结缔组织生长因子抗体的制作方法

专利名称：结缔组织生长因子抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及结合结缔组织生长因子(CTGF)的抗体。所述抗体特别针对参与各种疾病相关的生物学活性的CTGF区域。
背景
结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor，CTGF)
CTGF是一种最初分离自人脐静脉内皮细胞地36kD富含半胱氨酸的肝素结合分泌糖蛋白(参见例如，Bradham et al.(1991)J Cell Biol1141285-1294；Grotendorst and Bradham，美国专利No.5,408,040)。CTGF属于蛋白质CCN(CTGF，Cyr61，Nov)家族(分泌糖蛋白)，该家族包括血清诱导的立即早期基因产物Cyr61、推断的癌基因Nov、ECM相关蛋白FISP-12、src诱导的基因CEF-10、Wnt诱导的分泌蛋白WISP-3以及抗增殖蛋白HICP/rCOP(Brigstock(1999)Endocr Rev 20189-206；O′Brian et al.(1990)Mol Cell Biol 103569-3577；Joliot et al.(1992)Mol Cell Biol 1210-21；Ryseck et al.(1990)Cell Growth andDiff 2225-233；Simmons et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA861178-1182；Pennica et al.(1998)Proc Natl Acad Sci USA，9514717-14722；和Zhang et al.(1998)Mol Cell Biol 186131-6141)。CCN蛋白的特征在于保守的38个半胱氨酸残基，该38个半胱氨酸残基占总氨基酸含量10％以上并且形成具有N-末端和C-末端结构域的模块结构(modular structure)。CTGF模块结构包括在N-末端结构域的针对胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-BP)和von Willebrand因子(VWC)的保守基序，以及在C-末端结构域的血小板反应蛋白(TSP1)和半胱氨酸结基序。
CTGF表达由转化生长因子β(TGFβ)超家族的成员诱导，该超家族包括TGFβ-1、-2、和-3、骨形态发生蛋白(BMP)-2和活化素以及许多其它调节性调节剂包括地塞米松、凝血酶、血管内皮生长因子(VEGF)和血管紧张肽II；以及由环境刺激包括高血糖和高血压诱导(参见例如，Franklin(1997)Int J Biochem Cell Biol 2979-89；Wunderlich(2000)Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 238910-915；Denton and Abraham(2001)Curr Opin Rheumatol 13505-511；andRiewald(2001)Blood 973109-3116；Riser et al.(2000)J Am SocNephrol 1125-38；和国际公开WO 00/13706)。TGFβ对CTGF表达的刺激快速并长期，而且无需持久施加(Igarashi et al.(1993)Mol BiolCell 4637-645)。TGFβ导致的CTGF的增强表达包括通过存在于CTGF启动子中的DNA调控元件进行的转录激活(Grotendorst et al.(1996)Cell Growth Differ 7469-480；Grotendorst and Bradham，U.S.Patent No.6,069,006；Holmes et al.(2001)J Biol Chem 27610594-10601)。
已经表明CTGF增强α1(I)胶原蛋白、α5整联蛋白和纤连蛋白mRNA的稳态转录，以及促进培养的各种细胞类型的包括增殖和趋化作用在内的细胞过程(参见例如，Frazier et al.(1996)J Invest Dermatol107406-411；Shi-wen et al.(2000)Exp Cell Res 259213-224；Klagsbum(1977)Exp Cell Res 10599-108；Gupta et al.(2000)KidneyInt 581389-1399；Wahab et al.(2001)Biochem J 359(Pt 1)77-87；Uzelet al.(2001)J Periodontol 72921-931；and Riser and Cortes(2001)RenFail 23459-470)。在新生小鼠中皮下注射CTGF导致肉芽组织的局部沉积。类似地，TGFβ的皮下注射导致肉芽组织形成并在局部成纤维细胞中诱导高水平CTGF mRNA。另外，用TGFβ和CTGF组合处理或依次处理导致发生更持久肉芽肿(Mori et al.(1999)J Cell Physiol181153-159)。因此，看起来CTGF介导由TGFβ引发的效应的一个亚集合，特别是胞外基质(ECM)的产生和沉积。另外，应答CTGF的能力或者CTGF应答程度可依赖于能使得产生细胞“相容性”的由TGFβ处理所提供的引发刺激(国际公开WO 96/08140)。
尽管已鉴定了调节组织组成的一系列相互作用因子，现在对CTGF在调节骨骼发育、伤口愈合和胞外基质(ECM)重构、纤维化、肿瘤发生和血管发生中的作用日渐关注。例如，在肝硬化、肺纤维化、炎症性肠病、硬皮症和瘢痕形成、结缔组织生成、动脉粥样斑块中已观察到升高的CTGF表达。(Abraham et al.(2000)J Biol Chem 27515220-15225；Dammeier et al.(1998)Int J Biochem Cell Biol 30909-922；diMola et al.(1999)Ann Surg 230(1)63-71；Igarashi et al.(1996)J Invest Dermatol 106729-733；Ito et al.(1998)Kidney Int 53853-861；Williams et al.(2000)J Hepatol 32754-761；Clarkson et al.(1999)Curr Opin Nephrol Hypertens8543-548；Hinton et al.(2002)Eye16422-428；Gupta et al.(2000)Kidney Int 581389-1399；Riser et al.(2000)J Am Soc Nephrol 1125-38.)
CTGF在肾小球性肾炎、IgA肾病、间灶性和节段性肾小球硬化症和糖尿病性肾病(参见例如，Riser et al.(2000)J Am Soc Nephrol 1125-38)中也被增量调节。在慢性肾小管间质(tubulointerstitial)损伤部位也观察到表达CTGF的细胞数增加，并且CTGF水平与损伤程度相关(Ito et al.(1998)Kidney Int 53853-861)。另外，在与肾实质瘢痕化和硬化相关的各种肾病中，CTGF表达在肾小球和肾小管间质中也增加。CTGF的升高水平也与肝纤维化、心肌梗死和肺纤维化相关。例如，在患有自发性肺纤维化(IPF)患者中，CTGF在生物活检和支气管肺泡灌洗液细胞中被强烈增量调节(Ujike et al.(2000)BiochemBiophys Res Commun 277448-454；Abou-Shady et al.(2000)Liver 20296-304；Williams et al.(2000)J Hepatol 32754-761；Ohnishi et al.(1998)J Mol Cell Cardiol 302411-22；Lasky et al.(1998)Am JPhysioT275L365-371；Pan et al.(2001)Eur Respir J 171220-1227；and Allenet al.(1999)Am J Respir Cell Mol Biol 21693-700)。因此，CTGF代表了在例如如上所述那些疾病中的有效的治疗靶。
已经公认CTGF与这些疾病各个方面的相关性，并且通过调节CTGF治疗疾病的方法也已经被描述(参见例如，Grotendorst andBradham，美国专利5,783,187；国际公开WO00/13706；国际公开WO03/049773)。生长因子、细胞因子和细胞表面受体的调节可使用单克隆抗体进行，并且已经批准或正在开发几种治疗性单克隆抗体。(参见例如，Infliximab(Remicade；Maini et al.(1998)Arthritis Rheum 411552-1563；Targan et al.(1997)N Engl J Med 3371029-1035)；Basiliximab(Simulect)and Daclizumab(Zenapax)(Bumgardner et al.(2001)Transplantation 72839-845；Kovarik et al.(1999)Transplantation681288-1294)；and Trastuzumab(Herceptin；Baselga(2001)Ann Oncol12 Suppl 1S49-55.))
已经针对CTGF产生了抗体，并且已经证明在体内例如抑制血管发生方面是有效的。(参见例如，Grotendorst and Bradham，美国专利5,408,040；国际公开WO99/07407；Shimo et al.(2001)Oncology 61315-322)。另外，CTGF的调节性质看起来能区分参与特异生物学活性的各结构域。例如，CTGF的N末端的一半已表明刺激细胞分化和ECM产生，而C-末端的一半刺激细胞增殖。(参见例如国际公开WO00/35936和WO00/35939；Brigstock and Harding，美国专利5,876,70。)这证实针对CTGF分子不同区域的抗体显示出在调节CTGF生物学活性方面不同的作用。(参见例如国际公开WO00/35936和WO00/35939)。目前，没有清楚地区分产生所需效果的抗CTGF抗体以及产生多重效果的或者是非中和性的抗体(参见例如国际公开WO99/33878)。
现有技术中显然需要有效中和疾病中的CTGF活性的药剂。抗体特别是单克隆抗体提供了适于治疗剂的特异性和药物动力学谱，靶向CTGF的特异活性的中和抗体将会满足本领域的需要并会用于CTGF相关疾病的治疗，所述疾病包括肺部疾病如自发性肺纤维化(IPF)等；肾脏疾病如糖尿病性肾病、肾小球硬化症等；和眼病如视网膜病、黄斑变性等。
发明概述
本发明提供了特异性地结合CTGF多肽的N-末端片段上一个区域的抗体，特别是单克隆抗体，及其部分。
一方面，本发明的抗体特异性地结合人CTGF(SEQ ID NO2)的一个区域，如从大约氨基酸103至氨基酸164(SEQ ID NO21)、更具体地从大约氨基酸135至氨基酸157(SEQ ID NO22)、更具体地从大约氨基酸142至氨基酸154(SEQ ID NO25)，或者特异性地结合衍生自另一物种的CTGF上的直向同源区域。在特定的实施方案中，所述抗体具有与ATCC保藏号＿＿的细胞系(于2004年5月19日保藏于ATCC)产生的抗体相同的特异性。在具体的实施方案中，所述抗体基本上与下述mAb1相同。更优选地，所述抗体基本上与下述CLN1相似。在另一个实施方案中，本发明的抗体与上述任一个抗体竞争结合CTGF多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了一种单克隆抗体或其部分，其包含选自如下一组的至少一个成员，所述的组由包含SEQ ID NO14的免疫球蛋白重链序列、包含SEQ ID NO14的可变区的免疫球蛋白重链序列、包含SEQ ID NO20的免疫球蛋白轻链序列、包含SEQ IDNO20的可变区的免疫球蛋白轻链序列、或其保守变体组成。在一个具体实施方案中，所述抗体包含一免疫球蛋白重链可变区，即SEQ IDNO14的氨基酸残基1至氨基酸残基167。在另一个具体实施方案中，所述抗体包含一免疫球蛋白轻链可变区，即SEQ ID NO20的氨基酸残基1至氨基酸残基136。在一特定实施方案中，所述抗体包含SEQID NO14的免疫球蛋白重链序列和SEQ ID NO20的免疫球蛋白轻链序列。在这一实施方案中，本发明特别提供了CLN1抗体或其包含至少CLN1的抗原结合区残基的部分。
在某些方面，本发明的抗体是多克隆抗体。在其它方面，所述抗体是单克隆抗体。在某些实施方案中，所述抗体是人源化的的单克隆抗体；更优选地是人单克隆抗体。任一种上述抗体可额外含有各种量的糖基化，其通过产生抗体的细胞而掺入、或合成地施加和/或修饰；或者所述抗体不具有糖基化。所述抗体可任选地被聚乙二醇化和/或类似地修饰以增加血浆半衰期等。在各种实施方案中，本发明提供了所述抗体的片段，特别是其中所述片段是Fab、F(ab)2或Fv片段。
在某些方面，所述抗体或其部分由克隆的细胞系产生。所述细胞系可以来自用于单克隆抗体生产的任何动物模型，包括但不限于小鼠、山羊、鸡等。特别地，所述细胞系可来自小鼠。所述小鼠可以是用于抗体生产的标准小鼠，例如BALB/C，或者被优化或开发用于生产特异的同种型、独特型、或物种特异性单克隆抗体的修饰的例如转基因的小鼠品系。在一个实施方案中，所述细胞系是产生和分泌mAb1的杂交瘤细胞系。在其它实施方案中，所述细胞系产生和分泌具有与mAb1基本上等价的性质的抗体或其部分。在其它实施方案中，所述细胞系产生和分泌具有与CLN1基本上等价的性质的抗体或其部分。在特定的实施方案中，本发明提供了ATCC保藏号＿＿＿(保藏日2004年5月19日)的细胞系。
另一方面，所述抗体或其部分衍生自能够产生人抗体的非人转基因动物，特别是非人转基因哺乳动物。所述动物可以是任何物种，包括但不限于小鼠、鸡、牛、山羊等。特别地，所述动物可以是小鼠。这类抗体可通过用人CTGF的片段例如SEQ ID NO21或更特异地SEQ ID NO22或来自非人物种的CTGF上的直向同源区免疫非人转基因哺乳动物而获得。在某些实施方案中，抗体通过用选自由SEQ IDNO23-26组成的一组的一个CTGF片段或来自一非人物种的CTGF上的直向同源区免疫非人转基因哺乳动物而获得。在具体的实施方案中，所述抗体通过用上述任一种CTGF片段免疫转基因小鼠而获得。在其它实施方案中，所述抗体通过用上述任一种CTGF片段的功能等价物免疫转基因小鼠而获得。
“特异性结合CTGF上的一个区域”是指抗体对CTGF上一特定区域具有结合特异性，该特定区域可以由一线性氨基酸序列限定，或通过CTGF多肽一部分的三级即三维构象而限定。结合特异性是指抗体对CTGF一部分的亲和性实质高于其对其它相关多肽的亲和性。“实质较高的亲和性”是指相比于对其它相关多肽的亲和性，对于CTGF一部分的亲和性有可测量的增加。优选地，对于CTGF特定一部分的亲和性是对其它蛋白质的亲和性的至少1.5倍、2倍、5倍、10倍、100倍、103倍、104倍、105倍、106倍或更高。优选地，结合特异性通过亲和层析、免疫沉淀或通过体外结合测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)或通过荧光激活细胞分选(FACS)分析而确定。更优选地，所述结合特异性如下所述通过RIA或亲和层析获得。
在本发明的优选的实施方案中，抗体具有等于或高于通过例如Munson and Pollard(1980，AnalBiochem 107220)的斯卡查德(Scatchard)分析而确定的如下所述的mAb1的亲和性。抗体亲和性定义为一个抗体上的一个单一抗原结合位点与一个抗原上的一个单一表位之间的总的非共价相互作用的强度。亲和性通过测量缔合常数(Ka)而计算，即
其中[Ab]是抗体上游离抗原结合位点的浓度，[Ag]是游离抗原浓度，[Ab·Ag]是抗体上的由抗原占据的抗原结合位点的浓度，Kd是抗体-抗原复合物的解离常数。优选地，本发明的抗体对CTGF的亲和性高于Kd＝10-8，优选地高于10-9，优选地高于10-10，特别是用于治疗目的。有利地，本发明的抗体具有类似于或高于mAb1的亲和性(即Kd≤10-9)。但是，与mAb1共享表位结合但具有比mAb1低的亲和性(即较高Kd)的抗体也包括在本发明内并潜在用于如本文所述的各种分析和诊断应用中。这类抗体还可另外用于治疗性应用，特别是如果它们如下所述具有对抗原的高亲合力(avidity)。
本发明的抗体可以是单价、二价或者它们可以是多价的。在本发明的某些实施方案中，优选的是本发明的抗体是二价或多价的。本发明的任何抗体均可被操作以改善亲合力，例如通过将表位结合位点组合在一个单一抗体构建体例如一个tribody等中进行。本发明的抗体可以是单链抗体。
在某些情况下，本发明的抗体显示出对来自其它物种的CTGF的合适的亲和性是有用的，例如，用于在那些物种中治疗和预防疾病。例如，显示对犬CTGF具有合适Kd的本发明抗体可用于治疗狗中的CTGF相关疾病。显示跨物种亲和性的本发明抗体如mAb1也可用作研究工具，以在各种动物模型中研究CTGF相关疾病。另一方面，抗体或其部分由最初源自人的遗传材料编码。所述抗体可以例如用噬菌体展示技术由培养的细胞产生，或者可在动物、例如含有源自人的免疫球蛋白基因的非人转基因动物中产生。
另外，本发明提供了重组构建体，其包含上述本发明任何抗体的部分以及来自另一来源的蛋白质。特别包括的是涵盖了嵌合抗体的实施方案，所述嵌合抗体包含源自特异结合CTGF的N-末端片段上一个区域的单克隆抗体的可变区以及源自另一来源的恒定区。可变区可以源自本发明限定的任何抗体，特别包含与人CTGF上的如下区域结合的抗体，所述区域为SEQ ID NO2的从大约氨基酸97至大约氨基酸180，或者更特别地，SEQ ID NO2的从大约氨基酸103至大约氨基酸164，或者更特别地，SEQ ID NO2的从大约氨基酸134至大约氨基酸158，或者更特别地，SEQ ID NO2的从大约氨基酸143至大约氨基酸154，或者与来自另一物种的CTGF上的直向同源区域结合的抗体。所述恒定区可源自任何来源。在某些实施方案中，所述恒定区源自人免疫球蛋白的恒定区。
本发明还提供了上述任何一种抗体，其中所述抗体额外包含能本身提供或与其它物质一起提供可检测信号的标记试剂。这类标记试剂可以选自但不限于由酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、亲和素和放射性同位素组成的一组。本发明还提供了上述任一种抗体，其中所述抗体额外包含细胞毒剂或酶。
在其它实施方案中，如上所述的本发明抗体额外中和与CTGF相关的至少一种活性。这些与CTGF相关的活性包括但不限于刺激细胞迁移、细胞在体内或体外产生胞外基质、和/或在对象中降低纤维化。在特定的实施方案中，所述生物学活性选自由细胞生长、成纤维细胞和/或内皮细胞的分化、以及参于胞外基质形成和重构的蛋白质表达的诱导，所述蛋白质例如为胶原蛋白(包括但不限于I、II、III和IV型)和纤连蛋白。
在某些实施方案中，抗体在回体(ex vivo)测定中特异性地抑制细胞迁移。优选地，抗体在Boyden小室测定中抑制CTGF刺激的平滑肌细胞的趋化迁移。例如，在以下描述的细胞迁移测定中，本发明的抗体重复地并可再现地抑制CTGF诱导的迁移。在各种实施方案中，所述抗体特异地降低动物模型中的纤维化。优选地，所述抗体抑制肺和肾纤维化动物模型中的纤维化的发展。例如，通过如下所述对肺羟脯氨酸(胶原蛋白)积累和/或组织制备物的组织学检查所测定的，抗体使小鼠中博来霉素(bleomycin)诱导的肺纤维化减弱了60-70％。另外，抗体在大鼠残肾(即5/6肾切除)模型中以及在单侧输尿管梗阻(UUO)后的小鼠降低胶原蛋白的积累，如下所述。
在其它实施方案中，本发明的抗体调节CTGF多肽与细胞受体之间、和/或CTGF多肽与分泌的或膜相关的辅因子之间的相互作用，由此中和CTGF的生物学活性。辅因子可以是任何蛋白质、碳水化合物、和/或脂质；在特定的实施方案中，辅因子是生长因子TGF-β家族的成员，例如TGF-β、BMP-4等。
在另一个方面，抗体降低对象中的纤维化。在各种实施方案中，所述对象是组织或器官。在其它实施方案中，对象是动物、优选是哺乳动物、最优选是人。当所述对象是组织时，本发明特别包括内源组织和回体(ex vivo)组织，例如移植组织、培养生长的组织等。在各种实施方案中，所述组织选自由上皮、内皮和结缔组织组成的一组。当所述对象是器官时，本发明特别包括选自由肾、肺、肝、眼、心脏和皮肤组成的一组的器官。在优选的实施方案中，所述对象是动物，特别是哺乳动物物种的动物包括大鼠、兔、牛、羊、猪、鼠、马和灵长类物种。在最优选的实施方案中，对象是人。
在具体的实施方案中，抗体用于在患有CTGF相关疾病或处于患病风险的对象中治疗或预防CTGF相关疾病。这些疾病包括但不限于各种癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌(breastcancer)、乳腺瘤(breast carcinoma)、胶质瘤和成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤、结缔组织生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症和肝癌以及其它肿瘤生长和转移。CTGF相关疾病还包括各种纤维化疾病，包括但不限于自发性肺纤维化、肾纤维化、肾小球硬化症、眼纤维化(ocular fibrosis)、骨关节炎、硬皮病、心脏纤维化、和肝纤维化。纤维化可发生在任何器官或组织内，包括选自但不限于肾、肺、肝、心脏和皮肤的器官；或选自但不限于上皮、内皮和结缔组织的组织。在其它实施方案中，CTGF相关疾病可由任何起始因子导致，包括但不限于接触化学品或生物剂、炎症应答、自身免疫反应、创伤、手术程序等。CTGF相关疾病还包括但不限于由于高血糖和高血压引起的疾病。这些疾病可例如由于糖尿病、肥胖等发生，并包括糖尿病性肾病、视网膜病和心血管疾病。
因此，在各种实施方案中，本发明提供了可用于治疗或预防对象中的CTGF相关疾病的抗体。本发明还提供了这些抗体在制备用于治疗CTGF相关疾病的药物中的应用。
在另一方面，本发明提供了中和CTGF相关活性的方法，包括将本发明的抗体与CTGF多肽接触，由此中和CTGF的生物学活性，如上所述。生物学活性可以是CTGF的任何活性，包括但不限于刺激细胞迁移和产生胞外基质。在各种实施方案中，中和在体外发生。在其它实施方案中，中和在对象体内发生。
在另一方面，本发明提供了使用如上所述抗体在需要的患者中治疗CTGF相关疾病的方法，所述方法包括将抗体或其药物学配制品给予患者，由此治疗所述疾病。所述对象可以是诊断患有或疑似患有CTGF相关疾病的患者，所述疾病包括例如导致胞外基质过量产生的疾病。在特定的方面，CTGF相关疾病选自癌症或纤维化疾病。癌症包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌(breastcancer)、乳腺瘤(breast carcinoma)、胶质瘤和成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤、结缔组织生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症和肝癌，纤维化疾病包括但不限于自发性肺纤维化、肾纤维化、肾小球硬化症、眼纤维化、黄斑变性、骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭、心脏纤维化和肝纤维化。在其它实施方案中，CTGF相关疾病可由任何起始因子导致，这些因子包括但不限于接触化学品和生物剂、炎症应答、自身免疫疾病、创伤、手术程序等。CTGF相关疾病还包括但不限于由于高血糖和高血压引起的疾病。这些疾病可例如由于糖尿病、肥胖等发生，并包括糖尿病性肾病、视网膜病和心血管疾病。
在另一方面，本发明提供了包括如上所述抗体和至少一种其它组分的组合物。组分可包括任何化合物、分子或活性剂，包括例如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质等。另外，组分可包括各种溶剂、盐和其它载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物，其包括如上所述抗体和至少一种选自溶剂、稳定剂和赋形剂的额外组分。在一特定实施方案中，所述药物组合物包括与药物学可接受载体混合的抗体。所述药物组合物可额外含有第二种治疗剂，例如血管紧张肽转化酶(ACE)抑制剂、晚期糖化终末产物裂解或抑制剂等。本发明还提供了用于治疗具有CTGF相关疾病的对象的包含如上所述抗体的药物。这类疾病包括但不限于各种癌症和纤维化疾病；产生自如心肌梗死、关节炎和炎症等病变的疾病；和由糖尿病、肥胖等所致的疾病，其可包括糖尿病性肾病、视网膜病和心血管病等。
在另一实施方案中，本发明提供了选自由SEQ ID NO14、SEQ IDNO14的氨基酸1至氨基酸167、SEQ ID NO20和SEQ ID NO20的氨基酸1至氨基酸136组成的一组的一种多肽序列。本发明还涵盖这些多肽的保守变体。在另一实施方案中，本发明提供了选自由SEQ IDNO21-26组成的一组的人CTGF的特异性片段，以及得自非人物种的直向同源CTGF片段。
上述多肽可以是“改变的”多肽，如下述定义。
在另一实施方案中，本发明提供了编码本发明的抗体或其部分的多核苷酸序列。在特定的实施方案中，所述多核苷酸序列选自如下一组编码SEQ ID NO14的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO14的氨基酸1至氨基酸167的多核苷酸序列、SEQ ID NO13的多核苷酸序列、以及包含SEQ ID NO13的核苷酸1至核苷酸501的多核苷酸。在其它实施方案中，所述多核苷酸序列选自如下一组编码SEQ IDNO20的多核苷酸序列、编码SEQ ID NO20的氨基酸1至氨基酸136的多核苷酸序列、SEQ ID NO19的多核苷酸序列、以及包含SEQ IDNO19的核苷酸1至核苷酸408的多核苷酸。
上述多核苷酸可以是“改变的”多核苷酸，如下述定义。
本发明还提供了重组多核苷酸，其包含与一种含有复制和转录控制序列的载体序列可操纵地连接的上述任一种多核苷酸序列。在一方面，所述重组多核苷酸编码SEQ ID NO14的氨基酸序列或其中的可变区。在另一方面，所述重组多核苷酸包含SEQ ID NO13。在另一方面，所述重组多核苷酸编码SEQ ID NO20的氨基酸序列或其中的可变区。在另一方面，所述重组多核苷酸包含SEQ ID NO19。
本发明还提供了用至少一种如上所述的重组多核苷酸转染的宿主细胞。宿主细胞包括任何原核和真核宿主细胞，包括，例如通过本领域技术人员已知的培养方法维持的克隆细胞系。宿主细胞还包括衍生自转化的细胞例如干细胞的转基因植物和动物。在一个实施方案中，所述宿主细胞包含用编码SEQ ID NO14的多核苷酸和编码SEQID NO20的多核苷酸共转染的细胞，其产生具有与mAb1基本上相同的特征的功能性抗体。在特定的实施方案中，所述抗体是CLN1。在另一特定的实施方案中，所述宿主细胞为ATCC保藏号＿＿(保藏日2004年5月19日)。
本发明的这些和其它实施方案参照本文的描述将易于为本领域技术人员理解，所有这些实施方案均被特别涉及。
附图简述


图1A和1B显示了结缔组织生长因子的结构和序列保守性。图1A示出CTGF的模块结构域结构，其包括在N-末端片段中的对于胰岛素样生长因子结合蛋白(IGF-BP)和Von Willebrand’s因子(VWC)的保守基序，以及在C-末端片段中的对于凝血栓蛋白(TSP1)和半胱氨酸结基序(CT)的保守基序。图1B显示出人CTGF(hCTGF)、牛CTGF(bCTGF)、猪CTGF(pCTGF)、大鼠CTGF(rCTGF)和鼠CTGF(FISP12)直向同源物之间的多序列对比。该对比用CLUSTAL W程序(版本1.74；Thompson et al，(1994)Nucleic Acids Res 224673-4680)使用默认参数产生。在图中星号(*)表示该氨基酸残基在所显示的物种中完全保守。
图2A和2B分别显示出标记的和未标记的人CTGF与抗CTGF抗体mAb2和mAb1的竞争结合的斯卡查德(Scatchard)图。mAb1是本发明的示范性抗体。
图3A显示出由SDS-PAGE所证实的、得自相应的IgG抗体mAb1的木瓜蛋白酶消化及随后A蛋白-琼脂糖亲和层析的Fab抗体片段(Mr45kD)(泳道2)。图3B显示出随着离液剂(硫氰酸盐)浓度增加，Fab片段和相应IgG与CTGF的结合。
图4A和4B分别显示出标记的重组人CTGF和未标记的大鼠CTGF与抗CTGF抗体mAb2和mAb1的竞争结合的斯卡查德(Scatchard)图。
图5A、5B和5C显示出本发明的抗体在肺间质纤维化模型中的治疗益处。图5A显示抗体治疗对小鼠肺中博来霉素诱导的羟脯氨酸含量增加的作用。每组动物数在每一条形图下面的括号中表示，治疗组沿x轴表示出。SA盐水；BL博来霉素；AbsJ本发明的3种单克隆抗体的集合；mAb1本发明的示范性抗体。数值以平均值±SE表示。图5B和5C分别显示出来自经气管内注射而接触博来霉素并且随后用盐水或本发明的抗体治疗的小鼠的肺近端细叶(pulmonaryproximal acini)的苏木精和曙红染色的石蜡切片。在图5B中，薄的肺泡隔细叶(interalveolar septa acinus)具有异常表观，并且存在炎性细胞和纤维化。在图5C中，大部分实质是正常的，仅有中等程度的肺泡隔增厚。
图6A、6B和6C示出了本发明抗体在肾中的肾小管间质纤维化模型中的治疗益处。图6A显示在用本发明抗体mAb1或针对CTGF的C-末端的抗体mAb3治疗后由于单侧输尿管梗阻(UUO)所致纤维化降低。纤维化程度以与对侧未梗阻的肾相比梗阻肾中羟脯氨酸与脯氨酸的比率来表示(平均值±SE)。图6B和6C分别显示接受盐水或抗体治疗的梗阻肾的三色染色的石蜡切片。
图7A和7B显示本发明的抗体在肾中的肾小球纤维化模型中的治疗益处。图7A和7B分别显示在接受盐水或抗体治疗后三色染色的残肾组织的光学显微镜照片。
图8A、8B、8C、8D、8E、8F和8G显示出在新生小鼠中诱导局部皮下肉芽肿。在左侧，图8A和8B分别显示在皮下单独注射TGFβ或者注射TGFβ和CTGF的部位肉芽肿的形成。在右侧，图8C至8G显示代表用于评价抗体的治疗益处的评分系统(从0(正常)至4(纤维化))的组织学组(panel)。
图9显示出用或未用抗CTGF抗体治疗的局部皮下肉芽肿模型中的纤维化程度。mAb1是本发明的示范性抗体，而mAb3是与C末端CTGF表位特异结合的抗CTGF抗体。
图10A、10B、10C和10D显示出本发明的抗体对全身性硬化症模型中器官纤维化的治疗益处。每一组显示出在用盐水(对照)、TGFβ和CTGF或与抗体治疗同时的TGFβ和CTGF治疗后在各个器官中胶原蛋白积累的变化。
图11A和11B显示了克隆本发明的示范性抗体mAb1的免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链的流程示意图。图11A显示用于确定mAb1重链编码序列(CDS)的重链PCR片段的对比。图11B显示出用于确定mAb1轻链编码序列(CDS)的轻链PCR片段的对比。
图12A和12B显示出CTGF和TGFβ之间的结合研究。图12A显示出在存在或不存在抗CTGF抗体的条件下，TGFβ与CTGF、由外显子3编码的CTGF片段(外显子3)或由外显子5编码的CTGF片段(外显子5)之间的结合程度。图12B显示出抗CTGF抗体抑制TGFβ和CTGF的相互作用的程度。在图中，抗体包括本发明的示范性抗体mAb1和mAb4以及与C-末端CTGF表位特异结合的抗体mAb3。
发明详述
在描述本发明组合物和方法之前，应理解的是本发明不限于所描述的特定的方法学、方案、细胞系、测定和试剂，因为它们可以改变。也应理解本文所用术语意在描述本发明的特定实施方案，不是为了限制权利要求书所示的本发明的范围。
必须注意，除非上下文有清楚指示，否则本文和权利要求书中所用的单数形式“一个”和“所述”包括复数形式。因此，例如，“一个片段”包括多个这类片段，“一个抗体”指代一或多个抗体及本领域技术人员已知的所述抗体的等价物，等等。
除非另有说明，本文所用所有技术和科学术语具有发明所属领域普通技术人员所通常了解的相同含义。尽管类似于或等价于本文描述的任何方法均可在实施和测试本发明中使用，但是现在描述的是优选的方法、装置和材料。本文引用的所有出版物以其全文引入本文作参考，其目的是描述和公开出版物中报道的方法学、试剂和工具，它们可用于本发明。本文中的任何内容均不应被视为承认本发明不先于根据在先发明的这种公开。
除非特别指明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药学的本领域内的常规方法。这些技术在文献中有充分解释。参见例如Gennaro，A.R.，ed.(1990)Remington′s Pharmaceutical Sciences，18th ed.，Mack Publishing Co.；Colowick，S.et al.，eds.，Methods In Enzymology，Academic Press，Inc.；Handbook of Experimental Immunology，Vols.I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986，Blackwell Scientific Publications)；Maniatis，T.etal.，eds.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，Vols.I-III，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.，eds.(1999)Short Protocols in Molecular Biology，4th edition，John Wiley &Sons；Ream et al.，eds.(1998)Molecular Biology TechniquesAnIntensive Laboratory Course，Academic Press)；PCR(Introduction toBiotechniques Series)，2nd ed.(Newton & Graham eds.，1997，SpringerVerlag)。
定义
“结缔组织生长因子”或“CTGF”是指基本上纯化的CTGF的氨基酸序列，其源自任何物种、特别是哺乳动物物种、包括大鼠、兔、牛、羊、猪、鼠、马和灵长类、优选人物种，和源自任何来源，无论是天然的、合成的、半合成的或重组的。
术语CTGF的“N-末端片段”是指包含源自CTGF多肽的氨基末端部分的序列的任何多肽，或指其任何变体或片段。N-末端片段可以包括如图1A和1B所示的从起始甲硫氨酸残基至不含半胱氨酸的“铰合”区的CTGF的全部或部分，或不包括任何这一段的序列。另外，N-末端片段可包括如图1B所示的胰岛素样生长因子结合蛋白基序和/或von Villebrand C型结构域(SEQ ID NO21)的全部或部分，或不包括任何这一段序列。CTGF的N-末端片段也可以包括不含半胱氨酸区的全部或部分，或不包括任何这一段的序列。另外，CTGF的N-末端片段可以是在任何上述N-末端片段中所含的任何15个或更多个连续氨基酸。
在一方面，CTGF的“N-末端片段”是指衍生自人CTGF的氨基末端部分的多肽序列。这类片段可以包含从SEQ ID NO2的氨基酸残基1至约氨基酸残基198的完整区域，或者从SEQ ID NO2的约氨基酸23至约氨基酸198。在铰合区内的N-末端片段的边界可以任选地由SEQ ID NO2中限定的几个蛋白酶裂解位点中的一个限定，如在残基179和180之间、在残基182和183之间、和在残基188和189之间的胰凝乳蛋白酶裂解位点；在残基183和184之间和在残基196和197之间的纤溶酶裂解位点；在残基169和170之间的骨形态发生蛋白-1裂解位点。另外，人CTGF的N-末端片段可包括SEQ IDNO2的从氨基酸27至氨基酸97、SEQ ID NO2的氨基酸103至氨基酸166或SEQ ID NO2的氨基酸167至氨基酸198的区域的全部或部分，或不包括任何这些序列。另外，人CTGF的N-末端片段可以是在任何上述N-末端片段中所含的任何15个或更多个连续氨基酸。
在特定的实施方案中，本发明的CTGF N-末端片段包含选自人CTGF(SEQ ID NO2)的如下区域及其源自一不同物种、特别是哺乳动物物种包括大鼠、兔、牛、羊、猪、鼠和马的直向同源片段的序列氨基酸残基23至氨基酸残基96(由外显子2编码)；氨基酸残基27至氨基酸残基97(IGF-BP基序)；氨基酸残基97至氨基酸残基180(由外显子3编码)；氨基酸残基103至氨基酸残基166(VWC结构域)；氨基酸残基167至氨基酸残基198(不含半胱氨酸的铰合区)；氨基酸残基23至氨基酸残基180(由外显子2和3编码)；氨基酸残基27至氨基酸残基166(IGF-BP和VWC)；以及氨基酸残基23至氨基酸残基198。(见图1B)
术语CTGF的C-末端片段是指包含衍生自CTGF氨基酸多肽序列的羧基末端部分的序列的任何多肽，或指其任何变体或片段。CTGF的C-末端片段可以包括CTGF多肽的不含半胱氨酸区域(SEQ ID NO2的氨基酸167至氨基酸198)的全部或部分，或不包括任何这段序列。
C-末端片段可以包括CTGF的从不含半胱氨酸的铰合区至该蛋白质末端的全部或部分，或不包括任何这一段序列。另外，C-末端片段可以包括血小板反应蛋白基序和/或半胱氨酸结基序的全部或部分，或不包括任何这些序列。另外，CTGF的C-末端片段可以是任何上述C-末端片段内所含的任何15个或更多个连续氨基酸。
在一些方面，C-末端片段可以包含SEQ ID NO2的从氨基酸残基181至约氨基酸残基349的完整区域。铰合区内的C-末端片段的边界可任选地由SEQ ID NO2中限定的几个蛋白酶裂解位点中的一个限定，如上述的胰凝乳蛋白酶、纤溶酶和骨形态发生蛋白-1裂解位点。另外，C-末端片段包含选自人CTGF(SEQ ID NO2)的以下区域及其衍生自一不同物种、特别是哺乳动物物种包括大鼠、兔、牛、羊、猪、鼠和马的直向同源片段的序列SEQ ID NO2的氨基酸201至氨基酸242，SEQ ID NO2的氨基酸247至氨基酸349，SEQ ID NO2的氨基酸248至氨基酸349，或SEQ ID NO2的氨基酸249至氨基酸346。另外，人CTGF的C-末端片段可以是上述任一种C-末端片段内所含的任何15个或更多个连续氨基酸。
术语CTGF的“不含半胱氨酸的区域”或“铰合区”是指衍生自人CTGF(SEQ ID NO2)的约氨基酸残基167至约氨基酸残基198及其衍生自一不同物种、特别是哺乳动物物种包括大鼠、兔、牛、羊、猪、鼠和马的直向同源片段的任何多肽。
本文所用术语“氨基酸序列”或“多肽”是指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列以及其片段，是指天然发生的或合成的分子。多肽或氨基酸片段是一种多肽的保留该多肽至少一种结构和/或功能特征的任何部分。CTGF片段包括CTGF多肽序列的任何保留CTGF的至少一种结构或功能特征的部分。当引用“氨基酸序列”来指代天然发生的蛋白质分子的多肽序列时，“氨基酸序列”等术语不意味着将氨基酸序列限制在与所引用的蛋白质分子相关的完整天然序列。
术语“免疫原性”涉及一种物质当被导入机体中时刺激免疫应答和产生抗体的能力。展示免疫原性性质的物质被称为是免疫原性的。免疫原性物质可包括但不限于多种大分子，例如蛋白质、脂蛋白、多糖、核酸、细菌和细菌成分、病毒和病毒成分。免疫原性物质通常具有大于10kDa的分子量。抗原片段是指保留CTGF多肽活性的至少一种生物学或免疫学表象的CTGF多肽片段，优选地是长度约5-15个氨基酸的片段。
术语“抗体”是指能结合表位决定簇的完整分子及其片段，如Fab、F(ab’)2和Fv片段，包括多克隆抗体和单克隆抗体。结合CTGF或CTGF片段的抗体可以用完整多肽或用含有感兴趣的小肽的片段作为免疫抗原而制备。用于免疫动物(例如小鼠、大鼠、兔、鸡、火鸡、山羊等)的多肽或寡肽可以得自RNA的翻译或者化学合成，并且如果希望可以与载体蛋白缀合。常用的与肽化学偶联的载体包括例如牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白和匙孔嘁血蓝蛋白(KLH)。
本文所用术语“单克隆抗体”是指一群基本上同质的抗体，即包含该群的各个抗体在特异性和亲和性方面是相同的，只是可能存在微量的天然发生的突变。注意一种单克隆抗体组合物可含有多于一种的单克隆抗体。
包括在本发明范围内的单克隆抗体包括杂种抗体和重组抗体(例如“人源化的”抗体)，而无论起源的物种或免疫球蛋白类别或亚类，也包括具有本文所述抗体的至少一种独特特征的抗体片段(例如Fab、F(ab’)2和Fv)。优选的实施方案包括这样的抗体，所述抗体能结合与单克隆抗体mAb1所识别的基本上相同的表位和/或对该表位具有大于或等于mAb1的亲和性的亲和性。
术语“单克隆”是指作为一群基本上同质的抗体的抗体特征，不应被解释为需要用任何特定方法产生该抗体。例如，本发明的单克隆抗体可以用Kohler and Milstein首先描述的杂交瘤方法(1975，Nature256495-497)制备，或者可以用重组DNA方法制备。例如，参见Celltech Therapeutics Ltd.，欧洲专利EP-0 120 694；Cabilly等人，美国专利4,816,567；或Mage and Lamoyi(1987；InMonoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.New York，pp.79-97)。
本文所用术语“中和抗体”是指一种能基本上抑制或消除CTGF的生物学活性的抗体、优选为单克隆抗体。典型地，中和抗体将抑制CTGF与辅因子如TGFβ的结合、抑制CTGF与靶细胞相关的CTGF特异性受体的结合、抑制CTGF与另一生物学靶的结合。在一特定的实施方案中，中和抗体抑制CTGF生物学活性的程度约等于或大于mAb1所抑制的程度。优选地，中和抗体抑制CTGF生物学活性的程度约等于或大于CLN1所抑制的程度。
本文所用短语“CTGF相关疾病”是指与CTGF的异常或改变的表达或活性相关的病变和疾病。CTGF的异常表达已经与细胞增殖性疾病如由内皮细胞增殖导致的疾病、细胞迁移、肿瘤样生长、全身(general)组织瘢痕形成和各种特征在于胞外基质的不适当沉积的疾病相关。
CTGF相关的疾病包括但不限于包括血管发生和在如下病变中起重要作用的其它过程的疾病，如增殖性玻璃体视网膜病；癌症，包括急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌(breast cancer)、乳腺瘤(breast carcinoma)、胶质瘤和成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤、结缔组织增生、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织增生性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌和肝癌；其它肿瘤生长和转移等。
CTGF相关疾病还包括纤维化疾病和相关病变，如产生自局部性或全身性纤维化的过度瘢痕形成、器官如肾、肺、肝、眼、心脏、皮肤等的慢性或急性纤维化；或选自但不限于上皮、内皮和结缔组织的组织。纤维化也可发生在眼睛和关节中。这类CTGF相关疾病包括例如心脏纤维化、包括心脏反应性纤维化或心肌梗死或充血性心力衰竭后的心肌重构；肺病，包括间质肺纤维化等；与透析、包括腹膜透析、例如连续不卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD)相关的纤维化；硬膜周围纤维化；肾纤维化；肺纤维化；间质纤维化；皮肤纤维化；和产生自急性或重复性创伤包括手术、化疗、放疗、同种异体移植物排斥、慢性和急性移植物排斥(例如肾、肝或其它器官)的纤维化；闭塞性细支气管炎，例如肺移植后；炎症和感染，例如由于疾病或损伤所致。
另外，CTGF相关疾病包括但不限于硬化性病变，包括全身硬化症、硬皮病、瘢痕疙瘩、过度瘢痕形成和其它皮肤疾病和病变；动脉粥样硬化，如包括动脉粥样硬化斑的病变，以及与糖尿病、腹膜透析等相关的动脉粥样硬化；关节炎，包括类风湿性关节炎、骨关节炎和其它关节炎症等；间质疾病，包括间质纤维化；克隆氏病(Crohn’sdisease)；炎症性肠病；视网膜病，包括例如增殖性玻璃体视网膜病、非增殖性糖尿病性视网膜病、增殖性糖尿病性视网膜病和黄斑变性(包括年龄相关疾病和青少年(Stargardt’s)病，以及色素上皮脱落)；肾病，包括糖尿病性肾病、IgA相关肾病、毒性所致肾病、狼疮肾病等；和与化学毒性肾小管破坏(tubule destruction)相关的病变。
CTGF相关的疾病还包括但不限于由高血糖、高血压、晚期糖化终末产物(AGE)形成等所致疾病。这类疾病可由于糖尿病、肥胖等导致，并包括糖尿病性肾病、视网膜病和心血管病。另外，CTGF相关疾病可由任何起始因子导致，包括但不限于接触化学品或生物剂、炎症应答、自身免疫反应、创伤、手术程序等。在一些实施方案中，所述方法用于治疗由于如下病变而易患CTGF相关疾病的患者，所述病变包括但不限于心肌梗死、关节炎和局部或全身炎症。
本文所称的“增殖性”过程和疾病包括特征在于细胞持续倍增导致细胞群在组织内过度生长的病理状态。所述细胞群非必需是转化细胞、致瘤细胞或恶性细胞，也可以包括正常细胞。例如，CTGF可以通过在动脉壁的内膜层中诱导一增殖性损害导致动脉粥样硬化或者通过刺激新血管化而病理性地参与。
“癌症”是指组织的任何自发性生长，包括细胞的不受控的异常生长，或指潜在的不受限制的生长的任何恶性肿瘤，其通过侵入而局部扩展和通过转移而全身性扩展。癌症也指特征在于癌症的任何异常状态。
术语“纤维化(fibrosis)”是指纤维组织的异常加工或者纤维样变性或纤维变性。纤维化可产生自各种损伤或疾病，并且可经常产生自与各种器官移植相关的慢性移植物排斥。纤维化典型地涉及胞外基质成分的异常产生、积累或沉积，包括例如胶原蛋白和纤连蛋白的过量产生和沉积增加。“纤维化”在本文中以其最广义使用，是指胞外基质蛋白的任何过量产生或沉积。纤维化的例子非常多，包括心脏病发作后形成瘢痕组织，削弱心脏供血能力。糖尿病通常导致肾损害/瘢痕形成，导致肾功能进行性丧失；并且在眼中导致视力丧失。在手术后，可在内部器官之间形成瘢痕组织，导致挛缩、疼痛，并且在一些情况中导致不育。主要器官如心脏、肾、肝、眼和皮肤易于发生通常与其它疾病相关的慢性瘢痕形成。肥厚性瘢痕(非恶性组织块)是由烧伤和其它创伤导致的最常见的纤维化形式。另外，还有许多其它的纤维增殖性疾病，包括硬皮病、瘢痕疙瘩和动脉粥样硬化，它们分别与全身组织瘢痕形成、皮肤中肿瘤样生长或削弱血液携带能力的持续血管瘢痕形成相关。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指寡核苷酸、核苷酸序列或多核苷酸、或其任何片段，还指天然或合成来源的DNA或RNA，其可以是单链或双链的并且可代表有义或反义链，还指肽核酸(PNA)，或指天然或合成来源的任何DNA样或RNA样材料。多核苷酸片段是一种多核苷酸序列的任何保留该多核苷酸的至少一种结构或功能特征的部分。多核苷酸片段可以是可变长度的，例如长度大于60个核苷酸、长度至少100个核苷酸、长度至少1000个核苷酸或长度至少10000个核苷酸。
“改变的”多核苷酸包括具有不同核苷酸缺失、插入或取代从而导致产生编码相同或功能等价的多肽的多核苷酸的那些多核苷酸。展示多态性的序列也包括在这一定义内，所述多态性可以用特定的寡核苷酸探针或通过缺失与等位基因的不合适的或未预料到的杂交而易于检测或不易于检测，所述多态性具有与目标多核苷酸序列的正常染色体位置不同的位置。
“改变的”多肽可含有产生沉默变化并产生功能等价多肽的氨基酸残基的缺失、插入或取代。所希望的氨基酸取代可基于残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性中的相似性而产生，只要所编码的多肽的生物学或免疫学活性得以保留即可。例如，带负电的氨基酸可包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸可包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电极性头部基团具有相似亲水性值的氨基酸可包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸、甘氨酸和丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺、丝氨酸和苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
多肽或氨基酸“变体”是指从一特定氨基酸序列改变一或多个氨基酸的氨基酸序列。多肽变体可具有保守变化，其中取代氨基酸具有与被置换的氨基酸类似的结构或化学性质，例如用异亮氨酸置换亮氨酸。变体也可具有非保守变化，其中取代氨基酸具有不同于被置换的氨基酸的物理性质，例如用色氨酸置换甘氨酸。类似的微小变异也可包括氨基酸缺失或插入，或两者。优选地，氨基酸变体保留特定多肽的某些结构或功能特征。有关确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或缺失的指导可例如用本领域熟知的计算机程序如LASERGENE软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)而发现。
多核苷酸变体是一种特定多核苷酸序列的变体，其与所述特定的多核苷酸序列优选具有至少约80％、更优选具有至少约90％、最优选具有至少约95％的多核苷酸序列相似性。本领域技术人员能理解由于遗传密码的简并性，可以产生大量的编码特定蛋白质的变体多核苷酸序列，其中一些与任何已知的或天然存在的基因具有很低的同源性。因此，本发明包括可以通过基于可能的密码子选择而选择组合来制备的多核苷酸序列的每一种可能的变异。这些组合根据标准密码子三联体遗传密码而产生，并且所有这些变异均被认为是特异公开了。
“缺失”是氨基酸或核苷酸序列中的导致一或多个氨基酸残基或核苷酸不存在的变化。
术语“插入”或“添加”是指多肽或多核苷酸中的导致与天然存在的分子相比分别添加一或多个氨基酸残基或核苷酸的变化。
本文所用术语“功能等价物”是指具有一特定多肽或多核苷酸的至少一种功能和/或结构特征的多肽或多核苷酸。功能等价物可含有一些使得能行使特异功能的修饰。术语“功能等价物”意在包括一个分子的片段、突变体、杂种、变体、类似物或化学衍生物。
术语“微阵列(microarray)”是指核酸、氨基酸、抗体等在一基材上的任何排列。基材可以是任何合适的支持物，例如珠、玻璃、纸、硝酸纤维素、尼龙或任何合适的膜等。基材可以是任何刚性或半刚性支持物，包括但不限于膜、滤器、晶片、芯片、玻片、纤维、珠包括磁性和非磁性珠、凝胶、管、板、聚合物、微粒、毛细管等。基材可提供表面用于包被和/或可具有各种表面形式，如孔、针、沟、通道、孔，核酸、氨基酸等可与其结合。
术语“样品”在本文中以其最广义使用。样品可以来自任何来源，例如来自体液、分泌物、组织、细胞或培养物包括但不限于唾液、血液、尿、血清、血浆、玻璃体液、滑液、脑脊髓液、羊水和器官组织(例如活检组织)中的细胞，；来自染色体、细胞器、或任何其他分离自细胞的膜；来自基因组DNA、cDNA、RNA、mRNA等；以及来自澄清的细胞或组织，或来自这类细胞或组织的印迹或痕迹。样品可来自任何来源，例如人或非人哺乳动物对象等。本发明还包括来自任何疾病的动物模型的样品。样品可以在溶液中或者可以被固定或结合于基材。样品可以指任何适于测试CTGF或CTGF片段的存在的材料，或适于筛选与CTGF或其片段结合的分子的材料。获得这些样品的方法属于本领域技术水平范畴。
术语“杂交”是指核酸序列通过碱基配对与互补序列结合的过程。杂交条件可以通过例如在预杂交和杂交溶液中的盐或甲酰胺浓度而限定，或者可以通过杂交温度而限定，这些是本领域熟知的。杂交可以在各种严格性条件下发生。
特别地，严格性可以通过降低盐浓度、增加甲酰胺浓度或升高杂交温度而增加。例如，在本发明中，在高严格性条件下的杂交可在约50％甲酰胺中在约37℃-42℃下发生，在降低的严格性条件下的杂交可在约35％-25％甲酰胺中在约30℃-35℃下发生。特别地，杂交通常在最高严格性条件下发生，即在42℃于50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS和200μg/ml剪切变性鲑精DNA中发生杂交。
相应于特定严格性水平的温度范围可以通过本领域已知的方法进一步缩小，例如通过计算感兴趣核酸的嘌呤与嘧啶的比率并因此调节温度而进行。为除去非特异性信号，印迹可随后在例如室温或直至并包括60℃下、在直至0.1×SSC和0.5％SDS的提高的严格性条件下洗涤。上述范围和条件的变化为本领域所熟知。
发明
本发明提供了特异性结合结缔组织生长因子(CTGF)的抗体。所述抗体是多克隆或单克隆抗体，优选是单克隆抗体，更优选是人单克隆抗体。所述抗体是CTGF的N末端片段的抗体，如图1所示。更特别地，所述抗体是从SEQ ID NO2的第97位残基延伸至第180位残基的CTGF片段的抗体。在特殊的实施方案中，所述抗体是SEQ IDNO2的大约第103位延伸至大约第164位残基、特别是从大约第134位残基延伸至大约第158位残基的CTGF片段的抗体。更特别地，所述抗体是从SEQ ID NO2的大约第143位残基至大约第154位残基的CTGF片段的抗体。
在特殊的实施方案中，所述抗体中和CTGF的生物学活性。CTGF的生物学活性包括细胞增殖、分化、基因表达等等。在特殊的实施方案中，所述生物学活性选自由细胞分化，例如成纤维细胞、肌成纤维细胞、内皮细胞等从各种前体细胞的分化或转分化；参与胞外基质形成和重塑的蛋白质表达的诱导，所述蛋白质包括例如I型胶原、纤连蛋白等；与各种因子相关的信号级联的协同诱导，所述因子包括但非限于TGF-β、IGF、VEGF、血管紧张肽II、内皮缩血管肽等等；对各种环境刺激的细胞应答，包括但非限于增加的葡萄糖水平(高血糖)、增加的机械性压力(高血压)等等组成的一组。
尽管本发明不受抗体中和CTGF活性的机制所限，但抗体可以结合CTGF并防止其与特异性细胞受体相互作用。所述受体可具有高度CTGF亲和性，通过与CTGF结合而刺激导致增殖、分化、基因表达诱导和/或细胞形态或功能改变的胞内信号产生。细胞对CTGF的特殊生物学应答依赖于细胞和周围环境的当前状态。或者，所述受体可具有低CTGF结合亲和性，并且通过与CTGF结合可例如将CTGF定位于高亲和性受体以促进识别和应答CTGF。或者，所述抗体可结合组织或器官内的CTGF，并促进CTGF从机体滴定或消除。
或者或与上述机制联合，所述抗体可结合CTGF并防止CTGF与分泌的或膜结合的辅因子相互作用。这种辅因子特别包括TGF超家族的成员，例如TGF-1、-2和-3；活化素-A、-B、-C和-E；BMP-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8a、-8b、-9、-10、-11和-15；及GDF-3、-5、-6、-7、-9和-10。例如，已经示出CTGF与TGFβ-1和BMP-4结合并调节其活性(Abreu et al.(2002)Nat Cell Biol 4599-604)。本发明提供了这样的证据，即与TGF-β结合的CTGF区域是由外显子3(图1B，SEQ ID NO1的第418-669位核苷酸)编码，与这个区域结合的抗体阻止了CTGF与TGFβ之间的相互作用(实施例12，如下文所述)。另外，在CTGF这个区域内结合的抗体示出在动物模型中中和特异性CTGF相关进程。例如，与CTGF的这个区域结合的抗体在回体测定中示出特异性抑制细胞迁移，并且降低动物模型中的纤维化。本发明的示例性抗体是mAb1和-CLN1；抗体CLN1是由2004年5月19日保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassus VA)的ATCC登记号为No.＿＿的细胞系产生的。
不论作用机制如何，本发明提供了使用抗体治疗与CTGF相关的各种疾病和病变的方法。与CTGF相关的疾病和病变包括但非限于肾病、肺纤维化、视网膜病、硬皮病、肝纤维化、心力衰竭、关节炎和动脉粥样硬化。另外，与CTGF相关的病变是由于各种因素引起的，包括但非限于高血糖、高血压、糖尿病、肥胖等，及包括糖尿病性肾病、视网膜病、心血管病等等。由于CTGF在许多疾病包括上述疾病中是过表达的，因此期望本发明使用CTGF抗体治疗患有CTGF相关疾病的患者，以改善或稳定病变、保持或恢复器官功能、改善生存质量及延长存活时间。
例如，所述抗体特别针对参与各种疾病的纤维化和非纤维化方面均相关的生物学活性的CTGF区域，所述疾病例如间质性肺纤维化、糖尿病性肾病和视网膜病、黄斑变性等。本发明还涉及使用所述抗体治疗与CTGF相关疾病的方法，所述疾病包括局部和全身性纤维化疾病，如肺、肝、心、皮肤和肾等的纤维化疾病；及由于例如外伤、手术等所致局部瘢痕形成。
本发明的抗体也可用于包括与CTGF结合的任何方法中。这种方法包括例如通过亲和层析纯化CTGF或CTGF片段，例如使用ELISA或免疫组织化学技术检测样品中CTGF或CTGF片段；通过使用检测CTGF的方法诊断CTGF相关疾病以测定患者样品中CTGF水平并与标准样品中CTGF水平对比。
针对CTGF的抗体
使用例如单克隆抗体对分泌的细胞因子的量和/或活性的调节已经论证，并且一些治疗性抗体已经许可或者在研制阶段(见例如Abciximab(Reopro；Centocor，Inc.，Malvern PA)，Infliximab(Remicade；Maini et al.(1998)Arthritis Rheum 411552-1563；Targan et al.(1997)N Engl J Med 3371029-1035)；Basiliximab(Simulect)and Daclizumab(Zenapax)(Bumgardner et al.(2001)Transplantation 72839-845；Kovarik et al.(1999)Transplantation 681288-1294)；及Trastuzumab(Herceptin；Baselga(2001)Ann Oncol 12 Suppl 1S49-55))。众多的产生抗体的方法包括在动物、植物、真菌和细菌中产生，合成构建及回体培养等方法为本领域技术人员所已知并可加以利用。
本发明的抗体可以使用针对产生抗体分子的任何技术制备。本领域熟知在体内和体外产生单克隆或多克隆抗体的技术(见例如Pound(1998)Immunochemical Protocols，Humana Press，Totowa NJ；Harlowand Lane(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，New York；Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciplesand Practice，2″d Edition，Academic Press；Schook(1987)MonoclonalAntibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.)。本领域也熟知产生嵌合抗体的技术，如产生单链抗体(见例如Morrison et al.(1984)Proc Natl Acad Sci USA 816851-6855；Neuberger et al.(1984)Nature 312604-608；Takeda et al.(1985)Nature314452-454)。具有相关特异性但具有独特的独特型组分的抗体可以通过各种合适的方法产生，例如通过从随机组合的免疫球蛋白文库中经链改组(chain shuffling)而产生(见例如Burton(1991)Proc Natl AcadSci USA 8811120-11123)。
抗体也可以通过在淋巴细胞群中诱导体内产生或者通过筛选免疫球蛋白库或高特异性结合试剂的组而产生(见例如Orlandi et al.(1989)Proc Natl Acad Sci USA 863833-3837；Winter and Milstein(1991)Nature 349293-299)。含有靶多肽的特异性结合位点的抗体片段也可以产生。这种抗体片段包括但非限于F(ab′)2片段，其可以通过胃蛋白酶消化抗体分子而产生，及Fab片段，其可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生。或者，可以构建Fab表达文库以快速并容易地鉴别具有希望特异性的单克隆Fab片段(见例如Huse et al.(1989)Science 2541275-1281)。
本发明的单克隆抗体也可以使用杂交瘤方法制备(见例如Kohlerand Milstein(1975)Nature 256495-497)，或者通过重组DNA方法制备(见例如Celltech Therapeutics Ltd.，European Patent No.EP 0 120 694；Cabilly et al.，美国专利No.4,816,567；及Mage and Lamoyi(1987)InMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications，MarcelDekker，Inc.，New York，pp.79-97)。
在杂交瘤方法中，将小鼠或其它合适的宿主动物用CTGF或其片段通过皮下、腹膜内或肌内途径免疫，以激发产生或能产生特异结合用于免疫的多肽的抗体的淋巴细胞。或者，宿主动物可以是一种转基因哺乳动物，其具有编码人免疫球蛋白基因的转基因及具有失活的内源免疫球蛋白基因座。所述转基因哺乳动物通过产生人抗体而应答免疫原(见例如Lonberg et al.，WO 93/12227(1993)，美国专利No.5,877,397，and Nature 1481547-1553(1994)；及Kucherlapati et al.(1991)WO91/10741)。或者，淋巴细胞可以在体外免疫，然后使用合适的融合剂如聚乙二醇与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞(见例如Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，2nd Edition，AcademicPress，pp.59-103)。或者，能产生抗体的人体细胞特别是B淋巴细胞适于与骨髓瘤细胞系融合。当可以使用来自个体活检的脾、扁桃体或淋巴结时，优选更容易获得的周围血B淋巴细胞。另外，人B细胞可以由Epstein-Barr病毒直接永生化(见例如Cole et al.(1995)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。
用于产生杂交瘤的融合程序中的优选的骨髓瘤细胞系是有效融合的、通过选择的抗体产生细胞支持抗体稳定高水平表达、具有酶缺陷使其不能在支持希望的杂交瘤生长的某些选择的培养基中生长并且不能自身产生抗体的那些细胞系。在本发明中可用于产生杂交瘤的骨髓瘤细胞系例如包括均衍生自小鼠的P3X63Ag8、P3X63Ag8-653、NS1/l.Ag 4.1、Sp210-Ag14、FO，NSO/U，MPC-11、MPC11-X45-GTG 1.7、S194/5XXO Bul；衍生自大鼠的R210.RCY3，Y3-Ag 1.2.3，IR983F和4B210；及衍生自人的U-266、GM1500-GRG2、LICR-LON-HMy2、UC729-6(见例如Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples andPractice，2nd Edition，Academic Press，pp.65-66；and Campbell(1984)InMonoclonal Antibody TechnologyLaboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Vol.13(Burden and VonKnippenberg，eds.)Amsterdam，Elseview，pp.75-83)。
将杂交瘤细胞在优选含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一或多种物质的合适培养基中接种并生长。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺少次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基典型包括阻止HGPRT-缺乏的细胞生长的一种物质，如次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。
测定杂交瘤细胞生长于其中的培养基的针对CTGF或CTGF片段的单克隆抗体的产生。优选地，所述结合特异性通过亲和层析、免疫沉淀或通过体外结合测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)，或通过荧光激活细胞分类(FACS)测定来确定。本发明的单克隆抗体是与CTGF结合的那些抗体，及另外是中和CTGF生物学活性的那些抗体，如下文所例证。
任选地筛选如前所述产生的抗体以检测与CTGF的N末端片段充分结合的抗体。在一个实施方案中，所述抗体是针对从SEQ IDNO1的大约第24位残基延伸至大约第180位残基的CTGF片段的抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是针对从SEQ ID NO1的大约第96位残基延伸至大约第180位残基的CTGF片段的抗体。在一个特殊的实施方案中，所述筛选检测了与抗体mAb1识别的相同表位充分结合的抗体，这例如通过下述竞争测定而确定。在另一个特殊的实施方案中，所述筛选检测了与抗体CLN1识别的相同表位充分结合的抗体，这例如通过下述竞争测定而确定。应注意“相同表位”不意味着基准抗体结合的精确的氨基酸或碳水化合物，所述精确的氨基酸或碳水化合物可以例如使用丙氨酸扫描的CTGF变体通过表位作图(epitop mapping)而确定。“相同表位”是指被通过天然基准抗体与CTGF结合而阻断的CTGF结构域的完整形式。当然，“相同表位”包括在结构上与mAb1或CLN1的基准互补决定区(CDR)相互作用或结合的CTGF结构域残基或者碳水化合物。
在本发明的一个优选实施方案中，所述单克隆抗体具有与mAb1相等或更高的亲和性，这通过例如Munson和Pollard的斯卡查德分析(1980，Anal Biochem 107220)确定。
在鉴别杂交瘤细胞产生具有希望的特异性和亲和性的中和抗体之后，将所述克隆典型地通过有限稀释方法亚克隆并通过标准方法生长(Goding(1986)Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，2ndEdition，Academic Press，pp.59-104)。为此合适的培养基包括例如Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium或RPMI-1640培养基。另外，所述杂交瘤细胞也可以在动物中作为腹水瘤而在体内生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体是从培养基、腹水液或血清中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离的，例如通过A蛋白-琼脂糖(Sepharose)、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或者亲和层析分离。
编码本发明的单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离及测序，例如通过使用能特异结合编码所述抗体重链和轻链的寡核苷酸探针进行。一旦分离，所述DNA可以连接进表达或克隆载体中，该载体然后转染进不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如猿COS细胞、中华仓鼠卵巢(CHO)细胞、或骨髓瘤细胞中。将如此转化的细胞在适于重组宿主细胞培养物中合成单克隆抗体的条件下培养。一种示例性细胞系于2004年5月19日保藏，ATCC保藏号为No.＿＿＿。
所述DNA任选加以修饰以改变其编码的免疫球蛋白的特性。免疫球蛋白的变体是熟知的。例如，嵌合抗体是通过用另一个物种如人的同源序列取代一个物种如小鼠的重链和轻链恒定结构域的编码序列而产生(见例如Boss et al.，国际出版物No.WO 84/03712；Cabilly etal.，美国专利No.4,816,567；或者Morrison et al.(1984)Proc NatAcadSci 816851)。在一个特殊的实施方案中，人源化形式的小鼠抗体可以通过用人抗体的构架结构域即恒定区取代小鼠抗体互补决定区(CDR)即可变结构域而产生(见例如国际出版物No.WO 92/22653)。在一些实施方案中，选择的鼠构架残基也被人受体免疫球蛋白所取代。另外，选择的Fc结构域可以是任何IgA、IgD、IgE、IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-4或IgM。所述Fc结构域任选具有效应器功能如能互补结合。
本发明的抗CTGF抗体也可以与提供额外能力如检测或胞毒性作用的组分融合。本发明的免疫球蛋白与胞毒性组分的融合是例如通过将免疫球蛋白编码序列与胞毒性非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列连接而产生。这种非免疫球蛋白多肽包括多肽毒素如蓖麻毒蛋白、白喉毒素或者假单胞菌外毒素。所述缀合物也可以通过体外方法制备。例如，免疫毒素可以使用二硫化物置换反应或者通过在免疫球蛋白和毒素多肽之间形成硫醚键而构建。为此的合适试剂例如包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁亚精胺(methyl-4-mercaptobutyrimidate)。典型地，这种非免疫球蛋白融合多肽取代了本发明抗体的恒定区。或者，它们取代了本发明抗体的一个抗原结合位点的可变区。
具有非CTGF抗原特异性的抗体的Fv或CDR的取代产生嵌合抗体，其包含一个特异于CTGF的抗原结合位点及另一个特异于不同抗原的抗原结合位点。在这种实施方案中，轻链缺失，重链的Fv由希望的多肽取代。这些抗体根据所应用的Fc结构域具有的免疫球蛋白“臂”的数目而称为二价或多价抗体，例如，IgG是二价的，IgM是多价的。除了上述非免疫球蛋白之外，所述抗体还通过具有一种以上特异性的抗体的重组而变成多价的。例如，一些实施方案中的抗体能结合CTGF(如本文别处所述)，但也能结合另一种生长因子，例如TGFβ、VEGF、FGF，其它CCN家族成员例如CYR61等，或者细胞因子。针对这些因子的抗体的实例是熟知的。多特异性、多价的抗体通过用编码这两种抗体的重链和轻链的DNA共转化细胞而产生，具有希望结构的表达的抗体部分通过免疫亲和层析等技术而回收。或者，这种抗体是从单价抗体中通过以常规方式在体外重组而产生。
单价抗体本身也是通过常规技术产生的。轻链和修饰的重链的重组表达是合适的。所述重链通常是在Fc区域内的任何点截短的以防止重链交联。或者相关的半胱氨酸用另一个残基取代或缺失以防止交联。也使用体外方法以产生单价抗体，例如Fab片段通过用酶切割完整的抗体而制备。
诊断
本发明的抗体可用于定性和定量检测样品中的CTGF。样品可以来自任何来源，包括使细胞在培养物中生长的条件化培养基，组织样品例如活检组织和器官移植物，体液包括血液、尿液、水疱液、脑脊液、玻璃体液和滑液等。在一个实施方案中，CTGF的检测用于诊断培养物中生长的细胞的状态，例如关于分化、基质产生等。CTGF对培养的细胞具有各种自分泌和旁分泌作用，并且与细胞层相关的或者条件培养基中存在的CTGF水平可以是细胞的当前状态的指征或者预示细胞的未来状态(见例如国际出版物No.WO96/38168)。在其它实施方案中，CTGF的检测用于确定组织或器官的状态。例如，指定移植的器官可以通过测定CTGF水平而评估，其中器官中细胞表达的CTGF水平表示器官的相对健康状况及移植的适合度。CTGF水平也可以在活检组织中确定以确定器官的状态或者癌症的分期及潜在的转移倾向。
在优选的实施方案中，所述抗体用于诊断与CTGF相关的疾病或病变(见例如国际出版物No.WO 03/024308)。一方面，本发明提供了诊断CTGF相关疾病的抗体，所述诊断通过获得样品，检测并定量样品中CTGF水平，并将样品中CTGF水平与标准量的CTGF相对比进行，其中样品中CTGF水平的增加或降低表示存在CTGF相关疾病。与CTGF的异常(例如增加或降低)水平相关的疾病包括但非限于与胞外基质相关的蛋白的表达改变和沉积相关的疾病。这种疾病包括例如癌症，如乳腺癌、胰腺癌和胃肠道癌症、动脉粥样硬化、关节炎、视网膜病变如糖尿病性视网膜病、肾脏病变如糖尿病性肾病、心脏、肺、肝和肾纤维化、及与慢性炎症和/或感染相关的疾病。CTGF相关的疾病还与如下病变相关，如心肌梗塞、糖尿病、腹膜透析、慢性和急性移植排斥、化疗、放疗和手术。
另一方面，本发明提供了用于鉴别个体是否具有产生CTGF相关疾病的诱因的抗体。诱因最初可表现为对象的高血糖、高血压或肥胖。另外，可以由于对象经历的一个事件而怀疑产生所述诱因，例如对象的心肌梗塞、手术、整形外科手术或瘫痪固定(paralyticimmobilization)、充血性心力衰竭、妊娠或静脉曲张。
另一方面，本发明提供了监测CTGF相关疾病进展或者监测CTGF相关疾病治疗效力的抗体。例如，使用所述抗体的方法可包括随着时间的过去从对象获得样品；检测并定量每个样品中CTGF的水平；将随后的样品中CTGF水平与早期或先前的样品中CTGF水平相对比。随着时间的过去，样品之间CTGF水平变化表示CTGF相关疾病的进展或者CTGF相关疾病的治疗效力。
对于诊断应用，本发明的抗体典型地用一种可检测的组分标记。所述可检测的标记可以是能直接或间接产生可检测信号的任何组分。例如，所述可检测的组分可以是放射性同位素，如3H、14C、32p、35S或125I；荧光或化学发光化合物，如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或者是一种酶，如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者辣根过氧化物酶。
可以应用本领域已知的单独缀合所述抗体与可检测的组分的任何方法(见例如Hunter et al.(1962)Nature 144945；David et al.(1974)Biochemistry 131014；Pain et al.(1981)J Immunol Meth 40219；andNygren(1982)J Histochem Cytochem 30407)。本发明的抗体可用于任何测定方法中，如竞争结合测定，直接和间接夹心测定，及免疫沉淀测定(Zola(1987)InMonoclonal AntibodiesA Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，pp.147-158.)。
竞争结合测定依赖于标记的标准物(其可以是CTGF或者其免疫反应性部分)与样品分析物(CTGF)竞争结合有限量的抗体的能力。样品中CTGF的量与与抗体结合的标准物的量成反比。为便于确定与抗体结合的标准物的量，所述抗体在竞争之前或之后通常是不溶解的，以便结合抗体的所述标准物和分析物可从未结合的标准物和分析物中常规分离。
夹心测定包括使用两种抗体，每种抗体均能结合待测蛋白质的不同免疫原性部分或者表位。在夹心测定中，样品分析物与固定在固体支持物上的第一种抗体结合，之后第二种抗体与所述分析物结合，由此形成不溶的三部分复合物(David and Greene，美国专利No.4,376,110)。第二种抗体可自身用一种可检测的组分标记(直接夹心测定)，或者可以使用可检测组分标记的抗免疫球蛋白抗体测定(间接夹心测定)。例如，一种夹心测定是ELISA测定，在这种情况中可检测的组分是一种酶。可以使用本发明的抗体的一种示例性测定在国际公开No.WO 03/024308中描述。
本发明的抗体还用于体内成像，其中用可检测组分如不透射线的制剂、放射性同位素、或者荧光组分如绿色荧光蛋白(GFP)标记的抗体给予宿主，优选给予血流中，并测定宿主中标记的抗体的存在和定位。这种成像技术用于对CTGF相关疾病如纤维化疾病进行分期和治疗。所述抗体可以用在宿主中无论通过核磁共振、放射线学还是本领域已知的其它检测方式可检测到的任何组分标记。
治疗
本发明提供了治疗与CTGF相关的各种疾病和病变的抗体。已经发现本发明的抗体在一些疾病中降低CTGF产生或活性引起的有害作用，如下文例证。另外，所述抗体示出有利的药物动力学性质，使其可以作为治疗CTGF相关疾病的优良治疗剂。
本发明的抗CTGF抗体在动物模型中抑制纤维化的发展，例如抑制肺和肾纤维化发展。特别地，所述抗体使小鼠中博来霉素诱导的肺纤维化减少60-70％，这是通过肺羟脯氨酸(胶原)积聚的抑制和组织制备物的组织学检测而确定的。另外，所述抗体降低大鼠残余肾(即5/6肾切除)模型及在单侧输尿管梗阻(UUO)后的小鼠中胶原的积聚。所述抗体在新生小鼠中还降低组合皮下或腹膜内灌注CTGF和TGF诱导的纤维化。另外，所述抗体降低与器官衰竭相关的并发症，例如在慢性和急性肾衰竭的各种模型中改善肾功能。在动物中使用这些抗体未观测到毒性。因为CTGF在多种纤维化疾病包括弥慢性和局限性硬皮病、骨关节炎、糖尿病性肾病和视网膜病等中是过表达的，因此本发明包括使用CTGF抗体治疗患有CTGF相关疾病的患者以改善或稳定病变，恢复器官功能，改善生活质量及延长存活时间。
因此，本发明的抗体特别用于治疗性应用，以预防或治疗对象的CTGF相关的疾病。这种疾病包括但非限于血管发生及在一些病变和癌症中起关键作用的其它过程，所述病变如动脉粥样硬化、青光眼等；所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、乳腺瘤(breast carcinoma)、胶质瘤和成胶质细胞瘤、横纹肌肉瘤和纤维肉瘤、结缔组织生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症，及前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌和肝癌及其它肿瘤生长和转移。
另外，本发明的抗体用于治疗性应用，以预防或治疗CTGF相关的疾病，包括纤维化。一方面，本发明的抗体给予对象以预防或治疗CTGF相关疾病，包括但非限于表现为胞外基质相关的蛋白质表达改变或沉积的疾病，例如纤维化疾病。在各个方面，纤维化可定位于特殊的组织，例如上皮组织、内皮组织或者结缔组织；或者定位于器官如肾、肺或肝。纤维化也可以发生在眼和关节。在其它方面，纤维化可以是全身性的，包括多个器官和组织系统。CTGF相关的疾病包括例如动脉粥样硬化、关节炎、视网膜病变如糖尿病性视网膜病；肾脏病变如糖尿病性肾病；心、肺、肝和肾纤维化，及与慢性炎症和/或感染相关的疾病。
另一方面，本发明提供了在具有发展CTGF相关疾病的诱因的对象中预防CTGF相关疾病的抗体。诱因可包括例如对象的高血糖、高血压或者肥胖。这种疾病可例如由于糖尿病、肥胖等所致而发生，包括糖尿病性肾病、视网膜病变和心血管疾病。另外，可以由于对象经历的一个事件而怀疑产生所述诱因，例如对象的心肌梗塞、手术、腹膜透析、慢性和急性移植物排斥、化疗、放疗、创伤、整形外科手术或瘫痪固定、充血性心力衰竭、妊娠或静脉曲张。
在特殊的实施方案中，如本文所例证，本发明的抗体给予对象以治疗器官例如肺或肾的纤维化。本文示出所述抗体在肺和肾纤维化的各种模型中提供了益处(见例如实施例7-9)。在另一个特殊的实施方案中，本发明的抗体给予对象以降低局部或全身性硬化(见例如实施例11和12)。在另外的实施方案中，所述抗体给予对象以治疗或预防眼部疾病如增殖性玻璃体视网膜病变、糖尿病性视网膜病，黄斑变性等。由于CTGF参与许多疾病，因此本发明进一步包括治疗患有CTGF相关疾病的患者，所述治疗使用本发明的抗体以改善或稳定病变和器官功能、改善生存质量及延长存活时间。
对于治疗性应用，本发明的抗体以药物可接受的剂型给予哺乳动物，优选人。所述抗体可以作为大丸剂和/或持续灌注一段时间经静脉内给予，和/或通过肌内、皮下、动脉内、滑膜内、鞘内(intrathecal)、玻璃体内(intravitreal)、颅内(intracranial)、口服、局部或者吸入途径给予。当所述抗体具有合适的活性时，也可以利用肿瘤内、肿瘤周围、损伤内(intralesional)或损伤周围(perilesional)途径给予以表现局部以及全身性治疗效果。
这种剂型包含本身无毒性和无治疗作用的药物可接受的载体。这种载体例如包括离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂；血清蛋白质例如人血清白蛋白；缓冲剂如磷酸盐或甘氨酸；山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混和物、水、盐；或者电解质如硫酸鱼精蛋白、氯化钠、金属盐、胶体硅石、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素聚合物、及聚乙二醇。用于抗体局部或基于凝胶剂型的载体包括多糖如羧甲基纤维素或甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧化乙烯聚氧化丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和木蜡醇(wood waxalcohols)。常规的储存形式(depot forms)包括例如微囊、纳米囊(nano-capsules)、脂质体、硬膏剂、舌下片剂、及聚合物基质如聚乳酸聚乙醇酸共聚物(polylactidepolyglycolide copolymers)。当以水溶液剂型而不是冻干剂型存在时抗体典型地以大约0.1mg/ml-100mg/ml的浓度配制，但也可以在这些范围之外作各种变化。
对于疾病的预防或治疗，抗体的合适剂量依赖于待治疗的疾病类型(如上所述)、疾病的严重程度和进程、抗体是预防性还是治疗性给予、前期治疗的进程、患者的临床病史及对抗体的应答、及主治医生的判断。所述抗体适于一次或在一系列治疗期间给予患者。
根据疾病的类型和严重程度，大约0.015-15mg抗体/kg患者体重是给予患者的最初候选剂量，无论例如是通过一或多次单独给予还是持续灌注。对于几天或更长时间重复给予，根据疾病情况重复治疗直至出现希望的疾病症状抑制状态。然而，可以使用其他剂量方案，并且不排除在本发明的范围之外。
根据本发明的另一个实施方案，抗体在预防或治疗疾病中的效力可以通过连续给予所述抗体或者组合另一种对于相同的临床目标有效的治疗剂而改良，如针对主抗体之外的不同表位的另一种抗体，或者已知用于所希望的治疗性指征的一或多种常规治疗剂，所述治疗性指征例如预防或治疗与过量的胞外基质产生相关的病变如纤维化或硬化、抑制肿瘤生长或转移、抑制新血管形成、或者降低炎症。这种制剂可以通过相似的作用机制例如抗TGFβ抗体或者通过不同的机制例如干扰素-γ而改善症状或者改善结果。这种制剂可另外改善与CTGF相关疾病或者产生CTGF相关疾病的诱因例如血管紧张肽转换酶(ACE)抑制剂和血管紧张肽受体阻滞剂(Arb)直接或间接相关的症状。
例如，接受稳定的前列环素激动剂伊洛前列素(Iloprost)灌注的硬皮病患者通常表现一种皮肤紧密性改善，与皮肤成纤维细胞对瘢痕组织形成的抑制作用一致。前列腺素已经示出对胶原合成发挥抑制作用，一些证据表明伊洛前列素阻断硬皮病中CTGF诱导(Korn et al.(1980)J Clin Invest65543-554；Goldstein and Polger(1982)J BiolChem 2578630-8633；and Stratton et al.(2001)J Clin Invest 108241-250)。与健康对照相对比，CTGF在硬皮病患者的水泡液中增加7倍，然而经静脉内给予伊洛前列素的患者示出水泡液中CTGF明显降低(Stratton et al.(2001)J Clin Invest 108241-250)。总之，这些结果提示伊洛前列素治疗在硬皮病中的一些益处也许是得自CTGF水平降低介导的抗纤维化作用。考虑到在硬皮病患者中慢性全身性给予强力的血管舒张剂与抗血小板前列环素类似物的应用，单独利用抗CTGF抗体或者联合降低水平的伊洛前列素治疗可以提供一种安全而有效的硬皮病治疗方法。
额外的应用
本发明的抗体还用作亲和性纯化剂。在这种方法中，使用本领域熟知的方法将CTGF的抗体固定在合适的支持物上，如葡聚糖凝胶(Sephadex)树脂或滤纸上。然后将固定的抗体与待纯化的含有CTGF的样品接触，之后用合适的溶剂洗涤该支持物，这样基本上除去样品中的所有物质，除了与固定的抗体结合的CTGF之外。最后，将支持物用另一种合适的溶剂如甘氨酸缓冲液(pH5.0)洗涤，这样将从抗体中释放CTGF。
实施例
本发明参照下述实施例进一步理解，这些实施例仅仅是本发明的示例。本发明的范围不限于示例性的实施方案，这些实施方案仅仅是为了说明本发明的某些方面。任何功能等价的方法在本发明范围内。除了本文所述，本发明的各种修改对于本领域技术人员参照上述描述和附图是清楚的。这些修改落入权利要求书保护范围。
实施例1重组人CTGF的产生
如Segarini等人((2001)J Biol Chem 27640659-40667)所述产生重组人CTGF杆状病毒(baculovirus)构建体。简要地，用DB60R32(Bradham et al.(1991)J Cell Biol 1141285-94)作为模板，使用引物5’-gctccgcccgcagtgggatccATGaccgccgcc-3’和5’-ggatccggatccTCAtgccatgtctccgta经PCR产生仅包含可读框的CTGF cDNA，所述引物在扩增产物末端添加BamHI限制酶位点。天然的起始和终止密码子以大写字母表示。
所产生的扩增的DNA片段用BamHI消化，在琼脂糖凝胶上电泳纯化，并直接亚克隆进杆状病毒PFASTBAC1表达质粒(InvitrogenCorp.，Carlsbad CA)的BamHI位点中。表达盒(expression cassette)的序列和方向经DNA测序验证。然后将所产生的CTGF表达盒通过在细菌中的位点特异性重组而转移进杆粒(bacmid)DNA。这一杆粒随后用于在草地夜蛾(Sodoptera frugiperda)SF9昆虫细胞中根据生产商提供的方案(BAC-TO-BAC表达系统手册，Invitrogen)产生完全重组的CTGF杆状病毒。用本领域已知的标准程序扩大重组杆状病毒在Sf9昆虫细胞中的效价。
将Hi5昆虫细胞通过摇瓶培养细胞系列传代并在每一传代中富集分离的细胞而使之适应悬浮生长。将悬浮的Hi5细胞在置于摇床上的一次性2.8L Fernbach培养瓶(Corning Inc.，Acton MA)中1L SF900IISFM培养基(Invitrogen)中于110rpm、27℃下培养，所述1L SF900IISFM培养基中补充了20μg/ml庆大霉素(Mediatech，Inc.，Herndon VA)和1x脂类(Invitrogen)。当细胞密度达到1.0-1.5×106细胞/ml、存活率为＞95％时，将细胞用重组杆状病毒以感染复数(MOI)为10进行感染。培养物然后在27℃再温育40-44小时。收集含有rhCTGF的条件培养基，在冰上冷却，并以5000xg离心。然后将上清通过0.45mm滤膜。
或者，通过将编码大鼠CTGF的克隆2-4-7(Schmidt et al.，美国专利6,348,329)插入pMK33表达载体(由Michael Koelle构建，Stanford大学博士论文，1992)而产生重组大鼠CTGF。用CELLFECTIN试剂(Invitrogen Corp.，Carlsbad CA)将所述大鼠CTGF表达构建体转染进Schneider 2细胞(美国典型培养物保藏中心，Manassas VA；Schneider(1972)J Embryol Exp Morphol 27353-365)。细胞在含有300μg/ml潮霉素B的培养基中生长6周，然后无抗生素选择生长3天。通过添加500μM CuSO4和100μM ZnSO4诱导CTGF表达，4天后收获培养基并如上所述离心和过滤澄清。
由上述方法产生的CTGF如下纯化。将4升条件培养基上样到用50mM Tris(pH7.5)、150mM NaCl预平衡的5ml HI-TRAP肝素柱(Amersham Biosciences Corp.，Piscataway NJ)。用增加的NaCl盐梯度从柱中洗脱CTGF。洗脱的级分用SDS-PAGE筛选，合并含有CTGF的级分。
用无热原双蒸水将肝素纯化的CTGF稀释至终电导率为5.7mS并将pH调节至8.0。使用与一含有约7ml树脂的羧甲基(CM)POROS聚苯乙烯柱(Applied Biosystems)串联连接的含有约23ml树脂的Q-琼脂糖强阴离子交换柱(Amersham Biosciences)以除去内毒素，并捕获和洗脱纯化的rhCTGF。在加样前，串联柱用0.5M NaOH洗，之后用0.1M NaOH洗，最后用平衡缓冲液洗。加样样品走过串联柱，移走Q-琼脂糖柱，用350mM至1200mM NaCl梯度从CM POROS柱(Applied Biosystems)洗脱CTGF。含有CTGF的洗脱级分的纯度用SDS-PAGE分析评估，之后形成一最终样品库。
实施例2CTGF N-末端和C-末端片段产生
CTGF的N-末端和C-末端片段如下制备。将如上所述制备并纯化的重组人CTGF通过用胰凝乳蛋白酶珠(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)以1.5mg CTGF/单位胰凝乳蛋白酶处理而在室温消化6小时。离心混合物，弃去胰凝乳蛋白酶珠，用50mM Tris，pH7.5以1∶5稀释含有酶裂解的rhCTGF的上清。稀释的上清加样于Hi-Trap肝素柱。收集含有CTGF的N-末端片段的流过液(flow-through)。肝素柱用350mM NaCl洗涤，用350mM至1200mM NaCl线性梯度如上所述洗脱结合的CTGF C-末端片段。级分用SDS-PAGE分析，合并含有CTGF的C-末端片段的级分。
将含有CTGF的N-末端片段的肝素柱流过液调节至0.5M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5，然后上样于已用0.5M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5预平衡的15ml苯基琼脂糖HP柱(Amersham-Pharmacia)。用15柱体积的0.5M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5洗柱，用0.5M至0M硫酸铵/50mM Tris，pH7.5的线性梯度、约15个柱体积洗脱结合的CTGF的N-末端片段。用SDS-PAGE分析级分，合并含有CTGF的N-末端片段的级分。合并的溶液用ULTRACEL AMICON YM10超滤膜(Millipore Corp.，Bedford MA)浓缩并且缓冲液用50mM Tris，400mMNaCl(pH7.2)交换。
实施例3人抗CTGF单克隆抗体的产生
用HUMAB小鼠品系HCo7、HCo12和HCo7+HCo12(Medarex，Inc.，Princeton NJ)制备抗人CTGF的完全人单克隆抗体。在2-4周期间将小鼠用多至10次腹膜内(IP)或皮下(Sc)注射在完全弗氏佐剂中的25-50mg重组人CTGF免疫。通过眶后放血监控免疫应答。用ELISA筛选血浆(如下所述)，具有足够效价的抗CTGF免疫球蛋白的小鼠用于融合。在处死之前3天和2天用抗原静脉内加强免疫小鼠，取出脾。
来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与数目为其四分之一的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas VA)用50％PEG(Sigma，St.Lousi MO)融合。细胞以约1×105细胞/孔铺在平底微量滴定板中并在含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠、10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC)条件培养基、3-5％origen(Igen International，Gaithersburg MD)、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1xHAT(Sigma)的高葡萄糖DMEM(Mediatech，Herndon VA)中温育约2周。1-2周后，细胞在其中HAT被HT代替的培养基中培养。然后用ELISA筛选各个孔(如下所述)。将分泌抗体的杂交瘤再铺板、再筛选，并且如果是抗CTGF抗体阳性的，则通过有限稀释至少亚克隆2次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于鉴定。将来自每一杂交瘤的保留亲代细胞的反应性的一个克隆用于产生5-10瓶细胞库，储存在液氮中。
如Fishwild等人(1996，Nature Biotech 14845-851)所述进行ELISA分析。简而言之，将微量滴定板用在PBS中的1-2μg/ml纯化的重组CTGF以50μl/孔包被，在4℃温育过夜，然后用200μl/孔于PBS/Tween(0.05％)中的5％鸡血清封闭。来自CTGF免疫小鼠的血浆或杂交瘤培养物上清的稀释液添加到每孔中并在环境温度下温育1-2小时。用PBS/Tween洗板，然后板与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的山羊抗人IgG Fc多克隆抗体在室温温育1小时。洗涤后，板用0.22mg/mlABTS底物(Sigma)显色并用分光光度计在415-495nm分析。
实施例4抗体鉴定
产生抗人CTGF抗体的杂交瘤如实施例3所述制备。将克隆的杂交瘤细胞在含有8mM L-谷氨酰胺、x非必需氨基酸和10％胎牛血清的Dulbecco’s改良的Eagle培养基-高葡萄糖/RPMI 1640(50∶50)中生长。为了制备抗体而扩增的细胞在含有1.5％低IgG胎牛血清的相同培养基中于37℃、6％CO2下生长4-9天。所得条件培养基去除细胞并用切向流过滤/浓缩体系洗脱浓缩。浓缩物过A蛋白柱，用100mM甘氨酸，pH3洗脱结合的单克隆抗体。洗脱液用1M Tris，pH8.0中和并对PBS透析。
4.1表位作图(epitope mapping)
通过竞争结合实验对抗体的表位作图是免疫学领域技术人员熟知的(参见例如Van Der Geld et al.(1999)Clinical and ExperimentalImmunology 118487-96)。对从一独特的克隆杂交瘤细胞繁殖的细胞分离的每一抗体群用标准的结合及阻断实验进行作图，并指定到人CTGF上的特异的结合结构域(参见例如，AntibodiesA LaboratoryManual(1988)Harlow and Lane(eds)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress；Tietz Textbook of Clinical Chemistry，2nd ed.，(1994)Chapter 10(Immunochemical Techniques)，Saunders；and Clinical ChemistryTheory，Analysis，Correlation(1984)Chapter 10(ImmunochemicalTechniques)and Chapter 11(Competitive Bidng Assays)，C.V.Mosby，St.Louis)。最初通过抗体竞争实验限定了独立的结合结构域，其中两个不同抗体依次在CTGF包被的平板上温育。如果第一个抗体的立体位阻阻止第二个抗体与CTGF结合，则将两个抗体指定到同一结合结构域。但是应理解的是两个抗体可能具有不同的表位，其互相足够接近从而被认为是同一结合结构域的成员。
鉴别了跨越人CTGF全部4个外显子的结合结构域。所有结合结构域均被构象限定，从而所述抗体与CTGF在western印迹测定中的非还原条件下结合。一些抗体在western印迹测定中的还原条件下也与CTGF结合，提示这些抗体的每一种与CTGF蛋白上的一线性表位结合。另外，代表结合结构域一个亚集合的抗体在western印迹分析中显示与小鼠CTGF的交叉反应性。来自对完整CTGF具有最高亲和性的每一组的抗体用于进一步鉴定和分析。
更精细的表位作图使用特异的重组表达的CTGF片段由ELISA分析进行。例如，通过对得自CTGF基因外显子2和/或外显子3的重组表达的固定化片段进行的ELISA分析鉴别了识别CTGF的N-末端结构域上的表位的抗体。以此方式，选择并进一步鉴定了特异性识别CTGF的N-末端结构域或N-末端片段的抗体。还选择并进一步鉴定了特异性识别CTGF的C-末端结构域或C-末端片段的抗体。
由mAb1限定的表位组与由外显子3编码的CTGF的N-末端片段上的一线性表位结合。产生一系列覆盖由外显子3的多核苷酸编码的区域的截短的合成肽，用这些肽进行ELISA测试以进一步限定mAb1的表位。结果总结于表1，表1中“+”表示肽和mAb1之间有结合，而“-”表示mAb1不与肽结合。粗斜体“C”表示肽中对于mAb1结合是关键性的半胱氨酸残基。下划线“C”表示添加到末端的不是天然CTGF序列的一部分的半胱氨酸残基。
表1 mAb1与由外显子3编码的截短的肽系列的结合
因此，mAb1是结合CTGF的N-末端区域的抗体组的成员。CTGF上对于结合mAb1充分必要的线性表位由人CTGF(SEQ ID NO2)的氨基酸残基L143至V154限定。MAb1对这一肽的结合特异性的进一步证实通过RIA和亲和性层析获得。部分或全部共享这一表位的抗体特别包括在本发明内。另外，与mAb1竞争结合CTGF或其片段的抗体也特别包括在本发明内。
4.2针对CTGF的抗体亲和性
抗体亲和性定义为抗体上的一个单一抗原结合位点与抗原上一个单一表位之间的总非共价相互作用的强度。亲和性通过测量缔合常数(Ka)而如下计算
其中[Ab]是抗体上游离抗原结合位点的浓度，[Ag]是游离抗原浓度，[Ab·Ag]是抗体上的由抗原占据的抗原结合位点的浓度，Kd是抗体-抗原复合物的解离常数。
由表位作图鉴别的每一抗体群的亲和性用RIA测量，其中完整的rhCTGF如下所述用放射性碘标记，并加入到含有固定化单克隆抗体的孔中。使用氯胺-T方法用125I放射性标记重组人CTGF(参见Greenwood et al.(1963)Biochem J 89114-123)。典型地，至少60％的125I被掺入并且标记的CTGF的比活至少为1×105cpm/ng，当然更低比活的标记的CTGF也可以用于放射性免疫测定。将在不含Ca2+和Mg2+的DPBS(Mediatech，Herndon VA)中的山羊抗人IgG，γFc特异性捕获抗体(Jackson ImmunoResearch)加到MAXISORP BREAKAPART微量滴定板(Nalge Nunc International，Rochester NY)的孔中，使得在4℃结合过夜。然后用在不含Ca2+和Mg2+的DPBS中的1％BSA于4℃封闭孔至少4小时。除去封闭溶液，加入100μl的在不含Ca2+和Mg2+的DPBS中浓度为2-50ng/ml的测试抗体，在4℃结合过夜。将在恒定量的[125I]rhCTGF中的未标记的CTGF系列稀释混合物加入到孔中，于室温温育4-8小时。然后用在不含Ca2+和Mg2+的DPBS中的0.1％Tween 20(Mediatech)洗孔4次，分离微量滴定板的各个孔，在γ计数器中计数。
通过斯卡查德方法(1948，Ann NY Acad Sci 51660-72)用图表方式估计亲和性。施加于微量滴定板的标记的CTGF的总浓度如下计算
其中cpm_applied是得自对照瓶的计数，对照瓶与CTGF混合物平行加样于微量滴定板的孔中；cpm/fmol是[125I]CTGF的比活，[CTGF]cold_stock是加入到每孔中的未标记的CTGF的浓度，dilution是未标记的CTGF的稀释倍数。
结合于抗体的CTGF的浓度根据结合于孔的计数与施加于孔的CTGF的总浓度的比率而计算
游离的(未结合的)CTGF的浓度是施加的CTGF总浓度与结合的CTGF浓度之差。
[CTGF]free＝[CTGF]total-[CTGF]bound
确定本发明抗体的亲和性的斯卡查德图如图2所示。图2A图示了在存在增加的浓度的未标记的rhCTGF条件下，本发明抗体mAb2与[125I]rhCTGF的结合。图2B图示了在存在增加的浓度的未标记的rhCTGF条件下，本发明的示例性抗体mAb1与[125I]rhCTGF的结合。对于具有相似比例的结合和未结合的CTGF的点给予更多的注意(weight)，因为这些点具有超过空白很多的结合的计数(因此，是很确定的结合计数)，但仍然比施加的总计数低很多(因此，是很确定的游离计数)。最大结合(Bmax)和Kd分别以x截距和y截距表示。
mAb1对CTGF的亲和性(Kd)低于10-9M，这一亲和性是在商业成功抗体治疗剂中发现的典型亲和性(参见例如，Maini et al.(1998)Arthritis Rheum 411552-1563；Targan et al.(1997)N Engl J Med3371029-1035；Bumgardner et al.(2001)Transplantation 72839-45；和Kovarik et al.(1999)Transplantation 681288-94)。因此，mAb1是治疗用途的合适候选物，并且如上所述的与mAb1共享表位结合并具有类似于或大于mAb1的对CTGF亲和性(即Kd≤10-9)的抗体也是类似的治疗用途的合适候选物。与mAb1共享表位结合但具有比mAb1低的亲和性(即较高Kd)的抗体也包括在本发明内，并可潜在用于所述的各种测定和诊断应用中。这些抗体还可另外用于治疗应用，特别是如果它们具有对抗原的高亲合力，如下所述。
4.3抗体亲合力(Antibody)Avidity)
对于具有超过一个抗原结合位点(多价)的抗体而言，在一个结合位点的亲和性不总是反应抗体-抗原相互作用的真正强度。当一个多价抗体与一个具有多个重复表位的抗原结合时，在抗体的一个结合位点上的一个抗原相互作用增加了抗原与其它结合位点相互作用的机会。亲合力测量抗体与其抗原的功能性组合强度，其与表位和互补位之间反应的亲和性以及抗体和抗原的价态均相关。因此，亲合力提供了对抗体解离倾向的更精确的测量。
高亲合力可补偿低亲和性。例如，IgM抗原结合位点通常比IgG亲和性低，但是IgM的多价使得其具有高亲合力，由此使得其有效结合抗原。
为了确定本发明抗体的亲合力，首先通过常规木瓜蛋白酶消化相应的免疫球蛋白而制备Fab片段。然后用固定化的A蛋白将Fab片段从Fc和未消化的抗体中分离。
用消化缓冲液(DB；20mM磷酸钠、10mM EDTA、20mM半胱氨酸，pH7.0)洗涤含有0.5ml沉积的(settled)凝胶、250μg木瓜蛋白酶和3.5BAEE单位的约1ml固定化的木瓜蛋白酶浆，每次1ml消化缓冲液洗涤3次，和每次10ml消化缓冲液洗涤1次。然后将所述木瓜蛋白酶浆用0.3ml DB重悬，与1.1ml抗体(约5mg，pH7)混合，于37℃振荡过夜。抗体消化物然后从树脂中分离出，通过用A蛋白进行亲和层析将Fab片段从Fc片段和未消化的抗体中分离出。Fab片段的纯度用SDS-PAGE监测(图3A)。
通过用变化浓度的硫氰酸盐洗脱抗原结合的抗体而区分单价结合和二价结合。通过增加溶液中的离液离子(硫氰酸根)浓度，首先破坏低亲和性缔合(例如，Fab与抗原的单价结合)，而较高亲和性缔合(例如IgG与配体的二价结合)不被干扰。因此，通过增加硫氰酸盐浓度，可以区分两种不同的结合。
平板用在50mM碳酸氢盐缓冲液(pH8.5)中的10μg/ml CTGF或CTGF肽于4℃包被过夜，用封闭剂酪蛋白/TBS在4℃封闭过夜，然后与100μg/ml抗体或相应Fab在封闭剂酪蛋白/TBS中于室温振荡下温育过夜。平板然后与硫氰酸盐(0-7.6M)在100mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)中的稀释液(1∶1)于室温振荡下温育15分钟，之后与碱性磷酸酶-小鼠抗人(Fab’)2缀合物(1∶1000稀释)在室温温育45分钟。添加溶于1M二乙醇胺、0.5mM MgCl2(pH9.8)中的碱性磷酸酶底物(1mg/ml；Sigma)，平板在室温温育，在2、10、20和60分钟后测定405nm处的吸光度。
亲和性指数(affinity index)是将初始吸光度降低50％的离液剂(硫氰酸盐)浓度。对于本发明的示例性抗体mAb1，用于将Fab与CTGF解离的亲和性指数是0.46M，而将完整IgG与CTGF解离的亲和性指数是1.8M(图3B)。因此，mAb1主要以双价与抗原结合(亲合力)，并且从抗原解离比单价结合的抗体慢许多。与mAb1共享表位结合参数的本发明的其它抗体可以是类似的二价的，或者它们可以是单价或多价的。本发明的任何抗体均可被操作以改善亲合力，例如通过将表位结合位点组合在一个单一抗体构建体中进行，例如一个tribody等(参见例如，Schoonjans et al.(2000)J Immunol 1657050-7057)。
4.5交叉反应性
使用上述放射免疫测定(实施例4.2)确定抗体的交叉反应性，但是用另一种未标记的竞争剂即衍生自正常大鼠肾(NRK)细胞的大鼠CTGF代替未标记的rhCTGF。培养NRK细胞直至铺满，然后将培养基更换成含有2ng/ml TGF-β2、50μg/ml肝素和250μg/ml BSA的无血清培养基。在培养2天后收集条件培养基，离心除去碎片，与肝素-琼脂糖珠(1/100v/v珠悬液∶培养基)在4℃、振荡下温育2小时。然后离心混合物，收集珠并用PBS洗，然后在SDS缓冲液中裂解。
在增加浓度的未标记的大鼠CTGF存在下，mAb2与[125I]rhCTGF的结合的斯卡查德图如图4A所示；在增加浓度的未标记的大鼠CTGF存在下，mAb1与[125I]rhCTGF的结合的斯卡查德图如图4B所示。如图所示，mAb1与人和大鼠CTGF均结合，而mAb2与人CTGF结合但不与大鼠CTGF结合。
对于mAb1，与大鼠CTGF竞争的斯卡查德图(图4B)比与rhCTGF竞争的斯卡查德图(图2B)具有更小的斜率、更低的表观亲和性和更高的表观Bmax。因此，尽管大鼠CTGF能与人CTGF竞争结合mAb1，但是所述抗体对重组人CTGF的亲和性比其对重组大鼠CTGF的亲和性更高。mAb1还与小鼠和猴CTGF交叉反应(数据未示出)。显示对来自其它物种的CTGF的合适亲和性的抗体可用于治疗和预防那些物种中的疾病。例如，显示对犬CTGF具有合适Kd的本发明抗体可用于治疗狗中的CTGF相关疾病。显示跨物种亲和性的本发明抗体如mAb1也可用作研究工具，以在各种动物模型中研究CTGF相关疾病。
4.5糖基化
上述放射免疫测定(实施例4.2)被用于确定抗体糖基化对于抗原结合亲和性的作用。在PBS，0.5M EDTA，pH8.0中用从N联糖蛋白裂解寡糖的肽N-糖苷酶F(PNGase F)于37℃处理抗体mAb1 8天。在温育后，反应溶液直接使用或者在A蛋白-琼脂糖FASTFLOW柱(Amersham Bioscience，Piscataway NJ)上分级分离并用0.1M甘氨酸-HCl，pH2.5洗脱。分级分离后抗体回收率大约为87％，内毒素水平为0.30EU/mg。经SDS-PAGE证实去糖基化。去糖基化的抗体对人重组CTGF的结合活性与抗体的糖基化形式的结合活性在实验误差范围内是相同的。
由于不同细胞产生不同糖基化模式，所以在培养的细胞或非同源物种中生产重组蛋白如抗体可产生非天然糖基化。一些蛋白质的活性需要特异的糖基化，并且改变的糖基化会降低活性；例如在抗体的情况中，对抗原的亲和性降低。在某些系统例如植物和鸡蛋中，蛋白质产生还可产生是免疫原性的糖基化模式，由此降低在某些应用中使用这些蛋白质的能力。本发明的抗体在糖基化形式和非糖基化形式中显示相同活性的能力证实本发明不受限于存在糖基化，特别是物种特异性糖基化。
实施例5细胞迁移分析
细胞迁移是例如在发育和伤口愈合过程中正常并且重要的细胞事件。细胞迁移还是诸如纤维化损伤形成等疾病病理学的因素，从纤维化损伤分离的细胞比来自相应正常组织的细胞更响应趋化性刺激物。
用Boyden小室测定(Boyden chamber assay)如下分析本发明的抗体抑制CTGF刺激的平滑肌细胞的趋化迁移的能力。将在含有0.1％胎牛血清(FCS)的培养基中的大鼠动脉平滑肌细胞(ASMC)添加到Boyden小室的上室中，将含有300ng/ml rhCTGF、10％FCS或0.1％FCS单独的培养基加到下层室中。孔径为8μm的胶原蛋白包被的滤膜将上室与下室分隔开。使细胞粘着和迁移通过滤膜2-3小时。然后取下滤膜，将滤膜上的细胞固定并染色，计数迁移通过滤膜的细胞。相对于0.1％FCS对照，与300ng/ml rhCTGF温育使迁移通过滤膜的细胞数增加了约5倍。由CTGF刺激的迁移的增加大约是用含有多种趋化因子的10％FCS刺激所见的趋化效应的27％。
用上述测定测试了本发明抗体抑制CTGF介导的细胞迁移的能力，不同之处是还将抗CTGF抗体(以30和300mg/ml)或集合的人IgG加入到下层室中。在每一测定中对于每一样品计数3个独立滤膜中每一滤膜的4个视野的细胞。结果见表2。
表2 对CTGF介导的细胞迁移的抑制
如表2所示，在由mAb1限定的表位内结合CTGF的抗体以剂量依赖方式抑制CTGF介导的细胞迁移。这一表位组的抗体是所测试的抗CTGF抗体中仅有的能重复和可再现地抑制CTGF诱导的迁移的抗CTGF抗体。
如血管发生、软骨发生和癌发生等各种过程需要细胞粘着和迁移的改变。CTGF与细胞粘着和迁移均相关，抗CTGF抗体的相对于一种活性不同地影响另一种活性的能力提供了用于治疗CTGF相关病变的不同治疗剂的各种组成。本发明提供的抗体清楚地表明相关于CTGF活性中和的差异活性。如下所示，这些能力在这一类抗CTGF抗体中提供了独特的治疗潜力。
实施例6肺部疾病
在小鼠中气管内(IT)滴注博来霉素是一种广泛应用的用于研究肺纤维化和筛选潜在期望的抗纤维化药的模型系统。使用Wang et al.(2000)Biochem Pharmacol 601949-1958所述方法如下测试了本发明的抗体在体内降低博来霉素诱导的肺纤维化的能力。
将雄性C57BL/6小鼠随机分成2组。用异氟烷麻醉小鼠，然后用单剂溶于0.9％盐水中的博来霉素以0.1单位/50μl/小鼠或者0.9％盐水单独气管内注射。每组分开后立即用盐水或抗体腹膜内(IP)给药治疗，之后每隔1天进行治疗，总共7剂。IT滴注后14天，小鼠通过在麻醉下降腹主动脉放血而安乐死，采集肺组织。
通过使用Palmerini等人的方法(1985；J Chromatogr 339285-292)测量羟脯氨酸和脯氨酸水平来分析肺胶原蛋白含量，只是以L-铃兰氨酸(Aldrich)代替3，4-脱氢脯氨酸作为内标。简而言之，将组织样品于105℃在6N HCl中水解22小时。将样品用邻苯二醛、随后用4-氯-7-硝基苯并呋喃(Aldrich)进行柱前衍生以形成脯氨酸和羟脯氨酸的荧光加成物。通过反向HPLC分离所述荧光加成物，然后进行荧光检测。
图5显示了治疗性给予盐水(SA)、本发明的示例性抗体mAb1的结果，并比较了CTGF特异性抗体集合(AbsJ)在博来霉素处理后抑制肺纤维化的能力。如图5A所示，博来霉素处理(BL+SA)显著增加了肺羟脯氨酸含量，是对照组(SA+SA；220±15μg/肺)的168％。但是随后用集合的本发明抗体(BL+AbsJ)治疗显示出与博来霉素单独处理相比肺羟脯氨酸降低60％。类似地，随后用mAb1治疗(BL+mAb1)显示出与博来霉素单独处理相比肺羟脯氨酸降低70％。
小鼠肺的组织学检查发现在对照组是正常肺实质组织(未示出)。但是在博来霉素处理的肺中，清楚可见纤维化区域增加(图5B箭头处)。在博来霉素处理后治疗性给予本发明的抗体显示纤维化明显降低(图5C)，尽管一些肺叶仍有轻微程度间质纤维化。因此，本发明的抗体当给予患有肺部疾病如自发性肺纤维化(IPF)或处于患所述肺部疾病风险的患者时能提供治疗益处。
实施例7肾病
7.1肾衰竭
肾小管间质纤维化是与几种进展到终末期肾衰竭相关的肾病的主要因素(Sharma et al.(1993)Kidney Int 44774-788)。特征在于肾功能降低和间质纤维化增加的单侧输尿管梗阻(UUO)用作实验模型以诱导肾小管间质损伤和纤维化(Fern et al.(1999)J Clin Invest10339-46)。
小鼠用异氟烷麻醉，然后根据Moriyama et al.(1998；Kidney Int54110-119)所述的方法进行左输尿管结扎。在手术后立即并且之后每隔1天用腹膜内(IP)给药的盐水或抗体治疗小鼠1次，总共7剂。UUO后14天，麻醉动物并通过降腹主动脉放血处死动物。将右肾和左肾分别除去被膜并分别称重。将每个肾的一半在10％福尔马林中进行组织学固定(三色染色)，另一半称重并在-70℃储存以用于羟脯氨酸测定。羟脯氨酸和脯氨酸如上所述测定。
如图6A所示，UUO使肾胶原蛋白含量增加了约4倍，这通过测定每只小鼠中梗阻的左肾相对于未梗阻的右肾的羟脯氨酸与脯氨酸之比而确定。用本发明抗体mAb1治疗在梗阻肾中导致统计学显著的剂量依赖性纤维化降低(图6A)。但是结合CTGF的C-末端表位的抗体mAb3未显示出显著效果。UUO肾的三色染色鉴别了增加了胶原蛋白蓄积的区域(图6B，箭头)，而用本发明抗体治疗显示在梗阻的肾中的胶原蛋白染色显著降低(图6C)。
或者，可以在进行性肾衰竭的大鼠残肾(remnant kidney)模型中研究肾纤维化。这一模型涉及2/3单侧肾切除术组合对侧完全肾切除术(5/6总肾切除术)，其在残肾中诱导与慢性肾衰竭相关的变性实质变化，动物变成尿毒症并呈现出明显的蛋白尿、肾血管球硬化症、间质纤维化和肾小管萎缩。(参见例如Frazier et al.(2000)Vet Pathol37328-335；and Gandhi et al.(1998)Kidney Int 541157-1165)。
根据Frazier et al.(2000，Vet Pathol 37328-335)所述进行5/6肾切除术。平均重量为120g的5周龄雄性Sprague-Dawley大鼠(Harlan，Indianapolis IN)用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，切除左肾头部1/3和尾部1/3。用纱布棉拭短暂止血，腹腔用盐水、0.2ml butorphenol清洗，缝合动物。最初手术一周后，完全摘除对侧肾。
大鼠被分成盐水治疗组和抗体治疗组，在5/6肾切除术后2周开始治疗。每3天经IP注射(每次0.5mL)以剂量为5mg/kg给予盐水或抗体，共15天(总共5次注射)。每周从随机肾切除大鼠取血样和尿样，以跟踪肾病发展和将肾功能失调与组织学变化相关联。在治疗开始后18和28天比较各组之间的来自肾纤维化分析、尿分析和血清化学测定的结果。
肾纤维化由两个病理学家独立地以不知情方式评估；用三种不同形态学染色检查每一肾的3个组织学切片苏木精/曙红、Masson’s三色和苦味酸-天狼星红(sirius red)。另外，在冷冻切片上进行免疫组织化学以评价在肾中每一位置的胶原蛋白沉积类型。进行定量胶原蛋白评估(羟脯氨酸/脯氨酸比率)并用在安乐死时收集的样品的尿分析和血清化学评价肾功能。
在未治疗的和抗体治疗的残肾之间观察到纤维化中的组织学中等程度差异(图7)。在治疗后3天，不知情的主观评价给出盐水治疗组的平均纤维化评分为12.6，而抗体治疗组的相应评分为10.7(p＜0.05)。在治疗后14天抗体和盐水治疗的大鼠之间仍保持组织纤维化分级中的统计学显著差异，在盐水治疗组中平均纤维化评分为16.9，而在抗体治疗组中为14.4(p＜0.05)。胶原蛋白的定量羟脯氨酸含量分析也证实在抗体治疗组中相对于盐水治疗组有纤维化降低的趋势，但是差异不是统计学显著的。
在治疗组之间也注意到定性差异。尽管抗体治疗组中大部分胶原蛋白沉积限于皮髓质间质和髓质间质，但是盐水治疗的大鼠的纤维化是多灶性的，在皮层和髓质中弥漫性分布。最显著的组织病理学差异是肾小球纤维化的量。盐水治疗组中有许多大鼠具有中等至严重的肾小球硬化症并伴有关节囊周纤维化、增厚的Bowman膜、粘连和肾小球退化。这些改变在其它组包括抗体治疗的大鼠肾中是很低至轻微的。用Masson’s三色和苦味酸-天狼星红染色观察胶原蛋白积聚。
在进行性肾衰竭模型中，本发明的抗体降低了组织降解并改善了肾功能。因此，本发明的抗体当给予患有肾病或处于患肾病风险中的患者时能提供治疗益处，所述肾病例如肾小球肾炎、IgA肾病、肾小球硬化症和由于毒素导致的肾衰竭和肾小管破坏等。
7.2糖尿病性肾病
糖尿病导致多器官衰竭，包括但不限于肾、心脏和眼。糖尿病性器官衰竭的病理学进展的一个主要组成是纤维化。糖尿病性肾病的一个已确立模型是携带在瘦素(leptin)受体(Ob-R；由db基因编码)中功能丧失突变的小鼠。db/db小鼠和人糖尿病性肾病之间共同的关键特征包括肾肥大、肾小球增大、蛋白尿和肾小球系膜基质增宽。
使用糖尿病性肾病的db/db小鼠模型如下测试了本发明的抗体。通过腹膜内注射本发明的抗体(CLN1；见下述)或对照人IgG(cIgG)治疗8周龄db/db小鼠(Harlan，Indianapolis IN)及其同窝出生的杂合db/+小鼠。在所有动物中，初次注射300μg抗体，随后100μg剂量每周给药3次，共60天。收集血样，并在治疗开始时和治疗期间定期测量体重。还记录食物消耗。
到11周，糖尿病(db/db)动物和非糖尿病(db/+)动物之间在体重、血糖水平和食物消耗方面存在明显区别。用本发明的抗体或对照抗体进行的治疗未明显影响这些参数中的任一个。但是，肾功能的各种测量证实糖尿病小鼠和非糖尿病小鼠之间的明显差异。如表3所示，糖尿病小鼠显示出相对于非糖尿病小鼠有增加的肾重量、肌酸酐清除和白蛋白排泄率(AER)。但是，用本发明的抗体治疗的糖尿病动物对于所有参数均显示出正常化的值。所有数据以平均值±SEM表示。每组小鼠数(n)从9至15。
表3 在db/db和db/+小鼠中的肾功能
**相对于db/+小鼠P＜0.01，*相对于db/+小鼠P＜0.01并且相对于cIgG治疗的db/db小鼠P＜0.05
△相对于cIgG治疗的db/db小鼠P＜0.01，□相对于db/+小鼠和cIgG治疗的db/db小鼠P＜0.01
由于CTGF由高葡萄糖诱导并且介导各种活性，包括作为损伤结果例如由于晚期糖化终末产物(AGE)形成和积累等所致在组织中产生ECM，所以可使用本发明的抗体预防与糖尿病相关的各种病理，如糖尿病性肾病。
实施例8眼病
已知增加的CTGF表达与各种眼病相关，包括增生性玻璃体视网膜病变(PVR)、黄斑变性和糖尿病性视网膜病(参见例如，Hinton et al.(2002)Eye 16422-428；He et al.(2003)Arch Ophthalmol1211283-1288；和Tikellis et al.(2004)Endocrinology 145860-866)。CTGF的作用和抗CTGF治疗剂的用途已经有描述(参见国际公开WO03/049773)。本发明的抗体代表了一类用于这种眼病的独特的治疗有效的抗CTGF治疗剂。本发明的抗体消除眼病并发症的能力在如下的眼病模型中测试。
8.1糖尿病性视网膜病
糖尿病的动物模型例如db/db小鼠在上述实施例7.2中描述。这些模型的任一种均可用于证实用本发明的抗体治疗糖尿病性视网膜病的效果。以下提供了一种特定的糖尿病性视网膜病的模型，其中动物用一种已知是分泌胰岛素的胰岛β细胞的毒素的链脲菌素(STZ)注射。
通过例如以约60-85mg/kg体重例如经腹膜内注射链脲菌素(STZ)而在大鼠(例如Long-Evans，Sprague-Dawley等)中诱导糖尿病。为了改善存活率，可以给予大鼠10％糖水24小时和/或在STZ注射后每天给予2-4单位胰岛素。在例如4、8和12周后测量各种因子，包括例如体重、尿蛋白排泄率、血糖、糖化血红蛋白、血压等。用缓冲液单独注射的对照动物同时操作。一半的STZ处理的和对照的大鼠额外用例如静脉内、腹膜内或眼内注射的本发明的抗体治疗。在整个研究过程中，动物可以随意接触食物和水。动物在12周处死，采集眼睛并检查组织学变化。
抗体治疗的动物相对于未治疗的对照在病理学改变中的降低是糖尿病性视网膜病治疗效果的指征。由于CTGF由高葡萄糖诱导并介导各种活性，包括例如由于晚期糖化终末产物(AGE)形成和积累等所致的作为损害结果的组织中ECM产生，所以与糖尿病相关的病理例如糖尿病性视网膜病可用抗CTGF治疗剂预防(参见例如国际公开WO03/049773)。本发明的抗体代表了一类用于眼病例如糖尿病性视网膜病的独特的治疗有效的抗CTGF治疗剂。
8.2 PVR
兔视网膜色素上皮(RPE)细胞从成年兔眼中分离并在补加10％胎牛血清的DMEM中培养。在所有后续注射中使用亚铺满的培养物(典型地在第2-3代)。在注射时，收集培养的RPE细胞并在PBS中重悬至约2.5×106细胞/ml。用25规格(gauge)针从每一受体兔眼取约0.2ml眼房水，然后用27规格针将RPE细胞经巩膜注射至位于角膜缘后3mm的位点，正好位于视盘之上。在注射RPE细胞后，将在PBS中的0.1ml PDGF BB(50-150ng)、CTGF(200-400ng)或PDGF和CTGF通过同一进入部位注射。每一动物未注射的眼睛用作对照。任选地，CTGF可在第1次注射后在第7天和/或第14天再次注射。一半的动物额外用例如静脉内、腹膜内或眼内注射的本发明抗体治疗。根据注射部位，抗体可每日提供或者不这样频繁给予，例如在第7、10、14天等给予。
用间接眼底镜程序检查动物以监控PVR发展和程度，其根据Fastenberg描述的参数分类(Fastenberg et al.(1982)Am J Ophthalmol93565-572)。然后处死动物用组织学检查分析眼睛中膜形成程度和纤维化程度。另外，可收集视网膜和纤维化膜以测量胶原蛋白含量。
或者使用从Frenzel et al(1998，Invest Ophthamol Vis Sci 392157-2164)调整而来的模型和程序，用视网膜下注射分散酶在兔眼中诱导PVR。用在PBS中的50ml(0.05U)分散酶(Sigma Chemical Co.)形成视网膜下泡(subretinal bleb)。一半的动物额外用例如静脉内、腹膜内或眼内注射的本发明的抗体治疗。在手术后一周未接受本发明抗体的注射的兔中有约75％诱导了视网膜脱落，在手术后两周约100％的这些动物有视网膜脱落。检查视网膜上膜(epiretinal membrane)的纤维化程度。
抗体治疗的动物相对于未治疗的对照在病理学改变中的降低是PVR治疗效果的指示。由于CTGF已表明与PVR模型中组织损害相关，因此已经提议抗CTGF剂是用于这类疾病的治疗剂(参见例如国际公开WO03/049773)。本发明的抗体代表了一类用于眼病例如PVR的独特的治疗有效的抗CTGF治疗剂。
实施例9硬化
硬化通常的特征为在皮肤(硬皮病)、关节和内器官、特别是食管、GI道、肺、心脏和肾中弥漫性纤维化、变性改变和血管异常。
9.1局部性肉芽肿诱导
当通过连续7天皮下注射给予人来源的TGF-β2和CTGF组合时，新生小鼠产生持久的局部性纤维化(Mori et al.(1999)J Cell Physiol181153-159；Shinozaki et al.(1997)Biochem Biophys Res Commun237292-297)。
出生后一天，将小鼠分成3个治疗组，并通过连续7天皮下注射进肩胛下区域含有800ng TGF-β2、400ng CTGF或者TGF-β2和CTGF两者的40μl 1％小鼠血清白蛋白(MSA)，PBS而给药。TGF-β2和CTGF组合组进一步分成2组，其中1组额外接受40μg本发明的抗体mAb1。在第11天，处死动物，加工注射部位切片并用Mason’s三色染色以进行组织学评价。随机化玻片，由3个科学家以不知情方式定性评价玻片，基于纤维化程度或结缔组织增宽程度评分从0(无变化)至4(纤维组织)(见图8)。然后计算来自所有观察者的对每一玻片的累积评分，用ANOVA检验比较各组之间的平均值。
对于载体对照、TGF-β2以及TGF-β2和CTGF组合的组平均评分分别是0.75、6.83和9.00(表4)。
表4 新生小鼠中的肉芽肿的组织学评分
1来自3个不同观察者的玻片的组评分
抗体治疗的组平均评分为6.17，其与相应的TGF-β2和CTGF组合相比时是统计学显著的下降(p＜0.05)，而用针对C-末端的非中和性抗CTGF抗体mAb3治疗未降低纤维化。因此，本发明的抗体在降低对组织的局部硬化损害方面特别有效。
9.2新生儿全身性纤维化(Neonatal Systemic Fibrosis)
将新生小鼠分成若干组，并连续21天每日腹膜内注射如下药物300μg/kg/天TGFβ、300μg/kg/天CTGF、各300μg/kg/天TGFβ和CTGF组合、或者在生长因子治疗前30分钟IP注射5mg/kg本发明的抗体mAb1后注射TGFβ和CTGF组合。在治疗过程中幼崽与其母亲待在一起。在第21天，处死动物，取出主要器官，如上所述测量总脯氨酸和羟脯氨酸。
每日注射TGFβ诱导了轻微的全身性纤维化，而CTGF单独不产生任何反应。TGFβ和CTGF组合诱导了全身性纤维化，在包括肝、肺、心脏、GI道、膈和肾在内的一些器官中有大量的胶原蛋白沉积(图10)；大量的肠粘连；以及死亡率上升25％。结合生长因子治疗给予本发明的抗体降低或预防了器官纤维化(图10)和肠粘连并防止了死亡。因此，本发明的抗体当全身性给药时还能有效降低对各种组织和器官的硬化损害。实施例10.1和10.2中的结果清楚地表明本发明的抗体当局部或全身性给药时对于治疗硬化病症是治疗上有效的。
9.3硬皮病
本发明的抗体可用于改善与硬皮病相关的纤维化。测量硬皮病中皮肤病的程度和严重性的方法是现有技术中已知的(参见例如，Rodnan et al.(1979)Arthritis Rheum 22130-40；Aghassi et al.(1995)Arch Dermatol 1311160-1161；Brennan et al(1982)Br J Rheumatol31457-460；Kahaleh et al.(1986)Clin Exp Rheumatol 4367-369；Falanga and Bucalo(1993)J Am Acad Derm 2947-51；Seyger et al.(1997)J Am Acad Derm 37793-796；Seyger et al.(1998)J Am AcadDerm 39220-225；Black(1969)Br J Dermatol 81661-666；Ballou et al.(1990)J Rheumatol 17790-794；and Enomoto et al.(1996)J Am AcadDerm 35381-387)。
例如，修改的Rodnan皮肤评分使用Type OO Rex DD-3数字硬度计(Rex Gauge Company，Buffalo Grove IL)以具有0.1单位分辨率的标准化硬度计单位测量皮肤硬度。硬度计测量在由Rodnan皮肤评分测量的所有相同皮肤部位进行。在基线扫描、本发明抗体给药前、在给药和后续跟踪期间每3个月进行皮肤评分和硬度计读数。每一测量重复4次，使用方差结构分析和同类相关系数计算以确定与部位相关的重复变化性和患者变化性(Fleiss(1971)Psychol Bull 76378-382)。还使用相关技术评价皮肤评分和硬度计评分之间的一致性，两种评分均提供在一给定时间点的总评分和亚组评分。还进行后延相关分析(例如，将进入时硬度计评分与在用抗体治疗t+3个月或t+6个月时的皮肤评分相关)。也可收集疾病活性和功能状态信息，包括胶原蛋白合成数据(PIIINP测量)。用上述任一项方法测量的硬皮病的症状和/或并发症的降低证实了本发明抗体的治疗效果。
实施例10骨关节炎
本发明的抗体在下述一个模型中被测试以证实其在骨关节炎中的治疗功效。下述实施例中，所用抗体的浓度在约0.015-15mg抗体/kg对象体重范围内，即剂量为约5mg抗体/kg体重被认为是合适的。
动物例如12周龄雄性C57BL/6小鼠在标准笼中饲养并喂以标准饮食，自来水随意饮用。
10.1在鼠膝关节中关节内注射AdCTGF
用ADEASY系统(Qbiogene，Carlsbad CA)根据生产商提供的程序制备含有CTGF的腺病毒表达载体构建体(AdCTGF)。简要地，用标准分子克隆技术将编码全长人CTGF的多核苷酸插入PSHUTTLE-CMV质粒(Qbiogene)中。然后线性化pShuttle-CMV-CTGF构建体并与PADEASY-1质粒(Qbiogene)经电穿孔共转染进感受态大肠杆菌(E.coli) BJ-5183细胞中。用Kim等人(2001，J Biol Chem 27638781-38786)所述的程序扩增并纯化AdCTGF，一个空腺病毒载体用作对照。AdCTGF和对照病毒在噬斑形成单位(范围1.0-2.1×1010/mol)和病毒颗粒(范围0.9-1.5×1012/mol)方面是类似的。
AdCTGF或对照腺病毒(1×107噬斑形成单位)经关节内注射；本发明的抗体经关节内、静脉内、腹膜内或皮下注射而给药。抗体可与腺病毒给药同时注射，或者治疗可在AdCTGF注射之前和之后开始。接受对照腺病毒的动物类似地用抗CTGF抗体或对照抗体注射。未注射的膝关节作为抗体影响的对照。
用Stoop等人(2001，Osteoarthritis Cartilage 9308-315)描述的程序，在AdCTGF注射后不同天数例如1、3、7、14和/或28天分离膝关节，在EDTA/聚乙烯基吡咯烷酮中脱钙14天，并储存在-20℃。分析关节的组织学以测量滑膜厚度和蛋白聚糖减少(depletion)；进行原位杂交和免疫组织化学以鉴别CTGF表达和另外的因子包括胶原蛋白(I型和/或III型)等的表达。收集滑膜液以确定CTGF、金属蛋白酶等的水平。用抗CTGF抗体进行治疗的功效通过相对于用AdCTGF注射的和用对照抗体治疗的动物的骨关节炎相关参数的降低而证实。
10.2在鼠膝关节中关节内注射AdTGFβ
或者，抗体可在Bakker等人(2001，Osteoarthritis Cartilage 9128-136)所述的骨关节炎动物模型中测试。例如，本发明的抗体或对照抗体可在关节内注射1×107pfu表达TGFβ的腺病毒构建体(AdTGFβ)的同时、随后或之前注射。未注射的膝关节作为抗体效果的对照。在各天，例如第3、7、14天等，处死来自每组的动物并分离组织并加工。分析关节的组织学以测量滑膜厚度、蛋白聚糖减少和骨赘形成等；进行原位杂交和免疫组织化学以鉴别CTGF表达和另外的因子包括胶原蛋白(I型和/或III型)等的表达。收集滑膜液以确定TGFβ、CTGF、金属蛋白酶等的水平。用本发明的抗体进行治疗的功效通过相对于用AdTGFβ注射的和用对照抗体治疗的动物的骨关节炎相关参数的降低而证实。
10.3在鼠膝关节中关节内注射木瓜蛋白酶
或者，抗体可使用van der Krann等人(1989，Am J Pathol 1351001-1014)所述的程序进行测试。关节内注射木瓜蛋白酶诱导骨赘形成、纤维化和关节软骨蛋白聚糖减少。木瓜蛋白酶模型通过将1单位木瓜蛋白酶溶液(Sigma，St.Louis，MO)注射进小鼠的右膝关节中而起始。每一动物的左膝用作内部对照。本发明的抗体可在关节内注射木瓜蛋白酶(0.5％/膝)的同时、随后或之前经关节内、静脉内、腹膜内、或皮下注射而给药。在各天，例如第3、7、14天等，处死来自每组的动物并分离组织并加工。分析关节的组织学以测量滑膜厚度、蛋白聚糖减少和骨赘形成等；进行原位杂交和免疫组织化学以鉴别CTGF表达和另外的因子包括胶原蛋白(I型和/或III型)等的表达。收集滑膜液以确定TGFβ、CTGF、金属蛋白酶等的水平。用抗CTGF抗体进行治疗的功效通过相对于用木瓜蛋白酶注射的和用对照抗体治疗的动物的骨关节炎相关参数的降低而证实。
实施例11克隆和表达
尽管下述实施例描述了本发明一个特定抗体的克隆和表达，但是所述方法适用于本文描述和要求保护的所有抗体。
本发明的一个示例性抗体mAb1首先作为由一杂交瘤细胞系(8C12-F10；其制备如实施例3所述)分泌的复合人抗体的一部分而被鉴别。
11.1 mAb1重链的克隆和测序
使用MICRO-FAST TRACK试剂盒(Invitrogen)根据生产商提供的方案从8C12-F10细胞培养物中分离信使RNA。然后用cDNA细胞循环试剂盒(cDNA cell cycle kit，Invitrogen)根据生产商提供的方案和下述重链反义引物之一经第二链合成产生两个cDNA集合(pool)AB90(TGCCAGGGGGAAGACCGATGG；SEQ ID NO3)m19H1504R(GCTGGGCGCCCGGGAAGTATGTA；SEQ ID NO4)
重链可变区序列通过使用AB90引物和一系列V区引物之一经PCR扩增AB90-引导的cDNA集合而被克隆，所述V区引物包括相应于编码各自编码区的5’末端的保守的分泌信号序列和编码成熟免疫球蛋白起始区的框架区1序列的引物。根据推荐的生产商方案做如下改变而使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)反应典型地在50μl总体积中进行，其含有1μl cDNA、0.75μM每一正向和反向引物、200μM每种dNTP和1μl Pfu聚合酶(2.5单位/μl)。使用一倒计数(countdown)热循环仪程序，在添加酶之前在94℃初始温育2分钟。然后使用如下循环参数94℃ 45秒、65℃ 45秒和72℃ 1分钟，10个循环；94℃45秒、55℃ 45秒和72℃ 1分钟，30个循环；然后72℃ 10分钟，1个循环。
只有一个重链信号序列引物AB87(ATGGAGTTTGGRCTGAGCTG；SEQ ID NO5)产生明显的产物，该引物结合VH3家族重链V区。453个核苷酸长的PCR产物被克隆进PCR BLUNT II-TOPO载体(Invitrogen)，筛选各个克隆以获得正确的插入物大小，测序了3个相应于PCR产物的克隆。所有三个克隆均获得相同序列。通过PCR扩增m19 H1504R引导的cDNA集合而克隆重链恒定和UTR区序列。用有义引物VH3-3329-51F(CGGCGGTGTTTCCATTCGGTGAT；SEQ ID NO6)和重链恒定区反义引物m19 H553R(GGGCGCCTGAGTTCCACGACAC；SEQID NO7)扩增出一601个核苷酸长的PCR片段，其相应于重链区段的5’末端。根据生产商指导，使用拓扑异构酶介导的克隆将PCR产物克隆进PCR-BLUNT II载体(Invitrogen)中，然后测序插入物。类似地，用有义引物m19 H439F(GTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTC；SEQID NO8)和反义引物m19 H943R(CCCGCGGCTTTGTCTTGGCATTAT；SEQ ID NO9)扩增出一505个核苷酸长的PCR片段，用有义引物m19 H1002F(CTGGCTGAATGGCAAGGAGTA；SEQ ID NO10)和反义引物m19H1504R扩增出一503个核苷酸长的PCR片段。将两个片段分别克隆进PCR-BLUNT II载体(Invitogen)并如上所述测序。586个核苷酸长的第4个重链PCR片段是使用有义引物m19 H645F(GGGCACCCAGACCTACATC；SEQ ID NO11)和反义引物m19H1230R(CTCCGGCTGCCCATTGCTCTCC；SEQ ID NO12)扩增的，并且被直接测序。
图11A显示所述克隆的PCR片段的序列对比排列，其提供了编码mAb1重链(SEQ ID NO14)的全长核苷酸序列(SEQ ID NO13)。重链可变区的氨基酸序列最接近地与VH3生殖系基因DP-44相似。尽管无法了解哪种D区段被用到，但是mAb1的序列最接近地与DH4家族相似。JH区与生殖系JH4和JH5最接近地匹配。mAb1的重链恒定区与GenBank登录号BC016381匹配，表明是G1m(3)同种异型(allotype)。
11.2 mAb1轻链的克隆和测序
使用MICRO-FAST TRACK试剂盒(Invitrogen)根据生产商提供的方案从8C12-F10细胞培养物中分离信使RNA。然后用cDNA细胞循环试剂盒(cDNA cell cycle kit，Invitrogen)根据生产商提供的方案和下述轻链反义引物之一经第二链合成产生两个cDNA集合AB16(CGGGAAGATGAAGACAGATG；SEQ ID NO15)Ck-760R(AAGGATGGGAGGGGGTCAGG；SEQ ID NO16)
轻链可变区序列通过使用AB16引物和一系列V区引物之一经PCR扩增AB16-引导的cDNA集合而被克隆，所述V区引物包括相应于编码各自编码区的5’末端的保守的分泌信号序列和编码成熟免疫球蛋白起始区的框架区1序列的引物。根据推荐的生产商方案做如上所述改变和使用如上所述循环参数而使用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)。
只有一个轻链信号序列引物AB123(CCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTG；SEQ ID NO17)产生明显的产物，该引物结合VK1家族重链V区。408个核苷酸长的PCR产物被克隆进PCR BLUNT II-TOPO载体(Invitrogen)，筛选各个克隆以获得正确的插入物大小，测序了3个相应于PCR产物的克隆。所有三个克隆均获得相同序列。
通过PCR扩增Ck-760R引导的cDNA集合而克隆轻链恒定区序列。用轻链反义引物L15 22m(TCAGWCYCAGTCAGGACACAGC；SEQ ID NO18)和Ck-760R扩增轻链的完整编码区和5’UTR区。将所述788个核苷酸长的片段克隆进PCR BLUNT II载体(Invitrogen)并测序。所得质粒命名为41m6。
图11B显示所述克隆的PCR片段的序列对比排列，其提供了编码mAb1轻链(SEQ ID NO20)的全长核苷酸序列(SEQ ID NO19)。轻链可变区的氨基酸序列与生殖系Vk L15和Jk2核苷酸序列编码的区域最接近地匹配。mAb1的轻链恒定区与报道的人生殖系κ轻链免疫球蛋白基因序列相同(Whitehurst等人(1992)Nucleic Acids Res204929-4930)。
11.3 mAb1重链和轻链表达构建体的产生
通过重叠延伸PCR在两个步骤中从以上所述以及图11A所示的重链PCR产物产生全长mAb1重链cDNA。在一PCR重叠延伸反应中用远距离引物(distal primers)VH3-33 29-51F和m19 H943R将两个5’PCR产物组合在一起产生一个991个核苷酸长的单一片段。类似地，在一PCR重叠延伸反应中用远距离引物VH3-33 29-51F和m19H943R将两个3’PCR产物组合在一起产生一个860个核苷酸长的单一片段。这两个PCR延伸反应产物然后被凝胶纯化并用远距离引物VH3-33 29-51F和m19 H1504R一起扩增产生全长mAb1重链的1407个核苷酸长的cDNA(SEQ ID NO13的残基441至1847)编码序列。
然后将所述重链cDNA克隆进PCR-BLUNT II TOPO载体(Invitrogen)以产生质粒43a4。然后通过用BamHI和XbaI限制性内切酶消化质粒43a4，随后将切割的插入物连接进已预先用BamHI和Nhe限制性内切酶消化的PCDNA5-FRI表达载体(Invitrogen)而亚克隆mAb1重链编码区。所得表达载体44a1的插入物经测序验证，之后类似地反向亚克隆进PBK-CMV载体(Clontech)以产生质粒47a4，和反向亚克隆进衍生自pCEP4载体(Invitrogen)的pCEP-Pu载体(E.Kohfeldt，Max-Planck-Institut fur Biochemie)以产生质粒49a1。
用HindIII和XhoI限制性内切酶从如上所述的质粒41m6切下编码全长mAb1轻链的708个核苷酸长的cDNA(SEQ ID NO19的残基415至1122)，并连接进预先已用HindIII和XhoI限制性内切酶消化的PCDNA5-FRT载体(Invitrogen)中，以产生哺乳动物表达质粒42b2。质粒42b2的插入物经测序验证，之后类似地反向亚克隆进PBK-CMV载体(Clontech)以产生质粒47b3，和反向亚克隆进pCEP-Pu载体(E.Kohfeldt，Max-Planck-Institut fur Biochemie)以产生质粒49b1。
11.4抗体链构建体的转染和表达
用标准程序单独用质粒44a1(mAb1重链)和42b2(mAb1轻链)转染COS7细胞，并且用这两个质粒共转染COS7细胞。如实施例4所述(见上述)测定条件培养基以检测抗体的存在。用上述程序经ELISA测量，仅有来自用44a1和42b2共转染的细胞的培养基表达具有CTGF结合活性的人抗体。由共转染的COS7细胞产生的抗体在本文中称为CLN1，其结合CTGF的N-末端一半(N-terminal half)的亲和性为0.8nM。
CLN1也在遗传修饰的中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达。表达示例性抗体CLN1的CHO细胞系于2004年5月19日保藏在美国典型培养物保藏中心(Manassas VA)，ATCC保藏号为＿＿＿。可以使用现有技术中已知的各种技术优化细胞系和增强抗体表达，所述技术例如Wigler等人所述(1980；Proc Natl Acad Sci USA 773567-3570)并且由Ringold等人(1981；J Mol Appl Genet 1165-175)、Gasser等人(1982；Proc Natl Acad Sci USA 796522-6526)和Kaufman等人(1985；Mol CellBiol 51750-1759)加以修改的基因扩增。
实施例12CTGF与TGFβ的相互作用
本发明的抗体特异地与CTGF的由外显子3(图1B；SEQ ID NO1的核苷酸418至核苷酸669)编码的残基所限定的区域结合。这一区域包含SEQ ID NO2的氨基酸97至氨基酸180，并包括von WillebrandC型结构域(SEQ ID NO2的氨基酸103至氨基酸164)和mAb1的表位(SEQ ID NO2的氨基酸134至氨基酸158)。Abreu等人(2002，NatCell Biol 4599-604)报道相应于CTGF的VWC结构域的结构域对于CTGF与TGFβ或BMP-4之间的相互作用是重要的，并且所述相互作用调节TGFβ和BMP-4的活性。下述实验证实由外显子3编码的区域对于CTGF与TGFβ的结合是充分必要的，并且本发明的抗体能阻断CTGF与TGFβ之间的相互作用。
CTGF与TGFβ之间的相互作用用下述程序测定。将96孔MAXISORP ELISA板(Nalge Nunc)的孔用10μg/ml的CTGF、由外显子3编码的CTGF片段或由外显子5编码的CTGF片段(均在PBS中)或者用PBS在4℃包被过夜。所有的孔然后用在PBS中的1％BSA封闭，随后在50μl溶液中于室温温育1小时，所述溶液含有浓度为0、1、3.3、10、33、100、333或1000ng/ml的TGFβ和在PBS，0.05％Tween-20中的100、300或1000ng/ml的MAB612或MAB1835小鼠抗TGFβ单克隆抗体(R & D Systems，Minneapolis MN)。MAB1835识别牛、小鼠和人TGF-β1和TGF-β2并且阻断TGFβ与小鼠胸腺细胞结合。MAB612识别TGF-β2但不抑制TGFβ活性。孔用PBS，0.05％Tween-20漂洗，然后在一种溶液中于室温温育1小时，所述溶液含有在PBS，0.05％Tween-20中稀释的碱性磷酸酶缀合的山羊抗小鼠IgG抗体。再次洗板，加入在1M乙醇胺、1mM MgSO4，pH9.8中的对硝基苯磷酸(PNPP)，将孔温育一段合适时间以显色，然后加入NaOH终止反应。在λ405nm处的吸光度用分光光度计测量。
图12显示CTGF和由外显子3编码的CTGF片段与TGFβ相互作用的程度相等，而由外显子5编码的CTGF片段不显示任何与TGFβ的结合活性。令人感兴趣地，抗TGFβ抗体MAB612能以剂量依赖方式检测CTGF结合的TGFβ，但是中和抗体MAB1835在所测试的任何浓度均不能检测CTGF结合的TGFβ(数据未示出)。这提示CTGF与MAB1835竞争结合TGFβ。
测试了抗CTGF抗体阻断CTGF与TGFβ之间的结合的能力。如图12所示，由mAb4和mAb1所示例的本发明的抗体阻断了CTGF和由外显子3编码的CTGF片段对TGFβ的结合，而针对CTGF的C末端的抗CTGF抗体不阻断结合。这些结果支持了本发明抗体特异阻断CTGF和TGFβ之间的相互作用以及CTGF与TGFβ超家族的其它成员之间潜在的相互作用的作用机制。
除了上述显示和描述的以外，本发明的各种变化对于本领域技术人员而言可以从上述描述中显而易见。这种修饰包括在所附权利要求书范围之内。
本文所引用的所有参考文献均全文引入本文作参考。
序列表
<110>菲布罗根公司
<120>结缔组织生长因子抗体
<130>FP0814 PCT
<150>US 60/475,598
<151>2003-06-04
<160>26
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2075
<212>DNA
<213>Homo sapiens
<400>1
cccggccgac agccccgaga cgacagcccg gcgcgtcccg gtccccacct ccgaccaccg 60
ccagcgctcc aggccccgcg ctccccgctc gccgccaccg cgccctccgc tccgcccgca 120
gtgccaacca tgaccgccgc cagtatgggc cccgtccgcg tcgccttcgt ggtcctcctc 180
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gagccggcgc cgcgctgccc ggcgggcgtg agcctcgtgc tggacggctg cggctgctgc 300
cgcgtctgcg ccaagcagct gggcgagctg tgcaccgagc gcgacccctg cgacccgcac 360
aagggcctct tctgtgactt cggctccccg gccaaccgca agatcggcgt gtgcaccgcc 420
aaagatggtg ctccctgcat cttcggtggt acggtgtacc gcagcggaga gtccttccag 480
agcagctgca agtaccagtg cacgtgcctg gacggggcgg tgggctgcat gcccctgtgc 540
agcatggacg ttcgtctgcc cagccctgac tgccccttcc cgaggagggt caagctgccc 600
gggaaatgct gcgaggagtg ggtgtgtgac gagcccaagg accaaaccgt ggttgggcct 660
gccctcgcgg cttaccgact ggaagacacg tttggcccag acccaactat gattagagcc 720
aactgcctgg tccagaccac agagtggagc gcctgttcca agacctgtgg gatgggcatc 780
tccacccggg ttaccaatga caacgcctcc tgcaggctag agaagcagag ccgcctgtgc 840
atggtcaggc cttgcgaagc tgacctggaa gagaacatta agaagggcaa aaagtgcatc 900
cgtactccca aaatctccaa gcctatcaag tttgagcttt ctggctgcac cagcatgaag 960
acataccgag ctaaattctg tggagtatgt accgacggcc gatgctgcac cccccacaga1020
accaccaccc tgccggtgga gttcaagtgc cctgacggcg aggtcatgaa gaagaacatg1080
atgttcatca agacctgtgc ctgccattac aactgtcccg gagacaatga catctttgaa1140
tcgctgtact acaggaagat gtacggagac atggcatgaa gccagagagt gagagacatt1200
aactcattag actggaactt gaactgattc acatctcatt tttccgtaaa aatgatttca1260
gtagcacaag ttatttaaat ctgtttttct aactggggga aaagattccc acccaattca1320
aaacattgtg ccatgtcaaa caaatagtct atcttcccca gacactggtt tgaagaatgt1380
taagacttga cagtggaact acattagtac acagcaccag aatgtatatt aaggtgtggc1440
tttaggagca gtgggagggt accggcccgg ttagtatcat cagatc9act cttatacgag1500
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gcctgtagcc ccagtgacag ctaggatgtg cattctccag ccatcaagag actgagtcaa1620
gttgttcctt aagtcagaac agcagactca gctctgacat tctgattcga atgacactgt1680
tcaggaatcg gaatcctgtc gattagactg gacagcttgt ggcaagtgaa tttgcctgta1740
acaagccaga ttttttaaaa tttatattgt aaatattgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtata1800
tatatatata tatgtacagt tatctaagtt aatttaaagt tgtttgtgcc tttttatttt1860
tgtttttaat gctttgatat ttcaat9tta gcctcaattt ctgaacacca taggtagaat1920
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ggctgatttc taggtaggaa atgtggtagc tcacg 2075
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<211>349
<212>PRT
<213>Homo sapiens
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Met Thr Ala Ala Ser Met Gly Pro Val Arg Val Ala Phe Val Val Leu
1 5 10 15
Leu Ala Leu Cys Ser Arg Pro Ala Val Gly Gln Asn Cys Ser Gly Pro
20 25 30
Cys Arg Cys Pro Asp Glu Pro Ala Pro Arg Cys Pro Ala Gly Val Ser
35 40 45
Leu Val Leu Asp Gly Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Lys Gln Leu
50 55 60
Gly Glu Leu Cys Thr Glu Arg Asp Pro Cys Asp Pro His Lys Gly Leu
65 70 75 80
Phe Cys Asp Phe Gly Ser Pro Ala Asn Arg Lys Ile Gly Val Cys Thr
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Ala Pro Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser
100 105 110
Gly Glu Ser Phe Gln Ser Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp
115 120 125
Gly Ala Val Gly Cys Met Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro
130 135 140
Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys
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Cys Glu Glu Trp Val Cys Asp Glu Pro Lys Asp Gln Thr Val Val Gly
165 170 175
Pro Ala Leu Ala Ala Tyr Arg Leu Glu Asp Thr Phe Gly Pro Asp Pro
180 185 190
Thr Met Ile Arg Ala Asn Cys Leu Val Gln Thr Thr Glu Trp Ser Ala
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Cys Ser Lys Thr Cys Gly Met Gly Ile Ser Thr Arg Val Thr Asn Asp
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Asn Ala Ser Cys Arg Leu Glu Lys Gln Ser Arg Leu Cys Met Val Arg
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Pro Cys Glu Ala Asp Leu Glu Glu Asn Ile Lys Lys Gly Lys Lys Cys
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Ile Arg Thr Pro Lys Ile Ser Lys Pro Ile Lys Phe Glu Leu Ser Gly
260 265 270
Cys Thr Ser Met Lys Thr Tyr Arg Ala Lys Phe Cys Gly Val Cys Thr
275 280 285
Asp Gly Arg Cys Cys Thr Pro His Arg Thr Thr Thr Leu Pro Val Glu
290 295 300
Phe Lys Cys Pro Asp Gly Glu Val Met Lys Lys Asn Met Met Phe Ile
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Lys Thr Cys Ala Cys His Tyr A5n Cys Pro Gly Asp Asn Asp Ile Phe
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Glu Ser Leu Tyr Tyr Arg Lys Met Tyr Gly Asp Met Ala
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<212>DNA
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Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
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Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
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Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
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gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 540
atcacttgtc gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 600
gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 660
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 720
gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accctcccac ttttggccag 780
gggaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 840
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 900
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 960
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg1020
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atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg aaaaaaatgc1260
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caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga ggtgtgggag1380
gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg ctgattatga tca 1433
<210>20
<211>236
<212>PRT
<213>Homo sapiens
<400>20
Met Asp Met Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys
1 5 10 15
Phe Pro Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Ser Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Tyr Asn Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
130 135 140
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
165 170 175
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
180 185 190
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
195 200 205
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
210 215 220
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210>21
<211>62
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>synthetic peptide
<400>21
Cys Ile Phe Gly Gly Thr Val Tyr Arg Ser Gly Glu Ser Phe Gln Ser
1 5 10 15
Ser Cys Lys Tyr Gln Cys Thr Cys Leu Asp Gly Ala Val Gly Cys Met
20 25 30
Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe
35 40 45
Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro Gly Lys Cys Cys Glu Glu Trp
50 55 60
<210>22
<211>23
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>synthetic peptide
<400>22
Pro Leu Cys Ser Met Asp Val Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe
1 5 10 15
Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro
20
<210>23
<211>18
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>synthetic peptide
<400>23
Arg Leu Pro Ser Pro Asp Ser Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu Pro
1 5 10 15
Gly Lys
<210>24
<211>15
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>synthetic peptide
<400>24
Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu
1 5 10 15
<210>25
<211>13
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>synthetic peptide
<400>25
Arg Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val
1 5 10
<210>26
<211>14
<212>PRT
<213>artificial
<220>
<223>synthetic peptide
<400>26
Leu Pro Ser Pro Asp Cys Pro Phe Pro Arg Arg Val Lys Leu
1 5 10
PCT/RO/134表
关于微生物保藏的说明
(PCT细则13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月；2004年1月重印)
权利要求
1.一种分离的抗体或其生物学活性部分，所述抗体或其生物学活性部分特异性地结合人CTGF多肽的一部分，所述部分至少包含SEQ ID NO2的氨基酸97-180所示的人CTGF上一个区域的一部分，或所述抗体或其生物学活性部分特异性地结合衍生自另一物种的CTGF上的直向同源区域，并且所述抗体或其生物学活性部分能中和CTGF的生物学活性。
2.权利要求1的抗体，其中所述CTGF多肽的N-末端部分的区域是SEQ ID NO2的氨基酸103-164，或者衍生自另一物种的CTGF上的直向同源区域。
3.权利要求1的抗体，其中所述CTGF多肽的N-末端部分的区域是SEQ ID NO2的氨基酸134-158，或者衍生自另一物种的CTGF上的直向同源区域。
4.权利要求1的抗体，其中所述CTGF多肽的N-末端部分的区域是SEQ ID NO2的氨基酸143-154，或者衍生自另一物种的CTGF上的直向同源区域。
5.前述任一项权利要求的抗体，其中所述生物学活性包括由细胞产生胞外基质。
6.权利要求5的抗体，其中胞外基质是体内产生的。
7.权利要求5的抗体，其中胞外基质是回体(ex vivo)产生的。
8.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体调节CTGF多肽和分泌的辅因子或膜辅因子之间的相互作用，由此中和所述生物学活性。
9.权利要求8的抗体，其中所述辅因子是TGF-β家族成员。
10.权利要求9的抗体，其中所述辅因子是TGFβ-1。
11.权利要求9的抗体，其中所述辅因子是BMP-4。
12.前述任一项权利要求的抗体，其中所述生物学活性是细胞迁移。
13.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体降低对象中的纤维化。
14.权利要求13的抗体，其中所述纤维化发生在选自由上皮组织、内皮组织和结缔组织组成的一组的组织内。
15.权利要求13的抗体，其中所述纤维化发生在选自由肾、肺、肝、心脏和皮肤组成的一组的器官内。
16.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体对CTGF的亲和性大约为10-9M。
17.前述任一项权利要求的抗体，其是单链抗体。
18.前述任一项权利要求的抗体，其是人源化的抗体。
19.前述任一项权利要求的抗体，其是嵌合抗体。
20.前述任一项权利要求的抗体，其是多价抗体。
21.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是糖基化的。
22.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是非糖基化的。
23.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体与一种胞毒剂或酶缀合。
24.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体被可检测地标记。
25.权利要求24的抗体，其中可检测的标记是酶、荧光部分、化学发光部分、生物素、亲和素或放射性同位素。
26.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
27.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体具有与由ATCC保藏号＿＿的细胞系(保藏日2004年5月19日)产生的抗体相同的特异性。
28.前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体由ATCC保藏号＿＿的细胞系(保藏日2004年5月19日)产生。
29.前述任一项权利要求的抗体，其中所述生物学活性片段是Fab、F(ab)2或Fv片段。
30.ATCC保藏号＿＿的细胞系(保藏日2004年5月19日)。
31.一种分离的抗体，其包含选自如下一组的多肽
(a)具有SEQ ID NO14的氨基酸序列的免疫球蛋白；
(b)具有SEQ ID NO20的氨基酸序列的免疫球蛋白；
(c)包含(a)或(b)的可变区的免疫球蛋白片段；和
(d)(a)，(b)或(c)的保守变体。
32.权利要求31的抗体，其中所述可变区包括SEQ ID NO14的氨基酸1-167所示的免疫球蛋白重链可变区。
33.权利要求31的抗体，其中所述可变区包括SEQ ID NO20的氨基酸1-136所示的免疫球蛋白轻链可变区。
34.权利要求31的抗体，其中所述抗体能中和CTGF多肽的生物学活性。
35.权利要求34的抗体，其中所述生物学活性包括由细胞产生胞外基质。
36.权利要求34的抗体，其中所述生物学活性包括刺激细胞迁移。
37.权利要求35的抗体，其中胞外基质是体内产生的。
38.权利要求35的抗体，其中胞外基质是回体(ex vivo)产生的。
39.权利要求34的抗体，其中所述抗体调节CTGF多肽和细胞受体之间的相互作用，由此中和所述生物学活性。
40.权利要求34的抗体，其中所述抗体调节CTGF多肽和一种分泌的辅因子或膜辅因子之间的相互作用，由此中和所述生物学活性。
41.权利要求40的抗体，其中所述辅因子是TGF-β家族成员。
42.权利要求41的抗体，其中所述辅因子是TGF-β。
43.权利要求41的抗体，其中所述辅因子是BMP-4。
44.权利要求31的抗体，其中所述抗体是糖基化的。
45.权利要求31的抗体，其中所述抗体是非糖基化的。
46.权利要求31的抗体，其中所述抗体与一种胞毒剂或酶缀合。
47.权利要求31的抗体，其中所述抗体被可检测地标记。
48.权利要求47的抗体，其中所述可检测的标记是一种酶、荧光部分、化学发光部分、生物素、亲和素或放射性同位素。
49.一种分离的抗体，其包含具有SEQ ID NO14所示的氨基酸序列的免疫球蛋白重链和具有SEQ ID NO20所示的氨基酸序列的免疫球蛋白轻链。
50.一种分离的抗体，其包含由ATCC保藏号＿＿(保藏日为2004年5月19日)的细胞系产生的抗体。
51.一种药物组合物，其包含与一种药物学可接受的载体混合的有效量的前述任一项权利要求的抗体。
52.权利要求51的药物组合物，进一步包含第二种治疗剂。
53.一种中和CTGF的生物学活性的方法，包括将权利要求1-50任一项的抗体与样品在适于形成包含所述抗体和CTGF多肽的复合物的条件下进行接触，由此中和所述CTGF多肽的生物学活性。
54.权利要求53的方法，其中所述生物学活性包括产生胞外基质。
55.权利要求53的方法，其中所述抗体调节CTGF多肽和细胞受体之间的相互作用。
56.权利要求53的方法，其中所述抗体调节CTGF多肽和分泌的辅因子或膜辅因子之间的相互作用。
57.权利要求56的方法，其中所述辅因子是TGF-β家族成员。
58.权利要求57的方法，其中所述辅因子是TGFβ-1。
59.权利要求57的方法，其中所述辅因子是BMP-4。
60.权利要求53的方法，其中所述中和是在体外。
61.权利要求53的方法，其中所述中和是在一对象的体内。
62.权利要求61的方法，其中所述对象倾向于患有或被诊断患有高血压、高血糖、糖尿病、心肌梗死、关节炎和局部或全身性炎症。
63.权利要求61的方法，其中所述对象倾向于患有或被诊断患有细胞增殖性疾病。
64.权利要求63的方法，其中所述细胞增殖性疾病是血管发生、动脉粥样硬化、青光眼或癌症。
65.权利要求64的方法，其中所述癌症是急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、乳腺癌结缔组织生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症或肝癌。
66.权利要求61的方法，其中所述对象倾向于患有或被诊断患有纤维性疾病。
67.权利要求66的方法，其中所述纤维性疾病是自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭或肝硬化。
68.一种在患有CTGF相关性疾病或处于患有CTGF相关性疾病的风险的对象中治疗或预防所述疾病的方法，包括将权利要求1-50任一项的抗体给予所述对象。
69.权利要求68的方法，其中所述疾病是高血压、高血糖、糖尿病、心肌梗死、关节炎以及局部或全身性炎症。
70.权利要求68的方法，其中所述疾病是细胞增殖性疾病。
71.权利要求70的方法，其中所述细胞增殖性疾病是血管发生、动脉粥样硬化、青光眼或癌症。
72.权利要求71的方法，其中所述癌症包括急性淋巴母细胞性白血病、皮肤纤维瘤、乳腺癌、乳腺癌结缔组织生成、血管脂肪瘤、血管平滑肌瘤、结缔组织生成性癌症、前列腺癌、卵巢癌、结肠直肠癌、胰腺癌、胃肠道癌症或肝癌。
73.权利要求68的方法，其中所述对象倾向于患有或被诊断患有纤维性疾病。
74.权利要求73的方法，其中所述纤维性疾病是自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、糖尿病性视网膜病、骨关节炎、硬皮病、慢性心力衰竭或肝硬化。
75.权利要求1-50任一项的抗体，其中所述抗体或其部分由最初衍生自人类的遗传材料编码。
76.一种嵌合抗体，其包含衍生自权利要求1-50任一项的抗体的可变区的可变区和衍生自另一来源的恒定区。
77.权利要求76的嵌合抗体，其中所述恒定区衍生自人免疫球蛋白的恒定区。
78.一种用于治疗患有选自由自发性肺纤维化、糖尿病性肾病、慢性心力衰竭和肝硬化组成的一组的疾病的对象的药物，其包含权利要求1-50任一项的抗体。
79.一种用于治疗倾向于患有选自由高血压、糖尿病、心肌梗死、关节炎和局部或全身性炎症组成的一组的一种病症所致的疾病的对象的药物，其包含权利要求1-50任一项的抗体。
80.一种多核苷酸序列，其包含选自如下一组的序列
(a)编码SEQ ID NO14的多核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO14的氨基酸1-167的多核苷酸序列；
(c)SEQ ID NO13；
(d)SEQ ID NO13的核苷酸1-501。
81.一种重组多核苷酸，其包含与含有复制和转录控制序列的载体序列可操纵地连接的权利要求80的多核苷酸序列。
82.权利要求81的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQID NO14的氨基酸序列。
83.权利要求82的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO13。
84.一种用权利要求81的重组多核苷酸转染的宿主细胞。
85.一种多核苷酸序列，其包含选自如下一组的序列
(a)编码SEQ ID NO20的多核苷酸序列；
(b)编码SEQ ID NO20的氨基酸1-136的多核苷酸序列；
(c)SEQ ID NO19；和
(d)SEQ ID NO19的核苷酸1-408。
86.一种重组多核苷酸，其包含与一种含有复制和转录控制序列的载体序列可操纵地连接的权利要求85的多核苷酸序列。
87.权利要求86的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸编码SEQID NO20的氨基酸序列。
88.权利要求87的重组多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQID NO19。
89.用权利要求86的重组多核苷酸转染的宿主细胞。
90.一种宿主细胞，其包含用编码SEQ ID NO14的多核苷酸和编码SEQ ID NO20的多核苷酸共转染的细胞，所述宿主细胞产生具有与ATCC保藏号No.＿＿(保藏日2004年5月19日)的细胞系产生的抗体基本上相同的特征的功能性抗体。
全文摘要
本发明涉及与CTGF结合的抗体。所述抗体特别针对参与纤维化相关的生物学活性的CTGF区域。本发明还涉及使用这些抗体治疗与CTGF相关的疾病的方法，这些疾病包括局部和全身性纤维化疾病，包括肺、肝、心脏、皮肤和肾的纤维化疾病。
文档编号A61P27/06GK1829740SQ20048002214
公开日2006年9月6日 申请日期2004年6月2日 优先权日2003年6月4日
发明者林跃, 托马斯·B·内夫, 诺林·A·奥利弗, 威廉·R·乌辛格, 王庆建, 戴维·A·约厄尔 申请人:菲布罗根公司