专利名称：突变的人源成纤维生长因子及在治疗内分泌疾病中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及成纤维生长因子，尤其涉及突变的人源成纤维生长因子及其制备方 法，本发明还涉及该突变的人源成纤维生长因子在制备治疗内分泌疾病药物中的用途，属 于成纤维生长因子领域。
背景技术：
糖尿病是继心脑血管疾病和肿瘤之后的人类第三大杀手。随着生活模式、饮食结 构的改变，全世界糖尿病患病率呈急剧上升的趋势。预计到2030年世界糖尿病患病人数将 增至3. 66亿人，糖尿病将成为世界各个国家一个沉重的负担。对于2型糖尿病，绝大多数的患者不可避免的要用药物来治疗。其中，口服药物有 三大类第一类为黄脲类。如优降糖，糖适平，达美康，美吡达等。黄脲类药能够刺激胰岛分 泌胰岛素，但胰岛素分泌多了以后，可以引起低血糖，这对低血糖患者而言是一个不可忽视 的危险因素，而且部分药物具有较大副作用，如可引起肝功能损伤。第二类药是双胍类药。 如降糖灵和二甲双胍；双胍类药并不刺激胰岛素分泌，它刺激机体在细胞水平上提高胰岛 素的利用，但对于胰岛素分泌不足的糖尿病患者而言，其发挥的作用就很有限，而且还有乳 酸性酸中毒等不良反应。第三类药是a糖苷酶抑制剂，如拜糖平等；这类药的作用是减少人 体对饮食中糖的吸收，因为吸收减少，血糖升高也比较缓慢。但该药的主要副作用就是胃肠 反应，服用后如发生低血糖反应，还要口服或静脉注射葡萄糖。目前注射药物主要是胰岛素，注射用的胰岛素在糖尿病的治疗中发挥着重要的作 用。但也有其不足，主要为用药后心慌、表情异常、流汗等，重者产生胰岛素休克或低血糖性 惊厥；注射胰岛素的患者，经一度停药再用药时，对胰岛素的需用量愈来愈大，使患者必须 每天必须多次注射胰岛素，给患者带来很大痛苦，而且大剂量用药也加大了集体产生副作 用的机制，其原因可能是机体产生了胰岛素抗体，抗体与胰岛素结合而减弱其作用。近年来，随着人基因组序列的破译，一批具有独立调节血糖，有望成为新型治疗糖 尿病药物的蛋白被相继发现，成纤维细胞生长因子-21 (FGF-21)就是其中之一。已有大量 实验证明FGF-21是除胰岛素外，生物体内又一个能够独立调节代谢水平的蛋白因子。在已 完成的研究中发现，FGF-21能够独立促进小鼠3T3-L1脂肪细胞中的葡萄糖摄取(不论胰 岛素存在与否)，并以剂量依赖性的方式降低ob/ob和db/db小鼠以及ZDF大鼠餐后及空腹 时血中的葡萄糖、甘油三酯及糖原水平。更重要的是，在发挥作用的同时，FGF-21没有引起 低血糖等其它糖尿病治疗药物常见的副作用。FGF-21的发现为糖尿病患者尤其是糖尿病晚 期胰岛素抵抗严重的患者带来了新的希望。但是FGF-21在人体内代谢时间较短，同胰岛素 一样需要多次注射才能稳定患者血糖。因此，将FGF-21进行适当改造，在不改变其原有活性的基础上增加其稳定性及活 性，这对于将FGF-21应用于于临床具有非常重要的意义。在以往生物药物研究中，多采用 人为突变的方法进行蛋白改造，由于突变的随机性及蛋白功能的复杂性，人为突变结果往 往适得其反，浪费了大量人力和物力。
发明内容
本发明的目的之一是提供突变的人源成纤维细胞生长因子-21及其编码基因；本发明目的之二是提供含有突变的人源成纤维细胞生长因子-21基因的表达载 体或质粒以及含有该表达载体的宿主细胞。本发明目的之三是将该突变的人源成纤维细胞生长因子-21应用于制备成治疗 糖尿病的药物或药物组合物。本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的一种突变的人源成纤维细胞生长因子-21 (hmFGF-21)，其氨基酸序列为SEQ ID NO :2所示；编码该突变的人源成纤维细胞生长因子-21的核苷酸序列为SEQ ID N0:1所
7J\ ο本发明以人血细胞核酸为模板，依赖天然基因库大量克隆正常人体中FGF-21基 因，建立一个天然人FGF-21样本库。通过SSCP，RFLP等高通量的筛选方法，筛选FGF-21的 天然突变体，由于该突变体存在于正常人体内，其基因编码的突变蛋白避免了人为突变蛋 白可能的副作用如活性缺失、致癌、免疫耐受等等，节省了大量后续工作。有利于加快该蛋 白的药用开发。作为参考，一种筛选本发明所述突变的人源成纤维细胞生长因子-21的方法，包 括如下步骤以从正常人血液中提取的RNA为模版，并以此为模板克隆编码FGF-21的基因， 利用SSCP、RFLP等技术从得到的基因库中筛选FGF-21突变体，将所获得的突变基因连接到 构建好的表达载体中；将所述表达载体转化适当的宿主细胞，并进行诱导表达，活性检测。含有该突变的人源成纤维细胞生长因子-21核苷酸序列的表达载体以及含有该 表达载体的宿主细胞也当然的的包括在本发明的保护范围之内。优选的，可以将突变的人 源成纤维细胞生长因子-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中。其 中，所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)；本发明还提供了一种生产突变人FGF-21的方法，包括将突变的人成纤维细胞生 长因子-21核苷酸序列与分子伴侣相连接，再将其克隆到表达载体中，得到重组表达载体； 将该重组表达载体转化至宿主细胞中；诱导表达FGF-21，分离纯化FGF-21，利用蛋白酶切 除与其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。优选的，所述的表达载体可以是pET_30a(+)，所述的宿主细胞可以是 Transetta(DE3)；所述的分子伴侣优选为小分子泛素样修饰蛋白(SUMO)；其中，所述的纯化包括将酶切后的蛋白进行树脂亲和层析，依次经洗涤、洗脱、脱盐。动物学试验结果表明，本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21相比于野生型 成纤维细胞生长因子-21，能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明突变的人 源成纤维细胞生长因子-21在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。 本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢 紊乱等内分泌疾病。
图1 hmFGF-21基因构建设计图。
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图2 hmFGF-21和hFGF_21调节细胞葡萄糖代谢的试验结果；*P < 0. 05为差异显 著，**P < 0. 001为差异极显著。图3不同蛋白处理3T3-L1脂肪细胞影响GLUTl的表达含量结果。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明本发明中涉及的基因的设计、合成和克隆，表达载体的构建，核酸提取及 序列分析及鉴定，以及表达产物的分离和纯化等操作步骤，可按照本领域已知的技术进行 (参见CURRENT PROTOCOLS I匪OLECULAR BIOLOGY)。若未特别指明，实施例中所用的技术 手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1 hFGF-21基因的克隆根据hFGF-21基因去除信号肽的氨基酸序列，设计引物，通过互补延伸的方法获 得去除信号肽的人reF-21基因。利用在线软件Primer5. 0设计hFGF-21引物。以提取的正常人肝总RNA为模板，01 i go (dT) 15为引物，参照M-MLV反转录酶 M-MLVRT说明书进行cDNA第一条链合成，反应体系和具体操作分别如下Oligo(ClT)151. 0μ 1
模板5. 0μ 1
DEPC-H2O7. 0μ 1
70°C水浴5min，冰上放置5min，依次加入
RNasin1. 0μ 1
5XM-MLVRT buffer5. 0μ 1
dNTPs5. 0μ 1
M-MLVRT1. 0μ 1
37°C水浴2h，70°C水浴15min，取2μ 1用于PCR扩增反应。增mFGF-21成熟多肽cDNA, PCR反应(50 μ 1体系)如下
10XPCR butfer5. 0μ 1
dNTPs4. 0μ 1
模板2. 0μ I(IOng)
Pl1. 0μ I(IOpmol)
P21. 0μ I(IOpmol)
rTaq 酶0. 5μ 1
ddH2036. 5μ 1
其中，引物Pl和P2的具体序列如下
Pl ccgctcgagaaaagacaccccatccctgactccagt ；
P2 gaagatcttcaggaagcgtagctggggcttcgg
混勻后进行PCR扩增。循环参数为:941预变性51^11，941Imin的顺序，25个循环后，72°C再延伸lOmin。最终得到全长的hFGF_21基因。实施例2 hmFGF-21基因的克隆1. hmFGF-21基因的构建设计设计六条引物，运用重叠PCR方法构建hmFGF-21蛋白基因(如图3_1)。六条引物 设计如下
权利要求
一种突变的人源成纤维细胞生长因子 21，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO2所示。
2.编码权利要求1所述的突变的人源成纤维细胞生长因子-21基因，其特征在于其 核苷酸序列为SEQ ID NO 1所示。
3.含有权利要求2所述突变的人源成纤维细胞生长因子-21基因的表达载体。
4.含有权利要求3所述表达载体的宿主细胞。
5.一种制备权利要求1所述的人源成纤维细胞生长因子_2的方法，包括将编码该突 变的人成纤维细胞生长因子-21核苷酸序列与分子伴侣相融合，得到融合基因；将融合基 因可操作的与表达载体相连接，得到重组表达载体；将该重组表达载体转化至宿主细胞中； 诱导表达成纤维细胞生长因子-21，分离纯化成纤维细胞生长因子-21，利用蛋白酶切除与 其融合表达的分子伴侣部分，纯化，即得。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于所述的分子伴侣为小分子泛素样修饰蛋白。
7.按照权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的纯化包括将酶切后的蛋白进行树 脂亲和层析，依次经过洗涤、洗脱、脱盐。
8.一种治疗内分泌疾病的药物组合物，包括治疗上有效量的权利要求1所述的突变 的人源成纤维细胞生长因子-21和药学上可接受的载体或辅料。
9.权利要求1所述的突变的人源成纤维细胞生长因子-21在制备治疗内分泌疾病药物 中的用途。
10.按照权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的内分泌疾病包括糖尿病，代谢综 合症或脂代谢紊乱。
全文摘要
本发明公开了突变的人源成纤维生长因子及其在治疗内分泌疾病中的用途。本发明突变的人源成纤维细胞生长因子-21的氨基酸序列为SEQ ID NO2所示，其编码基因序列为SEQ ID NO1所示。本发明以人血细胞核酸为模板，依赖天然基因库大量克隆正常人体中FGF-21基因，建立天然人FGF-21样本库，通过高通量的筛选方法，筛选得到FGF-21的天然突变体。动物学试验结果表明，本发明突变的FGF-21能够更加有效降低动物体内的血糖水平，此外，本发明突变体在降低血糖水平方面还具有起效快、药效持续时间长等优点。本发明突变的FGF-21可作为药物治疗糖尿病，代谢综合症或脂代谢紊乱等内分泌疾病。
文档编号C12N1/15GK101935346SQ201010261030
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者任桂萍, 刘铭瑶, 李德山, 王文飞, 高华山 申请人:哈尔滨市哈科隆生物制药研究所