.7％福尔马林中固定过夜。
使用标准步骤制备切片。对于每块切取2张5μm连续切片。一张切片用苏木精-伊红-番红花(HES)染色进行组织病理学检查，另一切片进行FGF-1免疫组化处理(IHC)。通过与针和载体注射的组织学变化，可以在HES染色的切片上确认注射位置。
用经典的链霉抗生物素-生物素分析来进行IHC处理。用一级多克隆抗-FGF-1兔抗体(R&D Systems，#AB-32-NA，1∶30倍稀释)保温，再用生物素酰化的驴抗兔免疫球蛋白(Amersham，1∶200倍稀释)保温。在加入与链霉抗生物素偶联的过氧化物酶后，用产色的二氨基联苯为底物来定位免疫复合物。切片用苏木精复染，脱水及用永久包埋介质包埋。用这种方法，免疫反应的纤维表现为褐色，核为蓝色。先前在兔肌肉中的FGF-1 IHC分析的有效性显示了检测肌纤维中的FGF-1转基因的能力。使用阴性对照(去除初级抗体，但使用次级抗体)来区别非特异性染色(主要在细胞外)与特异性免疫反应。而且，在整个分析过程中，使用事先表现有高水平FGF-1表达的大鼠肌肉的阳性切片(切片P1056GNR2，研究PAD31.2001)，对FGF-1IHC的性能进行控制。在显微镜(Zeiss，Axioplan 2)下确认和计数免疫反应性纤维。免疫反应性细胞的数目是在每个注射位置周围观察到的免疫反应性心肌纤维的数目。
实施例20在高胆固醇血症背景中证实治疗性血管生成共用16只一年龄的雄性Watanabe兔来评估NV1FGF对于逆转高胆固醇血症相关的心肌缺血的有效性。另外两只新西兰兔进行了同样的外科手术，在表达分析后3天处死。
20.1/FGF-1表达的评价和组织病理学模式两只健康新西兰兔在接受外科手术并注射NV1FGF三天后处死。与注射载体相关的组织病理学变化的评价成功地完成，因为在每个心脏的5个样本中，定位了5个和7个注射位点。某些样本中见到多达3个不同的注射位点，相隔6到10mm，与2次注射间隔的距离相对应。心肌的病变或多或少呈线性，其变性与坏死与活动性慢性炎症反应相一致(见图15A)。某些样本显示心包膜下弥漫的淋巴细胞浸润，提示局限性心包炎。每个结果在表3中列出。
心肌内注射NV1FGF后3天，在所有显示注射位点的样本中均可发现FGF-1免疫反应性肌纤维。局限于组织学病灶外围的表达为每个注射位点阳性3到36个心肌纤维不等(见图15B)。每个结果在表3中说明。
*表3心肌内注射NV1FGF后3天，健康兔心肌中的组织学观察和FGF-1表达
总之，在健康兔的心肌内直接注射NV1FGF后3天，观察到了肌纤维变性和此后的炎性反应。在这样早的时间点，认为组织学损伤是非NV1FGF特异性的，因为病变的严重程度和类型都与在猪心肌内注射不编码任何转基因的裸DNA质粒后的病变类似。
在心肌内注射NV1FGF对兔心的转基因表达的有效性得到了证实，因为在显示注射位点的所有样本中都发现了FGF-1的表达。考虑到每个注射位点的免疫反应性肌纤维的数目，表达的水平与在大鼠心脏的心肌内注射同等量的NV1FGF后观察到的相似，前提是兔中的一个注射位点与大鼠心脏中的一次注射对等。
20.2/接受注射的Watanabe兔的心电图模式本研究包含了16只兔。每只动物在手术前经历应激试验，然后每周一次，持续四周。对两组观察到的最高得分作图(蓝色为注射空质粒的动物，粉色为注射NV1FGF的动物)。第7天时，NV1FGF组的大部分动物得分均较低，提示治疗后缺血趋于消失。另一方面，空白治疗组的大部分动物仍有深度缺血(最大缺血得分为3)。
如图16所示的结果显示应激试验中最大的ECG得分的演变，所述应激试验对空质粒治疗的兔(蓝色点代表个体值，蓝色柱代表平均值)或NV1FGF质粒治疗的兔(红色点代表个体值，粉色柱代表平均值)进行。NV1FGF质粒的质粒清楚地显示其相当有效地减少了缺血面积。
从第7天开始，统计分析(非配对t检验)显示在两组之间有显著差异(p＜0.05为*，p＜0.01为**)，提示FGF-1的存在可以影响应激时缺血性心电图模式的恢复。
20.3/接受注射的Watanabe兔的超声心动图模式第一步是要证实定性评价(分类为正常、运动低下、无运动)和定量评价(壁增厚分数)之间相符合的精确程度，分析了30个节段，16个视为正常，14个为异常。之后计算它们的壁增厚分数，其一致性在图17中表示。
正如所见，两个系列之间的重叠相当狭窄，提示肉眼评价很适当。异常的节段包括一个运动障碍节段(增厚分数好但运动异常)和3个无运动节段，其中有一个甚至出现收缩期变薄。接下来可以认为我们对正常和运动低下/无运动的定性是正确的，因此能够进行第二步和心肌动力的更广泛的评价。
第二步是将每次应激试验中的ECG结果与超声心动评价建立相关性。结果作图见图18。回归曲线用红色显示，提示异常的ECG与异常的回声大致相关。两个阴影区域代表两套主要数据第一个是运动正常的回声与正常/轻微缺血的ECG，第二个是异常的回声(运动低下和无运动)与严重缺血的ECG(得分为3)。
其中缺血ECG对应正常回声的6个点是由于方法上的困难，不可能每个试验都获得满意的数据(getting a good clip for every test)，提示可能回声缺陷被遗漏。另一方面，只有3个试验显示具有回声缺陷的轻微缺血ECG。没有正常ECG与异常回声相关，提示ECG的敏感性好。
第三步，随访两组、每组4只待治疗的动物的超声心动的演变。得分分级为1(正常)，2(运动地下)或3(无运动)。在这一批动物中没有运动障碍的节段。原始数据标在表4中。如这一附件中可见，基线值不同(平均分为2.25对1.5)。因此，对整批动物用各自的基线值作为100％进行标准化。然后以下代表每只动物的点就用基线值的百分数来表示。最终数字在图19中显示。
表4超声心动评分的原始数据
NV1FGF治疗的动物评分显著低于空白质粒处理的动物的评分(用非配对t检验分析)，提示FGF-1的存在对于心肌收缩力的影响，而空白质粒处理的动物评分增加。
重要的是，由于最终处死步骤包括了其他方法分析，未在此详述，所以这些动物在第28天没有回声记录。
图19所示结果清楚地显示用多点NV1FGF心肌内注射处理的动物在应激时都有缺血模式的减轻，表现在ECG和超声心动上，而注射空白质粒的动物没有。这些结果也清楚地显示，在高胆固醇血症的背景中，NV1FGF的作用对心脏对应激状态的适应有帮助。
实施例21NV1FGF治疗的心肌中小动脉的诱导的证实21.1/动物本试验使用成年雄性小型猪(30kg)。共使用34只动物(预计最后每个治疗组和对照组为n＝8，共4组)。动物饲养于标准环境，给予规律饮食。Duke大学动物管理及使用委员会批准了所有程序和草案。动物所受的人类的管理，遵从由国立医学研究院(the National Society for MedicalResearch)编写的“试验动物管理原则”和由试验动物资源研究所准备，由国立卫生研究院出版的“管理及使用试验动物的指南”(NIH出版85-23，1985修订)。
动物被麻醉并经口气管插管。在整个过程中使用持续心电图和脉搏血氧(pulse-oximetric)监护，以保证心律和氧合稳定。在无菌环境下，通过第4肋间隙进行左侧前外侧胸廓切开术。心包膜被纵行分离，收缩左心耳以便暴露左旋(LCx)动脉。LCx近端被分离，以便在血管周围放置液体闭合器(hydraulic occluder)和2mm的超声血流探头(Transonic Systems，Inc.，Ithaca，NY)。血流探头放置于闭合器的远端，以便记录经过LCx的下游血流。通过一个单独的针刺切口(separate stab incision)取出闭合器和血流探头。放置20号French胸管，逐层缝合伤口。在操作结束时拔除胸管。术后3天，闭合器膨胀，使LCx的静息时血流减少到基线值的近10％，其利用植入的血流探头评价得出。动物维持该低血流状态2周，每周记录3次血流，来保证进行生理学评价前血管阻塞的程度相同。
21. 2/正电子发射成像，多巴酚丁胺应激心电图和彩色微球低血流状态32±11天后，对动物进行正电子发射成像(PET)和多巴酚丁胺应激心电图(DSE)来描述心脏的血流、代谢和功能状态，证明在LCx供血区存在缺血的存活心肌。如果LCx供血的左室侧壁和下后壁发现血流缺损，同时该区域的葡萄糖利用率正常或升高(均为与非缺血的心间隔区相比)，则PET扫描解释为冬眠的心肌。使用DSE，左室侧壁和后下壁的存活力定义为在静息时收缩力严重低下的心肌区域中，低剂量多巴酚丁胺使收缩时室壁的增厚程度的改善。如果收缩性室壁运动在应激时减弱，则认为存活区段缺血(双向性反应)。
PET和DSE确认存在缺血的心肌后进行给药，所述确认利用开胸的方式(LCx闭塞后52±16天)，通过直接心肌内注射表达FGF的质粒如NV1FGF进行。载体在10个位置用药(每个质粒载体的注射位置100μg/100ul)，分散于左室游离壁。对照组注射10次100μl的盐水。进行治疗的操作者和试验者对治疗不知情。所有的有效参数以盲法赋值，在试验结束时才公开代码。
21. 3/试验设计
21 3/实验设计 治疗后109±13天，切除心脏进行组织学分析和灌注化验。用图20所示的标准步骤制备样本。更精确地，将心脏沿3个短轴(心尖部、中部和心底部节段)切片。每个节段分为6个(中部和心底部节段)或4个(心尖部节段)朝向的区段，每个心脏总共分为16区段。然后每个区段分为3个跨浆膜的样本，一个样本被存储以备微球灌注分析，另一个在液氮制冷的异戊烷中迅速冷冻，最后一个样本在3.7％福尔马林中固定。由右心室取一个样本作为对照。
21.41组织学分析用标准步骤制备切片。每个福尔马林固定的样本用石蜡包埋，每块连续切取3张5μm的切片。每个切片用苏木精-伊红-番红花(HES)染色，用于组织病理检查评价坏死后纤维化，连续切片用抗α平滑肌肌动蛋白(SMA)抗体染色，以便识别动脉和小动脉。在成熟血管中的内皮细胞相关的外膜细胞以及平滑肌细胞均实际表达α-SMA(Benjamin et al.，Development，125，1591-1598.1998)。众所周知，某些大静脉可以被这种抗体染色，但是根据形态学标准可以很容易识别。
21.4. 1/α-SMA染色取自所有猪的所有区段均用α-SMA进行免疫组化。本步骤使用DakoEnVisionTM+/HRP(马萝卜过氧化物酶)(Horse Radish Peroxidase)检测系统(Dako，Sabattini et al.，J.Clin Pathol，51506-511，1998)。切片用抗α-SMA单克隆抗体(Dako，克隆1A4，1∶100倍稀释)保温。第二步为使用与HRP标记的聚合体偶联的山羊抗兔抗体保温。用发色二氨基联苯底物定位免疫复合物。切片用苏木精复染，脱水并用永久包埋介质进行包埋。用这种方法，免疫反应细胞显褐色，核为蓝色。
21.4.2/形态计量学分析由唯一的一个观察者进行测量，他对治疗方案不知情。对每个区段，先分析HES染色的切片，以便确定瘢痕区域(坏死后纤维化)。在低倍放大(×25)下对样本中纤维化的量进行评分，按如下分级+最小(被纤维化影向的样本表面少于5％)；++轻度(～5-15％的样本表面)+++显著(～15-25％的样本表面)++++严重(超过样本的25％)评价α-SMA染色的连续切片中的血管密度。在9个高倍显微镜视野(均为0.37mm2)中计数α-SMA染色的血管数目，所述视野位于i)瘢痕中央(3个视野)，ii)瘢痕边界(3个视野)，以及iii)远离瘢痕处，即在存活的心肌中(3个视野)。对每一个视野均记录3类血管小的单层血管，直径＜100μm的多层血管，直径＞100μm的小动脉和动脉(见图2)。根据它们的形态学特点，分析时排除被α-SMA染色的大静脉。重要的是，形态学分析中排除了大量的含有α-SMA纤维的成肌纤维细胞。
然后通过将将被注射的5个部分(BA，BAL，MA，MAL和AA区段)的数据合并来计算每个区域(瘢痕区、瘢痕边界、存活心肌)的血管密度(即每mm2内每类血管的数目)。作为附加的对照，也计算非注射区(BIL，BI，BIS，BAS，MIL，MI，MIS，MAS，AL，AI，AS区段)中的血管密度。
21.4.3/转基因表达将NV1FGF治疗的猪的BA，BAL，MA，MAL及AA区段进行FGF-1免疫组化。用经典的链霉抗生物素-生物素分析来评价FGF-1的表达。用一级多克隆抗-FGF-1兔抗体(R&D Systems，#AB-32-NA，1∶30倍稀释)保温，再用生物素酰化的驴抗兔免疫球蛋白(Amersham，1∶200倍稀释)保温。在加入与链霉抗生物素偶联的过氧化物酶后，用产色的二氨基联苯为底物来定位免疫复合物。切片用苏木精复染，脱水及用永久包埋介质进行包埋。用这种方法，免疫反应细胞显褐色，核为蓝色。在整个分析过程中，使用事先表现有高水平pCOR-CMV鼠FGF-1质粒基因转移的大鼠肌肉的阳性切片，对FGF-1 IHC的性能进行控制。
21.4.4/统计分析在不同区域中(瘢痕区、瘢痕边界、存活心肌)证明盐水组与质粒治疗组相比较，脉管系统中的数量变化，计算每类血管的算术平均数和标准差(Sd)。用单因素方差分析(ANOVA，SigmaStat，Jandel Scientific).比较组间数据。发现显著差异后，采用Dunnett′s方法相对于对照组进行多重比较。所有在p＜0.05水平的差异均被认为是显著的。
21.5/评价血管密度将用NV1FFGF处理的动物中的注射区与对照动物中的NaCl注射区的平均值进行比较(图21)。
在存活心肌中，分别对每类血管(小、中、大)进行分析。无论在何种治疗组中，均在纤维化瘢痕中观察到大量的直径＜100μm的动脉结构。仅根据形态学标准，这些血管与自然的心肌血管不能区别。它们大部分为小血管，显示单层平滑肌细胞。
与注射盐水的区域比较，给予心脏NV1FGF可在注射区域内的心肌可存活部分中诱导小的单层血管密度增加22％和20％(p＝0.017)。对于较大血管则没有显示这种影响。
这些结果清楚地显示，直接心肌内注射编码任何一种spFGF-1转基因的pCOR质粒，在缺血猪心脏中诱导了明显的单层动脉的密度增加，即具有单层平滑肌细胞的小动脉。这些结果也显示了直接心肌内注射NV1FGF后长期持续的FGF-1表达。事实上，通常位于注射位点周围的某些心肌纤维，在用药后104到132天表达可检测量的FGF-1。长期持续的表达可能有益于动脉生成和维持诱导的新血管所需的前体细胞的补充和分裂。在获取的时候，认为这些血管处于动脉生成的早期阶段。
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权利要求
1.一种方法，其用于治疗高胆固醇血症或糖尿病患者中与高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼肌的血管生成疾病或缺陷，所述方法包括给予所述患者有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒，其中VEGF-A因子表达不会在心肌或骨骼肌中诱导。
2.一种方法，其用于治疗高胆固醇血症或糖尿病患者中与高胆固醇血症或糖尿病相关的血管内皮功能不良，包括在上述患者的骨骼肌或心肌中给予一定量编码纤维母细胞生长因子的质粒，所述的量足以逆转心肌或骨骼肌的血管生成缺陷，其中VEGF-A因子表达不会在所述肌肉中诱导。
3.一种方法，其用于治疗高胆固醇血症或糖尿病患者中与高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼肌的血管生成疾病，包括将一定量编码纤维母细胞生长因子的质粒给予上述患者，所述的量足以促进所述患者的心肌或骨骼肌中的血管形成，其中VEGF-A因子表达不会在所述肌肉中诱导。
4.一种方法，其用于治疗高胆固醇血症或糖尿病患者中与高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼肌的血管生成疾病，包括给予所述患者一定量编码纤维母细胞生长因子的质粒，所述的量足以促进所述患者的心肌或骨骼肌中的成熟侧支血管和小动脉的生成。
5.一种方法，其用于促进需要所述治疗的哺乳动物受试者中的缺血心肌或骨骼肌组织中的成熟侧支血管形成，包括向所述受试者的所述组织中注射有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒，其中VEGF-A因子表达不会在所述受试者中诱导。
6.一种方法，其用于促进需要所述治疗的哺乳动物受试者中的缺血心肌或骨骼肌组织中侧支血管和小动脉的形成，所述方法包括向所述受试者的所述组织中注射有效量的编码纤维母细胞生长因子的质粒。
7.如权利要求6所述的方法，其中VEGF-A因子表达不在所述受试者的心肌或骨骼肌中诱导。
8.一种方法，其用于逆转高胆固醇血症或糖尿病患者中因高胆固醇血症或糖尿病而引起的血管生成缺陷而不诱导VEGF-A因子表达，所述方法包括向所述受试者的心肌或骨骼肌组织中注射有效量的表达纤维母细胞生长因子的质粒，以促进侧支血管和小动脉的形成。
9.一种方法，其用于促进高胆固醇血症或糖尿病的患者的心肌或骨骼肌中成熟大传导血管(＞150um的侧支血管)和小阻力动脉(＜50pm的小动脉)的形成，包括向上述肌肉中注射有效量的表达纤维母细胞生长因子的质粒。
10.如权利要求9所述的方法，其中不诱导VEGF-A因子。
11.如权利要求1至10中的任意一项权利要求所述的方法，其中质粒的注射在大腿和小腿的后部和/或前部中的骨骼肌中重复进行。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述质粒通过在所述肌肉的缺血部位周围以多次注射的方式给药。
13.如权利要求1至10中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述质粒经冠脉内、经心肌内、经胸廓、经心包或心外膜注射给予所述患者的心肌。
14.如权利要求13所述的方法，其中对心肌的给药通过在所述心肌的缺血部位周围进行多次注射或通过单次注射(one single injection)来进行。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述注射通过导管进行。
16.如权利要求15的方法，其中所述的导管是针式导管。
17.如权利要求1至16中的任意一项权利要求所述的方法，其中的纤维母细胞生长因子是FGF-1或酸性纤维母细胞生长因子。
18.如权利要求1至18中的任意一项权利要求所述的方法，其中的质粒进一步包括调节序列，编码位于FGF-1基因上游的信号肽的序列，终止信号以及位于FGF-1基因下游的多聚腺苷酸信号。
19.如权利要求1至19中的任意一项权利要求所述的方法，其中所述调节序列是CMV启动子，所述信号肽序列来源于干扰素的肽序列，多聚腺苷酸信号来源于SV40的多聚腺苷酸信号，而编码FGF-1的质粒称为NV1FGF。
20.如权利要求1至17中的任意一项权利要求所述的方法，其中将所述质粒与低分子量肝素联合用药。
全文摘要
本发明涉及编码纤维母细胞生长因子质粒的应用，其作为预防和治疗与高胆固醇血症或糖尿病相关的心肌或骨骼血管生成缺陷的治疗药物。本发明也涉及用于增强患有高胆固醇血症或糖尿病的哺乳动物受试者中心肌和骨骼的缺血组织中的侧支血管和小动脉生成的方法。本发明进一步涉及促进缺血心肌或骨骼组织中侧支血管生成的方法，该方法不诱导VEGF－A因子表达，也不引起所治疗肌肉的水肿。
文档编号A61K31/727GK1832763SQ200480022288
公开日2006年9月13日 申请日期2004年6月4日 优先权日2003年6月5日
发明者亚历克西斯·卡伦, 弗洛伦斯·伊曼纽尔, 安妮·卡伦, 弗朗科伊斯·菲尼尔斯, 桑德林·米歇莱特, 伯特兰德·施瓦茨, 迪迪尔·劳伊, 迪迪尔·布拉尼利克 申请人:森特利昂公司