结缔组织生长因子片段及其方法和用途的制作方法

专利名称：结缔组织生长因子片段及其方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及生长因子领域，并具体地涉及结缔组织生长因子(CTGF)片段及其使用方法。
背景技术：
生长因子生长因子可以广义地定义为多功能的、局部作用的细胞内信号传导多肽，它们控制个体发育以及维持组织形态和功能。许多原致癌基因(Proto-oncogenes)的蛋白质产物已被鉴定为生长因子和生长因子受体。
在正在发育的组织中，生长因子一般刺激靶细胞的增殖、分化以及器官化。生长因子的作用依赖于它们与特异性受体的结合，该结合刺激细胞内的信号传导事件。生长因子包括，例如，血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、转化生长因子β(TGF-β)、转化生长因子α(TGF-α)、表皮生长因子(EGF)以及结缔组织生长因子(CTGF)。据报道，这些生长因子中的每一种均刺激细胞增殖。
结缔组织生长因子CTGF是一种富半胱氨酸的单体肽，分子量约38kd。如以前所报道的那样，CTGF对结缔组织具有促分裂活性和趋化活性。CTGF由细胞分泌，据信它在与特定的细胞受体相互作用中具有活性。
CTGF是生长调节子家族中的一员，包括，例如，小鼠(fisp-12)和人的CTGF、Cyr-61(小鼠)、Cef10(鸡)和Nov(鸡)。基于序列比较，已提出该家族的成员具有一般包括至少以下之一的组件结构(1)胰岛素样生长因子结构域，负责结合；(2)von Willebrand因子结构域，负责形成复合物；(3)血小板反应素1型重复，可能负责结合基质分子；和(4)在基质蛋白质中发现的C-末端组件，推测负责结合受体。
人CTGF的cDNA序列含有一个1047个核苷酸的开放阅读框架，起始位点在大约130核苷酸处，TGA终止位点在大约1177核苷酸处，编码349个氨基酸的肽。人CTGF的cDNA序列已在美国专利5,408,040中公开。
CTGF的开放阅读框架编码一个含39个半胱氨酸残基的多肽，提示是一个有多个分子内二硫键的蛋白质。肽的氨基末端含有一个预示分泌型蛋白质的疏水信号序列，并且在氨基酸序列中的28位和225位天冬酰胺残基上有两个N-连接的糖基化位点。
据信，CTGF的合成及分泌由TGF-β和BMP-2，以及潜在地由TGF-β蛋白质超家族的其它成员选择性地诱导。正如本领域所报道，尽管TGF-β在软琼脂中能够刺激正常的成纤维细胞的生长，但是单独的CTGF并不能在成纤维细胞中诱导该特性。然而，已经证明CTGF的合成和作用对TGF-β刺激抗基非依赖的成纤维细胞生长是必需的。(参见，例如，Kothapalli等人，细胞生长和分化(Cell growth & Differentiation)，8(1)61-68和Boes等人.内分泌学(Endocrinology)，140(4)1575-1580)。
在生物学活性方面，据报道CTGF的性质基本上是促分裂(能够刺激靶细胞增殖)。另据报道CTGF具有趋化活性。据报道，在病理学方面，全长的CTGF分子是结缔组织细胞过生长以及胞外基质过沉积的条件之一。在本领域中CTGF被描述为与涉及血管内皮细胞的迁移和增殖以及新血管生成的条件相关。涉及到这些条件的疾病和障碍包括，例如，皮肤和主要器官的纤维化、癌症，以及相关疾病和障碍诸如全身性硬皮病、血管生成、动脉粥样硬化、糖尿病型肾病和肾性高血压。(参见，例如，Toshifumi等人.1999，细胞生理学杂志(Journal of Cellular Physiology)，18191)153-159；Shimo等人.1999，生物化学杂志(Journal of Biochemistry)，126(1)137-145；Murphy等人.1999，生物化学杂志(Journal ofBiological Chemistry)，274(9)5830-5834；Wenger等人.1999，致癌基因(Oncogene)，18(4)1073-1080；Frzier等人.1997，国际生物化学和细胞生物学杂志(International Jornalof Biochemistry & Cellular Biology)，29(1)153-161；Oemar等人.1997，循环(Circulation)，95(4)831-839)。
另据报道，CTGF用于创伤愈合以及结缔组织、骨和软骨的修复。在这方面，在诸如骨质疏松症、骨性关节炎或骨软骨炎、关节炎、骨骼障碍、肥大性疤痕、烧伤、血管肥大或伤口愈合等障碍中，已将CTGF描述为骨、组织或软骨形成的诱导物。(参见，例如，美国专利5837258；Ohnishi等人.1998，分子和细胞心脏病学(Journal of Molecular andCellular Cardiology)，30(11)2411-2422；Nakanishi等人.1997，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)，234(1)206-210；Pawer等人.细胞生理学杂志(Journal of Cellular Physiology)，165(3)556-565)。
总之，CTGF与多种纤维化和癌性条件有关，并认为在伤口愈合中发挥作用。因而，在本领域中有必要鉴定调制CTGF活性的有用方法，以治疗这些多种疾病和障碍。在本发明之前，没有CTGF的区域或结构域负责信号传导不同的生物学活性这样的报道。而且，在本发明前，没有这样的公开内容，即通过抑制CTGF的特定区域或结构域的生物学活性来治疗与细胞增殖和/或过量产生细胞外基质有关的疾病或障碍。
发明概述本发明提供新的组合物和方法，用于治疗CTGF相关的疾病、障碍或失调，其中涉及到细胞外基质的沉积，包括，例如，胶原合成的诱导以及成肌成纤维细胞的分化。更具体地，本发明的组合物包括含有CTGF N-末端区域的CTGF片段。一方面，本发明的片段包含至少一部分外显子2或3，或者其编码多肽，它并非是在Brisgstock等人.1997，生物化学杂志(J.Biol.Chem.，)272(32)20275-82中公开的CTGF片段，另外它具有诱导细胞外基质的合成之能力，包括但不限于诱导胶原以及成肌纤维细胞分化之能力。在更进一步方面，本发明的片段包含大约四分之一至二分之一长度的全长CTGF蛋白质。
一方面，提供了具有如上所述之活性的结缔组织生长因子(CTGF)多肽的片段。本发明的片段包括图3所示的，具有由至少外显子2编码的氨基酸序列的CTGF。该片段也可以包括如图3所示的，由至少外显子3编码的氨基酸序列。本发明的CTGF片段还可以包括，如图3所示的，由至少外显子2和3编码的氨基酸序列。本发明还提供编码这类片段的多核苷酸序列。
本发明进一步包括用本发明所公开的CTGF片段鉴定能够调制所述CTGF片段活性的组合物的方法，其中这些组合物可用于控制细胞外基质正常沉积，诸如胶原沉积。更具体地讲，CTGF片段可用于鉴定这样的组合物，即它们可以控制胶原沉积的正常沉积以及成肌纤维细胞的分化，其中，这种组合物可用于抑制、压制或增加本发明的CTGF片段的活性。
要求保护的本发明组合物进一步包含CTGF调制子，例如，由上述方法鉴别的抗体、反义分子、小分子和其它化合物，它们可以调制本发明的CTGF片段的活性。一方面，本发明提供抑制或压制CTGF或者该CTGF片段的活性的CTGF调制子。本发明的另一方面，CTGF调制子提高了CTGF或者该CTGF片段的活性，例如，在需要诱导CTGF活性的适用症，例如，在伤口愈合、组织修复和骨修复。
在本发明的另一个方面，本发明的方法包括将有效量的CTGF片段调制子单独地或与一种或多种化合物组合，施用于需要治疗疾病、障碍或希望操纵胶原合成失调的患者中。本发明的方法特别旨在利用这样的化合物，即它们能够通过调制本发明的CTGF片段的活性调制胶原合成，结果是，治疗与胶原过多合成有关的障碍，包括纤维化障碍。优选地是，所述的障碍为真皮、主要器官性的，和与疤痕组织的过量产生有关的障碍。
本发明也提供包含本发明之CTGF片段的药物组合物。这类组合物可用于希望提高CTGF活性的伤口愈合、骨和组织修复。
附图简述

图1显示了成肌细胞诱导测定中的细胞。其中使用了CTGF结构域在NRK细胞中诱导α-平滑肌肌动蛋白。
图2为表示本发明的CTGF片段在NRK细胞中诱导胶原合成的曲线。
图3A和3B给出了全长CTGF分子的核酸序列(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQID NO2)，其中鉴定了CTGF分子的每一个外显子的位置。
图4给出包含CTGF分子外显子2和3的CTGF N-末端结构域之核酸序列(SEQ IDNO3)和氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
图5给出有关用抗-CTGF抗体抑制TGF-β刺激的胶原合成之数据。
图6显示了抗CTGF N-末端结构域的抗体对胶原合成的选择性抑制。
图7显示了CTGF和分离的结构域对胶原和DNA合成的刺激作用。
图8给出有关CTGF N-末端结构域作为胶原合成以及诱导成肌纤维细胞的活性诱导物之数据。上半图N-末端结构域；下半图C-末端结构域。
图9给出有关IGF-2对CTGF诱导的胶原的作用之数据。
发明详述应该理解，本发明不限制于本文中所描述的特定的方法、方案、细胞系、载体和试剂等，因为这些是可以改变的。也应该理解，本文中所用术语仅仅用于描述特定的实施方案之目的，并不旨在限制本发明的范围。必须指出的是，如在本文以及附加的权利要求书中所用，单数形式的“a(一，一个)”“an(一，一个)”和“the(此，该)”包括了复数范围，除非文中另外明确指明。因此，例如，提及“an antibody(一个抗体)”是指本领域技术人员公知的一个或多个抗体和其等同物，等等。
除非另外定义，本文中所用的所有技术和科学术语的含义与由本领域的普通技术人员(本发明就属于这些人)所通常理解的含义相同。对优选的方法、装置和材料进行了描述，尽管与本文中描述的那些材料和方法相似或等同的任何材料和方法能够用于实施或测试本发明。本文所引用的所有参考文献，本文全文引用作为参考。
定义如本文所用，术语“CTGF片段”指包含至少一部分CTGF N-末端区域的片段。在一个实施方案中，该片段包含全长CTGF蛋白质之至少一部分外显子2或3，并且进一步地具有诱导细胞外基质合成的能力。在另一个实施方案中，该片段的长度在全长CTGF蛋白质的大约四分之一至二分之一长度之间。“诱导胶原合成能力”含义为通过胶原合成以及肌成纤维细胞分化，诱导细胞外基质的形成能力。CTGF片段可以通过从天然来源中分离、合成制造生产、重组遗传工程技术或者本领域之其它可用技术获得。
如本文所用，术语“N-末端”指包含至少部分外显子2和3结构域、大约始于全长CTGF分子起始处的核酸序列以及所编码的氨基酸序列，正如在图3A和3B中所鉴定。术语“外显子2”指其核酸序列和相应的N-末端结构域之氨基酸序列，大约始于全长CTGF分子的起始处及相应的氨基酸序列。术语“外显子3”，指全长CTGF分子的N-末端结构域之核酸序列和所编码多肽。
如本文所用，术语“C-末端”指包含全长CTGF分子之至少一部分外显子4和5结构域的核酸序列以及其所编码的多肽，正如在图3A和3B中所鉴定。
如本文所用，术语“障碍”和“疾病”，指与CTGF的表达或者活性相关的状态。疾病、障碍以及与CTGF相关的状态包括但不限于从急性或反复创伤产生的过度结疤，包括外科手术或放射治疗、诸如肾脏、肺脏、肝脏、眼、心脏以及皮肤等器官的纤维化，包括硬皮病、疤痕疙瘩以及肥大性结疤。已将CTGF的异常表达与一般的组织结疤、皮肤中的肿瘤样生长以及持续性的血管结疤联系起来，导致血液运输能力的损害、高血压、肥大等等。与CTGF相关的还有由血管内皮细胞增殖或迁移，诸如癌症、包括皮肤纤维瘤、与内皮细胞异常表达相关的状态、乳腺癌性结缔组织生成、血管脂肪瘤和血管平滑肌瘤引起的多种疾病。其它相关的状态包括动脉粥样硬化，包括动脉粥样化斑块和全身性硬皮病、炎性肠疾病、慢性结肠炎、血管生成以及在动脉粥样硬化中起关键作用的其它增殖性过程、关节炎、癌症以及其它疾病状态、青光眼中的新血管生成、由于疾病或损伤导致的包括关节炎症的炎症、肿瘤生长转移、间质性疾病、皮肤性疾病、关节炎，包括慢性类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、糖尿病，包括糖尿病型肾病、高血压和其它肾脏障碍，以及由化学治疗、放射治疗、透析和同种移植及移植排斥引起的纤维化。
如本文所用，“纤维增殖性”障碍包括但不限于任一上面列出的疾病或障碍，例如，肾脏纤维化、硬皮病、肺脏纤维化、关节炎、肥大性结疤和动脉粥样硬化。与CTGF相关的纤维增殖性障碍还包括糖尿病型肾病和视网膜病、高血压和其它肾脏障碍、与血管生成相关的障碍，包括但不限于与肿瘤形成相关的血管以及在动脉粥样硬化、关节炎和其它疾病状态中起关键作用的其它增殖过程以及，例如，在皮肤、心脏、肺脏和肾脏中的纤维化。总的来讲，本文包括涉及肾脏、肝脏、肺脏以及心血管系统的严重纤维化。纤维化的例子非常多，包括心脏发作后的疤痕组织形成，它损害了心脏的泵能力。糖尿病常常引起肾脏损害/结疤，导致肾功能渐进性丧失。甚至在外科手术后，也能够在内部器官之间形成疤痕组织，引起挛缩、疼痛和在某些情况下的不育症。主要器官，诸如心脏、肾脏、肝脏、肺脏、眼以及皮肤易于产生慢性结疤，并常常与其它疾病相联系。肥大疤痕(非恶性组织大块)是纤维化的一种常见形式，由烧伤和其它创伤引起。另外，还有许多其它纤维增殖性障碍，诸如硬皮病、疤痕疙瘩和动脉粥样硬化，它们分别与一般性的组织结疤、皮肤中的肿瘤样生长或损害血液运输能力的持续的血管结疤相关。由于CTGF在纤维化障碍中过表达，所以它代表用于开发抗-纤维化治疗剂的一个非常特异的靶子。通过使用小分子和中和抗体能够抑制CTGF，例如，在治疗纤维增殖性障碍中就是如此。应当理解，“纤维增殖性”指任一上述病理例证，而不应当将其限制于细胞增殖。
“细胞外基质(ECM)”是由多种类型细胞，包括，例如，内皮、上皮、表皮和肌肉细胞合成并包围该多种类型细胞的多组分结构。ECM主要由胶原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖形成。EMC还含有h1纤维结合素、玻璃体结合蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖和更小的蛋白质。生长因子通过与硫酸乙酰肝素蛋白多糖的葡糖胺聚糖部分结合而被隔绝于这些基质中。已知高艾杜糖醛酸和高硫酸化的“肝素样”区域与来自人成纤维细胞的bFGF之硫酸乙酰肝素结合区相关(Turubull等人.J.Biol.Chem.，267(15)10337-10341，1992)。然而，还不完全了解位于细胞外基质的硫酸乙酰肝素的组成特性。
如本文所用，术语“核酸”或“核酸序列”指寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸，或者指这些中的任一之片段，指基因组或合成来源的DNA或RNA，它可为单链或双链，并可代表正义或反义链，指肽核酸(PNA)，或者指来源于天然或合成的任何DNA样或RNA样物质。
如本文所用，“氨基酸”或“氨基酸序列”指寡肽、肽、多肽或蛋白质序列，或者指这些中的任一之片段、部分或亚基，并且指天然存在的或合成的分子。
“杂交”指一种过程，由该过程核酸链与互补链通过碱基配对连接起来。能够使杂交反应既灵敏又具有选择性，这样，甚至能够将特定的目的序列从含低浓度该目的序列的样品中鉴定出来。通过，例如，预杂交和杂交液中盐或者甲酰胺的浓度，或者通过杂交温度，可以确定适宜的严谨条件，这已为本领域所公知。尤其是，通过减低盐浓度、提高甲酰胺浓度或者提高杂交温度，能够提高严谨性。
例如，在含大约50％甲酰胺及大约37℃-42℃中能够发生高严谨条件下的杂交。在含大约35％-25％甲酰胺及大约30℃-35℃中能够发生严谨性减低状态下的杂交。尤其是，在42℃以及含50％甲酰胺、5×SSPE、0.3％SDS和200μg/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA中能够发生高严谨状态下的杂交。严谨性减低状态下的杂交能够按如上所述发生，但是要在含35％甲酰胺及降低的温度35℃条件下进行。通过计算目的核酸之嘌呤对嘧啶比率并相应地调整温度，能够进一步地缩窄与特定水平的严谨性相对应的温度范围。在上述范围和条件内的改变为本领域所公知。
术语“实质的氨基酸同源性”指与特定序列有大约75％或者更多，优选地85％或者更多，更优选地90-95％或者更多的序列相似性的分子。术语“％相似性”或“％相同”指在比较两个或更多个氨基酸或核酸序列中所发现的序列相似或相同的百分比。由本领域公知的方法能够确定百分比相似性。
氨基酸序列间的百分比相似性能够通过使用，例如，聚簇方法计算出(参见，例如，Higgins，D.G.和P.M.Sharp，1988，基因(Gene)，73237-244)。通过测定所有配对间的距离，聚簇算法将序列分成簇。簇配对排列，接着分成若干类。例如，A序列和B序列的两个氨基酸序列间的百分比相似性，能够这样计算出将序列A的长度分成序列A和序列B间残基配对的总数，减去序列A中的间隙残基的数目，减去序列B中的间隙残基的数目乘以100。在确定百分比相似性时，并不将两个氨基酸序列间低的或没有同源性的间隙包括在内。由本领域公知的其它方法，例如，通过变化杂交条件能够计算出百分比相似性，并且使用程序诸如，MEGALIGN程序等能够由电脑计算出百分比相似性(DNASTAR Inc.，Madison，Wisconsin.)。
术语“胶原亚基”指由单一基因及该序列之任何衍生物，包括缺失衍生物、保守性替换，等等编码之胶原蛋白的一条多肽链的氨基酸序列。
“融合蛋白质”是来自不同蛋白质的肽序列共价连接在一起而构成的蛋白质。
“反义序列”为能够与靶序列特异杂交的任何序列。反义序列可以是DNA、RNA或者任何核酸模拟物或类似物。术语“反义技术”指依赖于反义序列与靶序列特异杂交的任何技术。
如本文所用，术语“功能性等同物”指具有CTGF片段的功能特性或结构特性的蛋白质或核酸分子。CTGF片段的功能性等同物可以含有修饰，根据这种修饰(用于执行特定的功能)的需要而定。术语“功能性等同物”旨在包括分子的片段、突变体、杂合体、变异体、类似物或者化学衍生物。
在正常情况下不是该分子的一部分，而当一个分子含有另加的化学组分时，就将该分子说成是另一个分子的“化学衍生物”。这种组分能够改善分子的可溶性、吸附性、生物学半寿期等等。该组分能够选择性地降低其分子的毒性、删除或者减弱其分子之任何不希望的副作用等等。能够介导这种效应的组分公开在，例如，Gennaro，A.R.编辑，1990，Remington’s药物科学，第18版，Mack出版公司，Easton PA中。将这种组分偶联到分子的方法为本领域公知。
如本文所用，“变异体”指这样的氨基酸序列，其中的一个或多个氨基酸已被改变。变异体可以有保守性的变化，其中的替代氨基酸具有相似的结构或化学特性，例如，用异亮氨酸取代亮氨酸。更稀少地，变异体可以有非保守性的变化，例如，用色氨酸取代甘氨酸。类似的次要变异也可以包括氨基酸的缺失和/或插入。使用本领域公知的电脑程序，例如，DNASTAR软件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)，可发现确定哪些氨基酸残基可被替代、插入或缺失的指南。
制造CTGF片段的方法编码CTGF的核酸序列，依据本发明，编码CTGF或其功能性等同物的核酸序列，正如在美国专利5408040中所描述，可用于产生这样的重组DNA分子，它指导全长蛋白质或其功能性等同物的表达，或者替代性地，它指导编码所需CTGF片段之核酸序列的表达，例如，在合适的宿主细胞中，包含CTGF之至少一部分外显子2或3的片段。
或者，在严谨条件下与部分CTGF序列杂交的核酸序列也可用于核酸杂交测定、Southern和Northern印迹分析等等。在另一个方法中，由包含抗体筛选表达文库以检测所具有的结构特征的杂交方法可以分离出编码CTGF的DNA分子。
由于遗传密码所固有的简并性，可以将其它编码具有实质氨基酸同源性的蛋白质或功能性等同物的氨基酸序列的DNA序列分离出，并在实施本发明中用于克隆和表达CTGF或CTGF片段。运样的DNA序列包括那些在严谨条件下能够与人CTGF序列杂交的DNA序列。
根据本发明可以使用的改变的DNA序列包括不同核苷酸残基的缺失、添加或替代，导致编码相同或功能性等同物基因产物的序列。基因产物本身可以含有CTGF序列内的氨基酸残基之缺失、加入或替代，其导致沉默性改变从而产生功能性上相等的蛋白质。基于所涉及残基在极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性质上的相似性，可以制造这样的氨基酸替代。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；极性头部基团不带电荷并具有相似亲水值的氨基酸包括如下亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
为改变蛋白质序列用于多种目的，可以对本发明的DNA序列进行工程设计，包括但不限于对基因产物的加工和表达进行修饰的改变。例如，使用本领域公知的技术可以将突变引入例如，定点诱变技术可用于，例如，插入新的限制性位点。例如，在某些表达系统，诸如酵母，宿主细胞可以过糖基化基因产物。当使用这样的表达系统时，可以优选改变CTGF或CTGF片段的编码序列以删除任何N-连接糖基化位点。
可以将CTGF或CTGF片段的序列连接到异源序列以编码融合蛋白质。对于筛选肽文库可以采用例如，构建编码表达可由商业提供的抗体识别的异源表位的嵌合CTGF蛋白质。也可以对融合蛋白质进行工程设计，使得在CTGF或CTGF片段序列和异源蛋白质序列，例如，编码与PDGF相关的生长因子的序列之间含有切割位点，这样，可以将CTGF或CTGF片段从异源部分切除。这样的方法为本领域公知。
使用本领域公知的化学方法，也可以全部或部分合成CTGF或CTGF片段的编码序列。(参见，例如，Caruther等人.1980，Nucleic Acids Res.Symp.Ser.7215-233；Crea和Horn.1980，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，9(10)2331；Matteucci和Caruther.1980，TetrahedronLetters，21719；和Chow和Kempe.1981，核酸研究，9(12)2807-2817)。或者，使用化学方法全部或部分合成CTGF氨基酸序列，能够产生该蛋白质本身。例如，由固相技术能够合成肽，将其从树脂上切割出来，由制备性高效液相色谱进行纯化。参见，例如，Creighton，1983，蛋白质结构和分子原理(Proteins Structure and Molecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y，第50-60页。合成肽的组成可以由氨基酸分析或测序证实。例如，关于Edman降解法，参见Creighton，1983，蛋白质，结构和分子原理(Proteins，Structure andMolecular Principles)，W.H.Freeman and Co.，N.Y.，第34-49页。
CTGF或CTGF片段的表达 为了表达有生物学活性的CTGF片段和表达编码该全长蛋白质的核苷酸序列或如上所述的功能性等同物，将CTGF片段插入到合适的表达载体，即其中含有转录和翻译插入的编码序列所必需的元件的载体。
更具体地讲，为本领域技术人员所公知的方法能够用于构建含有CTGF或CTGF片段的序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内重组/遗传重组。参见，例如，在Maniatis等人，1989，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y和Ausubel等人，1989，分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology).GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.中描述的技术。
有多种宿主-表达载体系统可用于表达CTGF或CTGF片段的编码序列。这些包括但不限于微生物体诸如，用含有CTGF或CTGF片段编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有CTGF或CTGF片段编码序列的重组酵母表达载体转化的，包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等酵母和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)；用含有CTGF或CTGF片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有CTGF或CTGF片段编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或者用含有CTGF或CTGF片段编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者用重组病毒表达载体(例如，腺病毒、痘病毒、人肿瘤细胞(包括HT-1080))感染的动物细胞系统，包括工程设计的含有多拷贝CTGF DNA(在双微染色体中稳定地扩增(CHO/dhfr)或者不稳定地扩增(例如，鼠细胞系))的动物细胞系统。应该明白，正如本文所用，术语“宿主-表达载体系统”和更普遍地，术语“宿主细胞”包括宿主细胞或宿主-表达载体系统的任何后代。更应该明白，尽管不是所有的后代与亲代细胞可能完全一样(这是由于在复制期间可能发生突变)，但这样的后代将包括在本发明的范围内。
这些系统的表达元件在其强度和特异性方面有所变化。根据所采用的宿主/载体系统，可将多种合适的，包括组成型和诱导型启动子的转录和翻译元件中的任何一种用于表达载体。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子，诸如，噬菌体λ的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂合启动子)等等；当在昆虫细胞系统中克隆时，可以使用启动子诸如杆状病毒多角体蛋白启动子；当在植物细胞系统中克隆时，可以使用衍生自植物细胞基因组的启动子(例如，热休克启动子；RUBISCO小亚基的启动子；叶绿素a/b结合蛋白质的启动子)或者衍生自植物病毒的启动子(例如，CaMV的35S RNA启动子；TMV衣壳蛋白质的启动子)；当在哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用衍生自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或者衍生自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘病毒7.5K启动子)；当构建含有多拷贝CTGF或CTGF片段DNA的细胞系时，可以使用带有合适的选择性标记的基于SV40、BPV和EBV的载体。
在细菌系统中，依据旨在用于表达CTGF或CTGF片段，可以有利地选择多种表达载体。例如，用于在细菌中表达的合适载体包括基于T7的载体(正如在Rosenberg等人，1987，基因(Gene)，56125中所描述)。作为进一步的例子，当希望产生大量的CTGF或CTGF片段以筛选肽文库时，可能需要这样的载体，它指导可被容易地纯化的蛋白质产物高水平表达。这样的载体包括但不限于大肠杆菌(E.coli)表达载体pUR278(Ruther等人，1983，EMBO J.，21791)，其中CTGF或CTGF片段的编码序列可连接到载体中lacZ编码区的框架中，如此则产生AS-lacZ杂合蛋白质；pIN载体(Inouye和Inouye，1985，核酸研究，133101-3109；Van Heeke和Schuter，1989，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，2645503-5509)；等等。也可以使用pGEX载体表达诸如带有谷胱甘肽S-转移酶的CTGF或CTGF片段的外源多肽。一般情况下，这样的融合蛋白质是可溶的，并且通过吸附到谷胱甘肽-琼脂糖珠上，随后在有游离的谷胱甘肽存在下洗脱，可容易地将其从裂解细胞中纯化。在pGEX载体中设计有凝血酶或因子Xa蛋白酶的切割位点，这样能够将所克隆的目的多肽从GST部分释放出来。
一般当宿主为原核生物时，使用本领域公知的方法，收集对数生长之后的细胞并随后用CaCl2处理，或者替代性地用MgCl2或RbCl处理，可从这样的细胞制备出能够吸收DNA的感受态细胞。
当宿主为真核生物时，则可使用多种DNA转移方法。这些方法包括由磷酸钙沉淀转染DNA、常规的机械方法，包括显微注射、包裹于脂质体内的质粒的插入，或者使用病毒载体。真核细胞也可以用编码本发明之多肽的DNA序列以及第二种外源DNA分子，编码可选择表型，诸如单纯疱疹胸苷激酶基因共转化。另一个方法是用真核病毒载体，诸如猿猴病毒40(SV40)或者牛乳头瘤病毒，瞬时转染或转化真核细胞并表达蛋白质。参见，真核细胞表达载体(Eukaryotic Viral Vectors)，1992，Cold Spring Harbor Laboratory，Gluzman编辑。真核宿主细胞包括酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞和植物细胞。
在酵母中，可以使用含有组成型或诱导型启动子的多种载体。这方面的综述见，例如，分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，第2卷，1988，Ausubel等人编辑，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，第13章；Grant等人，1987，酶学方法(Methods in Enzymology)，Wu & Grossman编辑，Acad.Press，N.Y.，153516-544；Glover，1986，DNA克隆(DNA Cloning)，第II卷，IRL Press，Wash.D.C.，第3章；Bitter，1987，异源基因在酵母中的表达，酶学方法(Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods inEnzymology)，Berger和Kimmel编辑，Acad.Press，N.Y.，152673-684；和酿酒酵母的分子生物学(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)，1982，Strathern等人编辑，ColdSpring Harbor Press，第I和II卷。例如，已报道用于在酵母中表达外源基因的多种穿梭载体(Heinemann等人，1989，自然(Nature)，340205；Rose等人，1987，基因，60237)。
在使用植物表达载体的情况下，CTGF或CTGF片段编码序列的表达可以由许多启动子中的任一来驱动。例如，可以使用病毒启动子，诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson等人，1984，自然，310511-514)或者TMV的外壳蛋白质启动子(Takamatsu等人，1987，EMBO J.，6301-311)；或者，可以使用植物启动子诸如RUBISCO小亚基(Coruzzi等人，1984，EMBO J.，31671-1680；Broglie等人，1984，科学(Science)，224838-843)或者热休克启动子例如大豆hsp17.5-E和hsp17.3-B(Gurley等人，1986，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)，6559-565)。使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接的DNA转化、显微注射、电穿孔等等能够将这些构建体引入到植物细胞中。关于此类技术之综述，参见，例如，Weissbach和Weissbach，1988，植物分子生物学方法(Methodsfor Plant Molecular Biology)，Academic Press，NY，第VIII节，第421-463页；Grierson和Corey，1988，植物分子生物学(Plant Molecular Biology)，第2版，Blackie，London，第7-9章。
在昆虫系统，可以使用替代的表达系统用于表达CTGF或CTGF片段。在一个这样的系统中，将杆状病毒用作表达外源基因的载体。接着，该病毒在昆虫细胞中生长。可以将CTGF或CTGF片段的编码序列克隆到病毒的非必需区(例如多角体蛋白基因)并置于杆状病毒启动子的控制之下。接着，将这些重组病毒用于感染昆虫细胞，使插入基因在这些昆虫细胞中表达。参见，例如，Smith等人，1983，病毒学杂志(J.Virol.)，46584；Smith，美国专利4,215,051。
在哺乳动物宿主细胞中，可以使用许多基于病毒的表达系统。在使用腺病毒作为表达载体的情况下，可以将CTGF或CTGF片段的编码序列连接到腺病毒转录/翻译控制复合物，例如，后期启动子和三联引导序列。通过体外或体内重组，接着可以将此嵌合基因插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组非必需区(例如，区域E1或E3)中插入，将产生有活性并能够在被感染宿主中表达CTGF或CTGF片段的重组病毒。参见，例如，Logan和Shenk，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))，813655-3659。或者，可以使用牛痘7.5K启动子。参见，例如，Mackett等人，1982，美国国家科学院院刊，797415-7419；Mackett等人，1984，病毒学杂志，49857-864；Panicali等人，1982，美国国家科学院院刊，794927-4931。
在另一个实施方案中，将CTGF或CTGF片段序列在已用磷酸钙沉淀和新霉素抗性基因稳定地转染的人肿瘤细胞，诸如，HT-180中表达。而在另一个实施方案中，将pMSXND表达载体等等用于在多种哺乳动物细胞包括COS、BHK 293和CHO细胞中的表达(Lee和Nathans，1988，J.Biol.Chem.，2633521)。
为有效地翻译插入的CTGF或CTGF片段编码序列，还可能需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子和邻近序列。如果在将完整CTGF基因，包括它自己的起始密码子和邻近序列插入到合适的表达载体的情况下，则不需要任何另加的翻译控制信号。但是，如果在将仅仅一部分CTGF编码序列插入的情况下，必需提供外源性的翻译控制信号，包括ATG起始密码子。而且，起始密码子一定要与CTGF或CTGF片段的编码序列处在相同相位的阅读框架中，以确保插入的完整表达。这些外源性的翻译控制信号和起始密码子可有多种来源，既包括天然的又包括合成的。在包含有适宜的转录增强子元件、转录终止子等的条件下，表达效率可以得到提高。参见，例如，Bitter等人，1987，酶学方法，153516-544。可以加入添加序列，即引导序列等，指导CTGF或CTGF片段沿多种途径分泌。这可以在许多表达系统中，通过使用本领域公知的多种方法实现。
另外，可以选择这样的宿主细胞菌株，它们调制插入序列的表达或者以所希望的特定方式修饰和加工基因产物。对蛋白质产物如此修饰(例如，糖基化)和加工(例如，剪切)对蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有特有的和特定的蛋白质翻译后加工和修饰机制。可选择合适的细胞系或宿主系统，确保所表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为了这个目的，可以使用这样的真核宿主细胞，它们具有恰当地加工初始转录本、将基因产物糖基化和磷酸化的细胞器。这样的哺乳动物宿主细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、WI38、HT-1080等等。
为长期高水平地产生重组蛋白质，优选稳定的表达。例如，可以工程设计稳定地表达CTGF或CTGF片段的细胞系。可以使用由合适的表达控制元件(例如，启动子、增强子、序列、转录终止子、多腺苷酸化位点等等)和选择标记控制的CTGF或CTGF片段DNA，而不是使用含有病毒复制起始点的表达载体，转化宿主细胞。将外源DNA引入后，可以让工程化细胞在滋养培养基中生长1-2天，接着转换到选择培养基中。重组质粒中的选择标记赋予选择抗性并允许细胞将质粒稳定地整合到它们的染色体中，细胞生长形成病灶，它们又转过来能够被克隆和扩增为细胞系。
可以使用多种选择系统，包括但不限于分别可以在tk-、hgprt-和aprt-细胞中使用的单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，细胞，11223)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，美国国家科学院院刊，482026)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶的基因(Lowry等人，1980，细胞，22817)。
抗代谢物抗性也可用作选择基础，dhfr基因赋予甲氨蝶呤抗性(Wigler等人，1980，美国国家科学院院刊，773567；O’Hare等人，1981，美国国家科学院院刊，781527)；gpt基因赋予麦考酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，美国国家科学院院刊，782072)；neo基因赋予氨基糖苷G-418抗性(Colberre-Garapin等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，1501)和hygro基因赋予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，基因，30147)。最近，对更多的选择基因进行了描述，它们是trpB(它允许细胞利用吲哚代替色氨酸)、hisD(它允许细胞利用组氨醇代替组氨酸)(Hartman和Mulligan，1988，美国国家科学院院刊858047)和ODC(鸟氨酸脱羧酶，赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂(2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸，DFMO(McConlogue，1987，在Current Communications in Molecular Biology，Cold SpringHarbor Laboratory中)抗性)。
可用任何常规手段，诸如，例如，制备型色谱分离和免疫分离(诸如涉及使用单克隆和多克隆抗体的分离)分离和纯化宿主细胞表达的本发明之多肽。
表达CTGF或CTGF片段的转染子或转化子的鉴定 含有编码序列并表达有生物学活性的基因产物的宿主细胞可通过至少四种方法鉴定(a)DNA-DNA或DNA-RNA杂交；(b)“标记”基因的功能是否存在；(c)通过测量CTGF或CTGF片段的mRNA转录本在宿主细胞中的表达确定转录水平；和(d)通过分析基因产物或者测定其生物学活性检测基因产物。
在第一个方法中，使用包含与CTGF或CTGF片段编码序列分别同源的核苷酸序列或者其部分，或者其衍生物作为探针，通过DNA-DNA或DNA-RNA杂交能够检测插入到表达载体中的CTGF或CTGF片段编码的序列的存在。
在第二个方法中，基于某些“标记”基因的功能(例如，抗生素抗性、甲氨蝶呤抗性、转化表型、在杆状病毒中包涵体(occlusion body)的形成，等等)的存在与否能够鉴定和选择重组表达载体/宿主系统。例如，在优选的实施方案中，将CTGF编码序列插入到载体的新霉素抗性标记基因序列内，含有CTGF编码序列的重组子可以通过标记基因功能的不存在予以鉴定。或者，将标记基因与CTGF序列串联，共同受用于控制CTGF编码序列表达的相同或不同启动子的控制。响应诱导或选择而出现的标记表达提示CTGF编码序列的表达。
在第三个方法中，可通过杂交测定评价CTGF或CTGF片段编码区域的转录活性。例如，使用与CTGF或CTGF片段编码序列同源的序列或者与其特定部分同源的序列作探针，分离RNA并通过Northern印迹对其进行分析。或者，提取宿主细胞的总核酸，测定其与这些探针的杂交。
第四个方法涉及检测有生物学活性或免疫反应的CTGF或CTGF片段之基因产物。有许多测定法，包括但不限于在美国专利5408040中描述的那些测定法，能够用于检测CTGF活性。
切割全长CTGF蛋白质以产生CTGF片段 在表达出全长CTGF蛋白质后，可以通过本领域普通技术人员公知的许多蛋白水解酶切割该蛋白质，产生本发明之CTGF片段。例如，使用本领域中已知的方法，CTGF N-末端半分子和C-末端半分子之间的半胱氨酸游离桥对胰蛋白酶敏感。
调制和抑制CTGF片段活性的方法如上所述，本发明中描述的CTGF片段是在纤维化状态中细胞外基质沉积的关键决定簇。通过调节、调制和/或抑制该片段的活性和/或表达，或者如果希望，可提高该片段的活性，本发明提供预防和治疗与所述片段活性相关的并发症的方法。更具体地，本发明的方法提供用于施用治疗有效量的制剂，该制剂按照所希望的那样调节、调制和/或抑制CTGF之N-末端片段的产生细胞外基质活性，以治疗、预防或改善与CTGF的表达和活性相关的疾病或障碍。
抗体 在本发明的一个实施方案中，该方法涉及到施用治疗有效量的，特异性地与本发明的CTGF片段反应抗体。在美国专利5,783,187和PCT公开文件WO 9638172中对特异性地与CTGF反应的抗体进行了描述。使用本领域公知的方法可以产生CTGF抗体。这样的抗体可包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合、单链抗体，以及包括F(ab’)2和FV片段的Fab片段。通过例如Fab表达文库可产生片段。特别优选中和抗体，即抑制二聚体形成的那些抗体，用于治疗用途。
可以对靶多肽(诸如，CTGF或者调制CTGF活性或表达的制剂)进行评价，确定高免疫原性区。分析方法和表位选择方法为本领域公知。参见，例如，Ausubel等人编著，1988，分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)。通过例如多种软件包，诸如LASERGENE NAVIGATOR软件(DNASTAR；Madison，WI)，也能够完成分析和选择。用于诱导抗体的肽或片段应具有抗原性，但并不一定要具有生物学活性。优选地，抗原片段或肽的长度为至少5个氨基酸，更优选地，长度为至少10个氨基酸，最优选地，长度为至少15个氨基酸。优选地，抗体诱导片段或肽与至少一部分靶多肽(例如，CTGF)的氨基酸序列完全相同。也可以将模拟至少一部分天然存在的靶多肽序列的肽或片段与另一种蛋白质(例如，匙孔血蓝蛋白(KLH))融合，并且能够产生针对嵌合分子的抗体。
用于产生抗体的方法为本领域公知。例如，用靶多肽或任何致免疫片段或其肽注射，可以免疫多种宿主，包括山羊、兔、大鼠、小鼠、人类及其它。依据宿主的种类，可以使用多种佐剂以增强免疫应答。这样的佐剂包括但不限于弗氏佐剂、无机凝胶(诸如氢氧化铝)和表面活性物质，诸如溶血卵磷脂(lysolecithin)、多聚醇(pluronic polyols)、聚阴离子(polyanions)、肽、乳化油、KLH和二硝基苯酚。在用于人的佐剂当中，特别优选BCG(卡介苗)和小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。
使用任何由培养中的连续细胞系产生抗体分子技术都可以制备单克隆和多克隆抗体。用于体内和体外的产生技术为本领域所公知。参见，例如，Pound，J.D.，1998，免疫化学方法(Immunochemical Protocols)，Humana Press，Totowa，NJ；Harlow，E和D.Alane，1988，抗体实验室手册(Antibodies，A Laboratory Mannual)，Cold Spring Harbor Laboratory，New York。嵌合抗体的产生也是众所周知，单链抗体的产生也是如此。参见，例如，Morrison.S.L.等人，1984，美国国家科学院院刊，816851-6855；Neuberger，M.S.等人，1984，自然，312604-608；Taketa，S.等人，1985，自然，314452-454。具有相关特异性但独特个体遗传型组成的抗体可以由，例如，来自随机组合免疫球蛋白文库的链交换产生。参见，例如，Burton，D.R.，1991，美国国家科学院院刊，8811120-11123。
抗体也可以通过体内诱导在淋巴细胞群中产生或者用高特异性结合试剂通过筛选免疫球蛋白文库或系列而产生。参见，例如，Orlandi，R.等人，1989，美国国家科学院院刊，863833-3837；Winter，G.和C.Milstein，1991，自然，349293-299。也可以产生含有针对靶多肽的特异性结合位点的抗体片段。这样的抗体片段包括但不限于F(ab’)2片段(能够由胃蛋白酶消化抗体分子产生)和Fab片段(能够由还原F(ab’)2片段的二硫桥产生)。或者，可以构建Fab表达文库，以允许快速和容易地鉴定具有所希望特异性的单克隆Fab片段。参见，例如，Huse，W.D.等人，1989，科学，2541275-1281。
使用本领域公知的多种方法能够检测抗体抗靶多肽的活性。有多种可用于筛选(以鉴定具有所希望的特异性的抗体)的技术，包括多种免疫测定(诸如酶联免疫测定(ELISA)，包括直接和配体捕获ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫印迹和荧光激活的细胞分选(FACS)。许多用于竞争性结合或者免疫放射性测定的方法(使用确定特异性的多克隆或者单克隆抗体)为本领域所公知。参见，例如，Harlow和Lane。这样的免疫测定一般包括测定靶多肽与特异性抗体间形成复合物。优选双位点、基于单克隆抗体的免疫测定(使用能与靶多肽上非干扰的双表位反应的单克隆抗体)，但是也可以使用其它测定，诸如竞争性结合测定。参见，例如，Maddox，D.E.等人，1983，实验医学杂志(J Exp Med)，1581211。
本发明设计使用与CTGF多肽或其片段特异性地反应的抗体，该抗体中和本发明之CTGF片段的生物学活性。在本方法中所施用的抗体可以是完整的抗体或者其抗原结合片段，诸如Fab、F(ab’)2和Fv片段，它们能够结合表位的抗原决定簇。在本方法中所使用的抗体可以是多克隆抗体，或者更优选地，单克隆抗体。具有不同表位特异性的单克隆抗体是通过本领域公知的方法，从含有蛋白质片段的抗原制造的。参见，例如，Kohler等人，自然，256494；Ausubel等人，同上。
在本发明中，治疗应用包括使用导向CTGF或其片段的“人”或“人源化”抗体的那些治疗应用。人源化抗体为具有与亲代抗体相同结合特异性的抗体或抗体片段，一般源自小鼠，但提高了其人源特性。人源化抗体可以，例如，由链交换或者由噬菌体展示技术获得。例如，将包含非人抗体的重链或轻链可变结构域、特异性地针对CTGF的多肽与人互补(轻或重)链可变结构域的所有组成部分组合。将特异性地针对目的抗原的杂合配对选择出来。所选配对中的人链可接着与人的互补可变结构域(轻或重)之所有组成部分组合，并可选择出与抗原特异结合的人源化抗体多肽二聚体。能够用于本发明的方法、描述产生人源化抗体的技术，公开在例如，美国专利5565332、5585089、5694761和5693762中。而且，在例如美国专利5545806和5569825中描述了在转基因小鼠中产生人抗体的技术。
反义寡核苷酸 本发明提供这样的治疗方法，它直接干扰CTGF信使，具体地全长CTGF信使(其中，该全长蛋白质接着被切割形成本发明的CTGF片断)或者CTGF片断(统称“CTGF mRNA”)翻译为蛋白质。更具体地，本发明提供这样的方法，其中使用反义核酸或核酶结合或切割CTGF mRNA。反义RNA或DNA分子特异性地与靶基因的RNA信使结合，阻断该基因蛋白质产物的表达。反义链结合信使RNA，形成不能够被细胞翻译的双链分子。另外，化学反应基团，诸如结合铁的乙二胺四乙酸(EDTA-Fe)能够结合到反义寡核苷酸上，引起杂交位点处RNA的切割。反义方法抑制基因翻译的这些和其它用途为本领域公知。参见，例如，Marcu-Sakura，1988，分析生物化学(Anal.Biochem)，177278。
更具体地，在本发明的一个实施方案中，用于抑制CTGF mRNA表达的反义多核苷酸的序列能够通过比较直向同源基因的序列(在不同种类间保存的序列)或者通过直向同源基因的转录本并鉴定这些序列中的高度保守区而获得。核酸序列的相似性可以由本领域公知的方法和规则系统确定。这样的方法和规则系统包括，例如，BLAST程序(Basic LocalAlignment Search Tool at the National Center for Biological Information)、ALIGN、AMAS(多重排列的序列分析，Analysis of Multiple Aligned Sequences)和AMPS(蛋白质多重序列排列对比，Protein Multiple Sequence Alignment)。
对于一段给定的多核苷酸，在选择优选的长度时，应考虑多种因素以达到最佳特性。一方面，本发明的多核苷酸长度为至少15个碱基对(bp)；优选地长度为大约15bp至大约100bp；更优选地，多核苷酸长度为大约15bp至大约80bp；甚至更优选地，本发明的多核苷酸长度为大约15bp至大约60bp。较短的多核苷酸，诸如10至低于15聚体，在提供较高的细胞穿透作用的同时，却具有较低的基因特异性。与此相反，较长的多核苷酸(20-大约30bp)提供较好的特异性，却显示减低的吸收进细胞动力学。参见，Stein等人，“寡脱氧核苷酸基因表达的反义抑制剂”，Cohen编著，McMillan出版社，伦敦(1988)。对转录本RNA靶序列的可及性也是重要的，因而，位于靶向RNA中的成环区和直向同源序列提供有价值的靶子。在本发明的公开内容中，术语“多核苷酸”既涵盖自然界中存在的那种寡聚体核酸部分(诸如DNA和RNA的脱氧核苷酸和核苷酸结构)又涵盖能够与自然界中存在的核酸结合的人造类似物。本发明的多核苷酸可以是基于由磷酸二酯键连接的核苷酸或脱氧核苷酸单体，或者是基于由甲基磷酸酯键、硫代磷酸酯键或其它键连接的类似物。它们也可以包含改变了碱基结构或者其它修饰的单体部分，但是它们仍保留与天然存在的转录本RNA结构结合的能力。这样的多核苷酸可以通过本领域公知的方法制备，例如，使用有商业供应的仪器和试剂(诸如能从Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)得到的那些)来制备。例如，根据标准方法学，合成特异性地靶向转录本的多核苷酸。硫代磷酸酯修饰的DNA多核苷酸一般在自动化的DNA合成仪(可从多个制造商获得)上自动化合成DNA。这些仪器能够合成长度达100bp、纳摩尔量的多核苷酸。由现代仪器合成的较短多核苷酸通常不需进一步纯化就适于使用。如果需要，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向色谱可以纯化多核苷酸。参见，Sambrook等人，分子克隆实验室手册，第二卷，第11章，Cold Spring Harbor Laboratory出版社，Cold Spring Harbor，NY(1989)。
磷酸二酯键连接的多核苷酸对血清中或细胞内核酸酶的作用尤其敏感，所以，在优选的实施方案中，本发明的多核苷酸为硫代磷酸酯或甲基磷酸酯连接的类似物，已发现这些类似物抗核酸酶。本领域普通技术人员能够容易地选择其它连接键用于本发明。也可以设计这些修饰，目的是改善细胞对多核苷酸的吸收和稳定。
用于施用多核苷酸的合适的载体可以包括，例如，载体、抗体、药学组合物、结合或寻靶蛋白质，或病毒传送系统，使序列进入靶细胞或组织中富集。可以本发明的多核苷酸与，例如，识别内皮细胞或肿瘤细胞的结合蛋白质偶联。施用后，本发明的多核苷酸能够靶向受体细胞或组织，这样就使例如细胞因子、转录因子、G-蛋白偶联受体、肿瘤抑制蛋白和细胞凋亡起始蛋白可以获得增强的表达。
使用重组表达载体诸如嵌合病毒或胶体分散系统，能够传送反义分子等等。如本发明所述，能够用于基因治疗的多种病毒载体包括腺病毒、疱疹病毒、痘病毒或优选地RNA病毒诸如逆病毒。许多已知的逆病毒能够转移或结合用于选择标记的基因，这样就能够对转导细胞进行鉴定和繁殖。通过将目的多核苷酸序列插入到病毒载体中(例如)编码配体(而其受体位于特异的靶细胞上)的另一个基因旁边，载体将是靶特异性的。通过将(例如)编码糖、糖脂或蛋白质的多核苷酸插入到逆病毒载体，能够将其构建为靶特异性的。用抗体靶向逆病毒载体，实现优选的靶向性。本领域技术人员将知道或者可以容易地，而不需要不适当的实验，确定特定的多核苷酸序列，可以将这些多核苷酸序列插入到逆病毒基因组以允许含有反义多核苷酸的逆病毒载体靶特异性传送。
由于重组的逆病毒是缺陷型的，所以它们需要协助以产生感染性载体颗粒。这些协助可通过，例如，使用含有编码逆病毒所有结构基因(它们由LTR内的调节序列控制)的质粒的辅助细胞系提供。这些质粒丢失了这样的核苷酸序列，它们能够使包装机制识别用于包衣壳作用的RNA转录本。包装信号有缺失的辅助细胞系包括但不限于ψ2、PA317和PA12。这些细胞系产生空的病毒粒，这是由于其中没有包装基因组。如果将逆病毒载体引入到这样的细胞中，其中的包装信号是完整的、但结构基因被其它目的基因取代，则能够将载体包装并且产生载体病毒粒。
或者，用编码逆病毒结构基因gag、pol和env的质粒，通过常规的磷酸钙转染法可直接转染NIH 3T3或其它组织培养细胞。接着，用含有目的基因的载体质粒转染这些细胞。所得细胞释放逆病毒载体到培养基中。
反义分子的另一个靶向传送系统是胶体分散系统。胶体分散系统包括大分子复合物、纳诺胶囊、微球体、珠和基于脂质的系统(包括油浸水乳浊液、胶束、混合胶束和脂质体)。本发明的优选胶体系统为脂质体。脂质体是人工的膜囊，它们被用作体内和体外的传送系统。已经证实，巨大单片层囊(LUV)(大小范围在0.2-4.0μm)能够包被显著比例的含有大量大分子的水性缓冲液。RNA、DNA和完整的病毒粒可被胶囊化地包被在水性内部并以有生物学活性的形式传送到细胞中。脂质体要成为有效的基因转移媒介物，应具备以下特性(1)目的基因高效率地胶囊化包被而不牺牲其生物学活性；(2)与非靶细胞相比，优先地并显著地结合靶细胞；(3)高效率地将囊泡中的水性内容物传送到靶细胞细胞质；和(4)遗传信息的准确有效表达。
小分子抑制物 本发明进一步提供这样的方法，其中对抑制本发明的CTGF片段活性的小分子进行了鉴定并使用。
可通过多种筛选技术，对抑制CTGF片段活性的小分子进行鉴定。用于筛选化合物的测定将提供与化合物结合到蛋白质或细胞靶位相关的可检测信号。依据测定的性质，可检测信号可以是光吸收或发射、空斑形成或者其它方便的信号。结果可以是定性的或定量的。
筛选具有特异性结合的化合物，可以使用多种免疫测定法，检测结合到细胞的人(或灵长类)抗体。因而，可以使用标记的抗人免疫球蛋白，例如，抗人IgM、IgG或其组合，检测特异性结合到人抗体半乳糖基表位的人抗体。可使用多种标记，诸如放射性同位素、酶、荧光剂、化学发光剂、颗粒等等。有许多商业供应的试剂盒，提供标记的抗人免疫球蛋白，可以根据制造商提供的方法来使用。
有多种方法可用于筛选化学化合物文库。在某种程度上，要依赖化合物制备物的性质选择合适的方法。例如，化合物可以结合到一个个颗粒、针、膜等等上面，其中每一个化合物都是隔开的。另外，化合物的含量将根据构建文库所使用的方法而变化。而且，依据化合物与支持物结合的性质，可以做到释放等分量化合物，以完成一系列的测定。另外，对已表明有活性的化合物的鉴定能力将影响化合物的测定方式。
当化合物一个个地在网格的表面上，而且知道在网格的每一个位点上是什么组成，如此则能够提供这样的细胞样平层，其构造与网格相似，并可将每一个结合到固体表面的化合物的位置注册。一旦将平层和固体底物注册，就可以依据化合物的结合方式将化合物从表面释放。在给予化合物足够时间以结合到位于细胞样表面的蛋白质后，可冲洗细胞样平层以去除非特异性结合的化合物。可能需要一次或多次冲洗，其中，根据所需要的亲和力程度，可用冲洗提供变化的严谨度。冲洗完毕后，此时可以加入哺乳动物血液或血浆并温育足够的时间用于细胞毒性。接着可以将血浆或血液去除并观察空斑，其中化合物的性质可以根据其在网格中的位置确定。当然，血浆或血液不应该含有能够天然地杀死平层细胞的任何组分。
由于可以重复制备过程，所以可以制备多份固体底物，其中在可比位点上制备出相同的化合物，这样就能够用相同或不同的细胞重复筛选，确定一个个化合物的活性。
在某些情况下，可通过核酸标签，聚合酶链反应扩增标签确定化合物的身份(参见，例如，WO 93/20242)。在这种情况下，通过取出裂解物并将裂解物引入到含有对核酸标签特异的引物的聚合酶链反应介质中，可以确定活性化合物。关于扩增，可以对核酸标签测序或者由其它手段确定其序列，其结果将表明用于制备化合物的合成步骤。
或者，可以获得这样的加标签颗粒，其标签可从颗粒释放出来并提供二元密码子，描述化合物结合到颗粒上的合成步骤。参见，例如，Ohlmeyer等人，美国国家科学院院刊(1993)，9010922。这些标签可以方便地是烯化化合物的同源系列，它们可通过气相色谱-电子捕捉检测。依据连接基团的性质，可使其从颗粒中部分释放，这样，在鉴定特定的化合物之前，能使用颗粒2至3次。
对于绝大部分已讨论的文库，只要能够将CTGF的表位连接到每一个化合物，就可以对任何巨大的化合物组进行类似的筛选。因而，也可以对天然和合成的不同来源化合物，包括大环内酯物、寡肽、核酸、dendrimers等等用相似的方式筛选。
在测定中形成空斑证实文库中的成员结合到细胞，通常是表面蛋白质上，并不干扰CTGF表位结合抗体，并且免疫复合物足够稳定以启动补体级联，而且该成员对靶子具有高亲和力。
其它用于获得调制本发明之CTGF片段活性的小分子筛选方法，公开在PCT公开文件WO 9813353中。
药物配方和施用方式为了鉴定用于本方法通过调制CTGF的活性和表达，用于治疗或预防肾脏障碍的小分子和其它试剂，可将CTGF和其生物学活性片段用于，在多种筛选技术的任何之一中，筛选治疗化合物。在这些筛选试验中所使用的片段可以是游离于溶液中、固定在固体支持物上、加载到细胞表面或者定位于细胞内。生物学活性的阻断或还原，或者CTGF与待试验介质间结合复合物的形成，可通过本领域中可用的方法测量。
用于药物筛选的其它技术，其中可以对与CTGF或者用于调制、调节或抑制CTGF的表达和/或活性的另一个靶多肽具有适当结合亲和力的化合物进行高通量筛选，为本领域公知。例如，使用本领域中可用的方法，可以对携带试验化合物的微矩阵进行制备、使用和分析。参见，例如，Shalton，D等人，1995，PCT申请WO 95/35505；Baldeschweiler等人，1995，PCT申请WO 95/251116；Brennan，T.M.等人，1995，美国专利5474796；Heller，M.J.等人，1997，美国专利5,605,662。
通过多种其它筛选技术，也能够对调制CTGF活性的小分子进行鉴定，这些小分子也可用于鉴定抗体和与CTGF相互作用的其它化合物，并可被用作本方法的药物和治疗剂。参见，例如，Enna，S.J.等人编著，1998，药理学中的当代方法(Current Protocols inPharmacology)，John Wiley and Sons。在测定中，通常提供化合物与蛋白质或细胞靶子结合相关的可检测信号。可通过例如荧光团、酶轭合和本领域公知的其它可检测标记检测结合。参见，例如，Enna等人。结果可以是定性的或定量的。
为筛选具有特异性结合的化合物，可以使用多种免疫测定法，用于检测例如人或灵长类的结合到细胞的抗体。因而，可以使用标记的抗人免疫球蛋白例如，抗人IgM、抗人IgG或其组合，检测特异性地结合到人抗体半乳糖基表位的人抗体。可以使用多种标记，诸如放射性同位素、酶、荧光剂、化学发光剂、颗粒等等。有许多商业供应的试剂盒，提供标记的抗人免疫球蛋白，可以根据制造商提供的方案来使用。
可以使用广泛多种方案，筛选有细胞毒效应的化合物，以确保获得所希望的活性。通常使用细胞，它可以是天然存在的或经修饰的、细胞系或其它等等。细胞可以是真核细胞或原核细胞。例如，如果对病原体感兴趣，而不在乎化合物结合物结合到哪一个表位，那么，在存在抗体依赖的细胞毒系统中，就可以将病原细胞与每一个化合物组合，确定细胞毒效应。可以在确定各种候选化合物对将使用于该宿主的宿主细胞的效应之前或者之后，进行这样的测定。通过这种方式，就可以获得对病原靶子的亲和力和对可能遇到的宿主细胞(基于施用方式)的亲和力二者之间的差异分析。
在某些情况下，人们可能对在自体免疫疾病、移植等中可能存在于T细胞中的特定的细胞状态，诸如激活状态感兴趣。在这种情况下，应首先筛选化合物以确定能与静息细胞结合的那些化合物，至于那些不与静息细胞结合的化合物，通过对激活细胞的细胞毒性对剩余的候选化合物进行筛选。这时，可对化合物可能遇到的存在于宿主中的其它细胞进行筛选，确定它们的细胞毒效应。或者，还可以使用癌细胞和正常细胞以确定其中的任何化合物，相对于正常细胞而言，是否对癌细胞具有更高的亲和力。再者，还可以通过与正常细胞的结合，筛选化合物文库，并确定其效应。对正常细胞没有细胞毒的那些化合物可以接着用于筛选它们对癌细胞的细胞毒效应。即使对正常细胞存在一定的细胞毒性，但对癌细胞具有足够的细胞毒活性差异，在这种情况下，可能会愿意容忍其对正常细胞的低细胞毒性，而该化合物已表明对癌细胞有效。
可以使用已通过重组技术修饰的细胞，而不是天然获得的细胞。所以，可以使用这样的细胞，其能够被培养生长，其通过特定基因的高调节(upregulate)或低调节(downregulate)可被修饰。如此则可获得这样的细胞，它们仅在单单一种位于表面的蛋白质上有所不同。针对文库中的成员对存在或者不存在该特定蛋白质的细胞的效应，这时就可以对文库进行差异性测定。通过这种方式，就能够确定化合物对特定的表面膜蛋白质，而不是对存在于表面膜上的任何蛋白质，是否具有特异的亲和力。
通过使用与特定表面膜蛋白质结合的抗体，例如，通过使用不同种、同型或其组合的抗体可以区分不同的细胞，其中该抗体不启动补体依赖的细胞毒效应。通过将抗体、封阻抗血清或单克隆抗体加到一部分细胞中，将使那些细胞不具有用于结合文库成员的可用的靶蛋白质。这样就制造出可比细胞，基于在一组细胞中，无法利用某单一蛋白质，它们在应答方面有区别，。虽然抗体通常是最方便使用的试剂，但可以使用提供相同功能的其它特异性结合物质。
可以使用抗体依赖的细胞毒性系统，用于在测定中确定结合。可以使用合成的组分混合物，其中只含有对于细胞毒性效应必需的那些成分。希望如此的原因是血液或血浆中的成分可能会对测定的结果产生负面影响。
另外，虽然细胞样平层是极为方便的筛选大量候选化合物的方式，但还可以使用其它技术。这些技术包括多孔板的使用和用于制备组合文库的多种装置，诸如针、茶叶袋等等。可以分开培养细胞，这要参考各种装置的性质，其中使装置与细胞接触或者让细胞在装置上生长。可以将装置浸在合适的培养基中，接种细胞，或者另外为细胞与候选化合物间提供接触。在加入细胞毒介质后，可以多种方式分析裂解物。例如，FACS可用于区别活的和死的细胞，可以使用上清液中51Cr的释放，或者在上清液中细胞内化合物的检测，可用于检测活性化合物。
另外，也许希望知道化合物是否具有兴奋剂或拮抗剂活性。受治疗者测定技术为确定存在于文库中、与靶蛋白质结合的那些化合物提供快速的方法。一旦将候选化合物的数量显著地减少，就可以使用更为复杂的测定法，用于检测化合物本身的活性。用这种方式，先进行快速筛选以确定结合亲和力和特异性，随后进行更深入细致的筛选以确定活性。用于确定活性的技术有多种，其中的细胞可以是经修饰过的，这样标记基因将被激活，从而提供可检测信号。信号可以很方便地与颜料的产生相关联、信号可以是表面膜蛋白质的产生，而该蛋白能够用标记抗体检测出，或者蛋白质的分泌可通过多种技术，在上清液中检测出来。例如，被表达的基因可能是虫荧光素酶，它经修饰后含有引导序列，这样可使其分泌，通过使用适当的底物，就可以将其中的上清液用于筛选光产生的形成。
有多种方法可用于筛选化学化合物文库。在某种程度上，这要依赖化合物制备物的性质。例如，化合物可以结合到一个个颗粒、针、膜等等上面，其中每一个化合物都是隔开的。另外，化合物的含量将根据构建文库所使用的方法而变化。而且，依据化合物与支持物结合的性质，可以做到释放等分量化合物，以完成一系列的测定。另外，对已表明具有活性的化合物的鉴定能力将影响化合物的测定方式。
当化合物一个个地在网格的表面上，而且知道在网格的每一个位点上是什么组成，如此则能够提供这样的细胞样平层，其构造与网格相似，并可将每一个结合到固体表面的化合物的位置注册。一旦将平层和固体底物注册，就可以依据化合物的结合方式将化合物从表面释放。在给予化合物足够时间以结合到位于细胞样表面的蛋白质后，可冲洗细胞样平层以去除非特异性结合的化合物。可能需要一次或多次冲洗，其中，根据所需要的亲和力程度，可用冲洗提供变化的严谨度。冲洗完毕后，此时可以加入哺乳动物血液或血浆并温育足够的时间用于细胞毒性。接着可以将血浆或血液去除并观察空斑，其中化合物的性质可以根据其在网格中的位置确定。血浆或血液不能含有可以天然地杀死平层细胞的任何组分。
由于可以重复制备过程，所以可以制备多份固体底物，其中在可比位点上制备出相同化合物，这样就能够用相同或不同的细胞重复筛选，确定一个个化合物的活性。在某些情况下，使用聚合酶链反应扩增标签，确定出化合物的身份。参见，例如，PCT申请WO93/20242。在这种情况下，通过取出裂解物并将裂解物引入到含有对核酸标签特异的引物的聚合酶链反应介质中，可以确定活性化合物。关于扩增，可以对核酸标签测序或者由其它手段确定其序列，其结果将显示用于制备化合物的合成步骤。
或者，可以获得这样的加标签颗粒，其标签可从颗粒释放出来并提供二元密码子，描述化合物结合到颗粒上的合成步骤。参见，例如，Ohlmeyer等人，美国国家科学院院刊(1993)，9010922)。这些标签可以方便地是烯化化合物的同源系列(其能够由气相色谱-电子捕捉检测)。依据连接基团的性质，可使其从颗粒中部分释放，这样，在鉴定特定的化合物之前，能使用颗粒2至3次。
对于绝大部分已讨论的文库，只要能够将CTGF的表位连接到每一个化合物，就可以对任何巨大的化合物组进行类似的筛选。因而，也可以对不同的天然和合成来源的化合物包括大环内酯物、寡肽、核酸、dendrimers等等用相似的方式筛选。
在测定中形成空斑证实文库中的成员结合到细胞，通常是表面蛋白质，并不干扰CTGF表位结合抗体，并且免疫复合物足够稳定以启动补体级联，而且该成员对靶子具有高亲和力。
可将受治疗者方法学用于任何需要将细胞靶子杀死的情况，尤其是，那些具有低的或没有CTGF表位的细胞靶子。所以，细胞靶子可以是有致病性的原核细胞。多种生物体包括，例如微细菌(microbacterium)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoea)、链球菌属(Streptococcus)、流感嗜血菌(Hemophilus influenza)等等。其它致病原包括真核细胞，尤其是真菌诸如白念菌属(Candida)、组织胞浆菌(Histoplasma)等等，和原生动物例如贾弟虫(Giardia)。另外，用于在感染细胞中提供表面膜蛋白质的病毒，也可以是受治疗者化合物的靶子，其中被筛选的细胞已被非常严重地感染。
宿主细胞也可用作为靶子，其中的细胞是非正常的或者以不利的方式作用于宿主或宿主的治疗。例如，能够与正常组织区别开的癌性组织可用作受治疗者化合物的靶子。与自体免疫疾病相关或者与GVHD或移植排斥相关的T或B细胞也可用作靶子。异常细胞，不管其性质如何，只要能将其与正常细胞区分开，也可以用作靶子。因而，银屑病病灶，淋巴瘤细胞，被细菌、真菌、寄生虫或病毒感染的细胞，可以作为受治疗者化合物的靶子。另外，当希望切除一部分细胞而不除去所有细胞诸如表达分化标记的细胞(诸如，T细胞亚类、激活的血小板、内皮细胞、激素或细胞因子受体表达细胞)时，可以应用受治疗者化合物。
用于获得调制CTGF活性的小分子的其它筛选方法，可在例如PCT申请WO 981335中见到。
化合物/分子 通过调制、调节或抑制CTGF活性，本发明提供用于治疗和预防与肾脏纤维化相关的障碍的方法。这些方法可包括施用治疗有效量的化合物封阻结合反应或封阻参与CTGF信号转导途径的酶。更具体地，通过施用对诱导CTGF可进行封阻的化合物，本发明提供用于抑制CTGF活性的方法。
在本发明的方法中，调制CTGF基因表达和/或CTGF活性的化合物包括引起细胞中环核苷酸水平升高的介质。根据本发明的方法，对诱导CTGF可进行封阻的化合物，通过使用上述筛选方法可对其进行鉴定。
在一个实施方案中，本发明提供化合物或介质(agent)的鉴定方法。它能够调制例如，如图3的外显子2和3编码的片段等CTGF片段的活性，例如，细胞外基质蛋白质的产生、肌成纤维细胞分化的诱导、胶原合成的诱导，该方法包括诸如肽、小分子、多肽、peptidomimetic等目的试剂与(例如，成纤维细胞等)细胞和已知具有所希望活性，例如，胶原的产生的CTGF片段接触，以及通过本领域技术人员公知的任何手段(参见实施例)测量细胞产生胶原的能力。接着，将细胞产生胶原的能力与在介质或化合物不存在的情况下合适的对照细胞群体产生胶原的能力进行比较。
术语“介质(agent)”或“化合物”，正如本文所用，描述具有能够影响如本文所述的CTGF片段活性能力的任何分子，例如蛋白质、多肽或药物。介质可以是任何已知的或怀疑能够影响细胞的物质。介质包括CTGF多肽的肽片段。介质包括合成的化学介质、生化介质、细胞、提取物、匀浆物和条件培养基。试验介质也可以是用于筛选复份化合物的组合文库。通过通常应用于检测特异DNA序列的任何方法，诸如PCR、寡聚体限制性酶切(Saiki等人，Bio/Technology，31008-1012，1985)、等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner等人，美国国家科学院院刊，80278，1983)、寡核苷酸连接测定法(OLA)(Landegren等人，科学，2411077，1988)等等，可以对在本发明的方法中所鉴定的化合物，于溶液中或者结合到固体支持物后，进行进一步的评价、检测、克隆、测序等等。已对用于DNA分析的分子技术进行了综述(Landegren等人，科学，242229-237，1988)。
候选介质涵盖许多类化学品。它们可以是有机分子，优选地有机小分子化合物(分子量大于50并小于大约2500道尔顿)，候选介质包括与蛋白质在结构方面相互作用(尤其是氢键的形成)所必需的功能基团，并且一般包含至少一个氨基、羰基、羟基或羧基基团，优选地至少两个功能性的化学基团。候选介质通常包含被上述的一个或多个功能性基团取代的碳环或杂环结构和/或芳香环或多芳香环结构。在生物分子中也发现有候选介质，包括但不限于肽、糖、脂肪酸、甾类化合物、嘌呤、嘧啶、衍生物、结构类似物或其组合。候选介质可以是多肽，或者由定位诱变或随机诱变合成的或天然存在的核酸序列产生的多肽。
在本发明的进一步实施方案中，其中的方法提供用于这样的分子施用，它干扰全长CTGF的翻译后修饰或者封阻无活性CTGF前体的激活。正如本文所讨论，血管系膜细胞暴露于TGF-β，导致在28-30 kDa处出现新的显著条带，其大小与全长CTGF分子的羧基末端半分子和氨基末端半分子相当。正如上面所公开，用TGF-β处理导致能够切割全长分子的蛋白酶或其它因子的产生。通过使用本文提供的筛选方法，可以鉴定抑制CTGF活性的分子。
药物配方和施用途径使用途径 可以将包含CTGF调制子，即，如本文所述的抗体、反义寡核苷酸、小分子和其它化合物的组合物施用于人类患者本身，或者在药物组合物中包含合适的载体或赋形剂。本发明设计了治疗方法，其中将调制或调节CTGF或其片段活性或表达的介质，以适于治疗或预防CTGF片段活性或表达的量，施用于所需患者。本治疗和预防方法包括将有效量的介质施用于受治疗者，优选地哺乳动物受治疗者，最优选地人受治疗者。在优选的实施方案中，受治疗者哺乳动物和所施用的介质是相同来源的。最优选地，受治疗者和所施用的介质源自人。
有效施用量可以容易由日常实验确定，最有效和最方便的施用途径以及最合适的配方也能如此确定。在本领域中有多种可用的配方和药物传送系统(参见，例如，Gennaro，A.R.编著，1990，Remington’s药物科学，第18版，Mack出版公司，Easton PA)。合适的施用途径可以包括，例如，口、直肠、跨粘膜，或肠道施用和包括肌内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、腹膜内、鼻内或眼内注射等非肠道传送。组合物可采用局部而不是系统方式施用。
本发明的药物组合物可以由任何本领域公知的方法，诸如由常规的混合、溶解、颗粒化、糖衣化、研磨、乳化、胶囊化、包封或冷干方法制备。正如上面所指出，本发明的组合物可包括一种或多种生理可接受的载体，诸如对加工活性分子为药物用途的制备物有促进作用的赋形剂和辅助剂。恰当的配方依赖于所选择的施用途径。
例如，注射用的组合物可以在水性溶液中配制，优选地在生理相容的缓冲液诸如Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理盐水缓冲液中配制。对于跨粘膜施用，可以在配方中使用针对待透过屏障的合适的渗透剂。这样的渗透剂一般为本领域公知。对于口部施用，通过使活性化合物与本领域公知的药物可接受载体结合，可以容易地配制化合物。这样的载体可以使本发明的化合物配制为片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液、悬浮液等等，由受治疗者口服。也可以将化合物配制为直肠施用的组合物，诸如栓剂或滞留灌肠剂，例如，含有常规栓剂基质诸如可可奶油或其它甘油酯。
口服使用的药物制剂可加入固体赋形剂后得到，任选碾磨所得混合物，并加工颗粒混合物，在加入适当的辅助剂后，如果需要，制成片剂或糖丸剂核。填加剂例如包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇等的糖、纤维素制备物诸如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基-纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是特别合适的赋形剂。如果需要，可以加入分裂介质，诸如，交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者藻酸或藻酸盐，例如藻酸钠。
为糖丸剂核提供合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其中可任选地包括阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbolpol凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、紫胶漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或色素加到片剂或糖丸剂的包衣中，以鉴别或区分活性化合物剂量的不同组合。
用于口服使用的药物制剂包括由明胶组成的推合式(push-fit)胶囊以及由明胶和诸如甘油或山梨糖醇等增塑剂组成的密封软胶囊。推合式胶囊中的混合物可含有活性组分，混合物中又带有填充剂诸如乳糖、黏合剂(诸如淀粉)和/或润滑剂(诸如滑石或硬脂酸镁)和，任选地，稳定剂。在软胶囊中，可将活性化合物溶解或悬浮于诸如，脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇等合适的液体中。另外，可加入稳定剂。口服所有配方的剂量应该适于这种使用。
对于通过吸入使用，从加压的包装或雾化剂中，将根据本发明而使用的化合物通过气溶胶喷雾递送的形式容易地传送，同时使用了合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳、或任何其它合适的气体。在加压气溶胶情况下，通过提供阀门，传送经计量的量，可确定合适的剂量单位。可以配制用于吸入者或吹入器，例如，明胶胶囊和药筒。它们一般含有化合物与适合的粉末基质，诸如乳糖或淀粉的粉末混合物。
通过注射，例如，通过大丸剂注射或连续输注等为非肠道施用而配制的组合物，可配成单位剂量的形式，例如，在安瓿中或者在多剂量容器中，并加入防腐剂。组合物可以采用例如悬浮液、溶液或者在油性或水性媒介物中乳浊液的形式存在，并且可以含有配制介质，诸如悬浮、稳定和/或分散介质。用于非肠道施用的配方包括影响CTGF或其片段活性的介质之水性溶液，以可采用溶于水的形式。
可以将活性化合物的悬浮液制备适当的油性注射悬浮液。合适的亲脂溶剂或媒介物包括脂肪油，诸如芝麻油和合成的脂肪酸酯，诸如油酸乙酯或甘油三酯等或脂质体。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨糖醇或葡聚糖，可以选择的是，悬浮液也可含有提高化合物可溶性的合适的稳定剂或介质，以便制备高浓缩溶液。或者，活性组分可以粉末形式，以便与合适的媒介物，诸如，灭菌的无致热原水在使用前混合。
也可以将本发明的组合物配制为贮存制剂。这样的长效配制物可通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射施用。所以，举例来讲，可以将化合物与合适的多聚体或疏水物质(例如，在可接受的油中形成乳浊液)或者离子交换树脂配制在一起，或者配制为微溶的衍生物，例如，微溶盐形式。
用于本发明的疏水分子的药物载体可包括包含如，苯甲醇，它是一种非极性表面活性物质、可与水混溶的有机多聚体和水相的共溶剂系统。该共溶剂系统可以是VPD共溶剂系统。VPD是用无水乙醇配制的溶液，其中含有3％(重量/体积)苯甲醇、8％(重量/体积)多聚山梨酸酯80，它是一种非极性表面活性物质和65％(重量/体积)聚乙二醇300。该VPD共溶剂系统(VPD5W)由VDP与5％右旋糖水溶液按1∶1比例稀释组成。该共溶剂系统能够有效地溶解疏水性化合物并且在系统性地施用时产生的毒性低。当然，可以显著地改变共溶剂系统的比例而不破坏其溶解性和毒性特性。而且，也可以改变共溶剂系统的组分的同一性。例如，可以用其它低毒性的非极性表面活性物质取代多聚山梨酸酯80，也可以改变聚乙二醇的分级大小，也可以用其它生物相容的多聚体，例如，聚乙烯吡咯烷酮取代聚乙二醇，并且可以用其它糖或多糖取代右旋糖。
或者，可以使用针对疏水分子的其它传送系统。脂质体和乳浊液是众所周知的疏水性药物传送媒介物或载体的例子。也可以使用某些有机溶剂，诸如二甲基亚砜，尽管这样做通常会以更大的毒性为代价。另外，化合物的传送，可以使用持续释放系统，诸如含有效剂量待施用组合物的半渗透性的固体疏水性多聚体基质。已建立多种持续释放物质，并可为本领域技术人员所用。持续释放胶囊，依据它们的化学性质，可以释放化合物几周至超过100天。依据治疗剂的化学性质和生物学稳定性，可以采用稳定蛋白质的附加策略。
有效剂量 对用于本治疗方法的任何组合物，通过使用本领域公知的多种技术可以首先对治疗有效剂量进行估计。例如，在细胞培养物测定中，使用动物模型可以算出循环浓度范围达到将在细胞培养物中测定出的IC50包括在内时的剂量值。在需要抑制CTGF活性时，例如，可确定所试验化合物达到半数最大抑制CTGF活性的浓度。可通过使用从细胞培养物测定和其它动物研究中所获得的数据，确定受治疗者为人的适合的剂量范围。
治疗有效剂量指这样的分子数量，其导致受治疗者的症状改善或者存活期延长。在细胞培养物或实验动物中，通过标准的药物学方法，可以确定这样的分子的毒性和治疗有效性，例如，通过确定LD50(使50％群体死亡的剂量)和ED50(有效治疗50％群体的剂量)。毒性与疗效的剂量之比为治疗指数，可将其表达为LD50/ED50的比值。优选具有高治疗指数的分子。
优选地，剂量落在这样的循环浓度范围内，其包括在几乎没有毒性或没有任何毒性的ED50内。依据所使用的剂量形式和所采用的施用途径，可在该范围内变动剂量。要参考受治疗者的具体情况，选择精确的配方、施用途径和剂量。
可以单独地调整剂量值和施用间隔，以提供这样的活性组分血浆水平，它的最低有效浓度，MEC足以根据需要调制或调节CTGF活性。MEC将随每一种化合物而变化，但是可以从诸如，使用本文中所描述的测定法，达到50-90％CTGF活性以诱导骨髓生长所需要的浓度等体外数据估计MEC。
达到MEC所需要的剂量将依赖个体特性和施用途径。应使用这样的方案施用组合物，它使组合物的血浆水平在MEC之上维持大约10-90％治疗期，优选地大约30-90％治疗期，并且最优选地介于50-90％治疗期。在局部施用或选择性吸收的情况下，药物的有效局部浓度不一定与血浆浓度相关。
当然，组合物的施用量将依赖于多种因素，包括但不限于，特定受治疗者的体重、疾病的严重程度、施用方式和处方医生的判断。
包装 如果需要，可将组合物装入这样的包装袋或配药装置中，其中可以含有一个或者多个含活性组分的单位剂量形式。包装袋可以包含金属或塑料箔，诸如发泡包装。在包装袋或配药装置中可以附上使用说明书。也可以将含有本发明的化合物的组合物配制于相容的药物载体中制备、放置于合适的容器中，标上治疗的明确内容。标签上所明确的合适的治疗内容可包括治疗的障碍或疾病，其中希望为诱导软骨或骨、愈合伤口、保护神经、肾脏纤维化、糖尿病或等等。
实施例提供以下实施例仅仅是为了阐明要求保护的发明。然而，不能将本发明限于实施例的范围内，实施例的目的在于仅仅作为对本发明之单一方面的阐明，并且功能上等同的方法也在本发明的范围内。的确，除了本文中所描述的那些修饰外，根据前面的描述和附图，对本发明所进行多种修饰对本领域的技术人员而言将是显而易见的。旨在将这样的修饰落在附加的权利要求书范围内。
实施例1 CTGF片段刺激细胞外基质的合成为制备CTGF片段，用胰凝乳蛋白酶消化人的重组CTGF(全长)，产生一个CTGF片段。通过表达CTGF的外显子2和外显子3中的任意一个或者全部二者，也可产生重组CTGF片段。经培养的正常大鼠肾脏(NRK)成纤维细胞的连续细胞系(指定为克隆NRK-49F)从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得，以用于产生细胞培养物。从移植培养物建立了人包皮成纤维细胞。细胞培养物被保存在含有2.5％胎牛血清和2.5％Nu-Serum I(Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)的Dulbecco’s modified eaglemedium(DME)中，在细胞汇合前传代。
为检验成纤维细胞胶原合成，将细胞接种于含有2.5％胎牛血清/Nu-Serum的DME(在48孔板子上，10000个细胞/孔)中并让细胞生长至汇合(在5-7天内)，制备生长抑制的单层NRK和人包皮成纤维细胞。接着将单层成纤维细胞在含有25mM HEPES和ITS预混物(Collaborative Biomedical)的DME中，血清饥饿培养1-8天。接着加入抗坏血酸(50mg/ml)和生物介质(CTGF片段)。通过使用定量测定法，测量48小时治疗中的末端24小时3H-脯氨酸掺入到抗胃蛋白酶、盐析沉淀的细胞外/细胞表面相关胶原，估计胶原合成。正如在图2中所示，在存在1ng/ml TGF-b时，含有CTGF之外显子2和3的CTGF片段刺激NRK成纤维细胞中的胶原合成。与此相反，羧基末端的CTGF不刺激胶原合成。
实施例2 CTGF片段诱导肌成纤维细胞分化按如上所述，制备CTGF片段和细胞培养物。为检验CTGF片段对肌成纤维细胞的诱导，按如上所述制备和处理生长抑制的包皮成纤维细胞NRK的单层细胞。随处理后，在进行免疫组织学检测α-平滑肌之前，将48孔板上的单层细胞用TBS冲洗两次并将其在甲醇中于-20℃固定10分钟。实施免疫组织学检测。将单层细胞固定后，用TBS冲洗两次并用含10％马血清/2％牛奶的TBS封阻30分钟。接着，将细胞与按1∶200稀释于马血清/牛奶/TBS的单克隆鼠抗α-平滑肌肌动蛋白IgG(Clone 1A4，Sigma Chemical)混合并温育1小时。用TBS冲洗三次，随后将单层细胞与按1∶200稀释于马血清/牛奶/TBS的生物素酰基化马抗-鼠IgG(Vector Labs，Burlingame，CA)混合并温育1小时。接着，用碱性磷酸轭合的链亲和素-生物素复合物(Dako，Glostrup，Denmark)冲洗并温育单层细胞30分钟。随冲洗后，在有1mM左旋嘧唑存在下，用快红底物(Vector Red，Vector Labs)显现碱性磷酸酶。接着，将处理后的单层细胞在显微镜下检验红染的α-平滑肌肌动蛋白阳性肌成纤维细胞，并计数每孔中肌成纤维细胞数以及选择显微镜视野进行照相。
正如在图1中所示，成肌细胞诱导测定反映了成纤维细胞胶原合成的测定结果。具体地，本发明之CTGF片段，与羧基末端的CTGF片段(其不能够诱导成肌细胞分化)相比，能够诱导成肌细胞分化。
实施例3 中和性抗-CTGF抗体封阻TGF-β诱导的DNA合成、胶原合成和肌成纤维细胞诱导培育特定的抗-CTGF抗体，其通过使用本领域公知的方法，在杆状病毒表达系统中产生抗有生物学活性的重组的人CTGF。在山羊中制备抗体，直接地或者通过在NRK成纤维细胞中对TGF诱导的DNA或胶原合成，测试其对CTGF的中和活性。在测定对TGF-β作用的中和作用中，山羊抗体表现出活性。在这些测定中，山羊抗-CTGF抗体能够封阻DNA合成。另外，正如在图5中所证实，CTGF抗体能够封阻由TGF-β诱导的胶原合成和肌成纤维细胞形成。要指出的是，封阻胶原合成所需要的抗体量非常显著地小于封阻DNA合成所需要的量。Western印迹测定和竞争性ELISA测定均显示该制备物中的大部分抗体抗CTGF的N-末端结构域。这就提示这两个结构域可能负责刺激不同的生物学活性。
实施例4 特异性地针对CTGF N-末端结构域的抗-CTGF抗体选择性地封阻胶原合成通过使用纯化的CTGF N-末端或C-末端结构域，由亲和色谱制备对结构域特异的抗-CTGF抗体。通过胰凝乳蛋白酶有限消化完整的CTGF制备这些结构域。通过肝素-琼脂糖亲和色谱将这些结构域彼此分开。N-末端结构域不与肝素结合，而CTGF C-末端结构域含有肝素结合活性因而被保留在肝素琼脂糖上。这些结构域是纯的，根据Western印迹分析，其中含有不到0.1％的完整CTGF污染物。接着将每一种结构域以大约0.5mg/ml凝胶的浓度与Affigel 10偶联。接着，将抗-CTGF总IgG(山羊)吸附到亲和树脂，并洗脱特异结合的抗体。接着，在Western印迹中测试这些抗体，确定它们的反应特异性。通过使用本领域公知的技术，将只与N-末端结构域或只与C-末端结构域反应的IgG＝s从总库中分离出来。接着，在中和作用测定中，使用CTGF对抗体进行测试。这些研究的结果显示，抗CTGF N-末端结构域的抗体选择性地抑制胶原合成但不抑制DNA合成，正如在图6中所证实。与此相反，抗CTGF C-末端结构域的抗体选择性地抑制DNA合成但不抑制胶原合成。这些数据显示CTGF分子的不同区域可能负责传导不同的生物学活性信号。为证实和引伸这些结果，以下对所分离的结构域的生物学活性与完整的CTGF以及TGF-β的生物学活性进行了比较。
实施例5 CTGF N-末端结构域刺激细胞外基质产生使用本领域公知的技术，制备CTGF N-末端和C-末端结构域。第一种方法，如上所述，使用胰凝乳蛋白酶，通过蛋白水解消化具有生物学活性的完整CTGF制备纯的N-末端和C-末端结构域，这是因为胰凝乳蛋白酶几乎专一性地产生完整的N-末端结构域和C-末端结构域，而不产生任何较小的片段。生成纯的C-末端和N-末端结构域的第二种方法，需要只表达CTGF开放阅读的有限区域，它只编码C-末端结构域或者只编码N-末端结构域。这是通过PCR扩增开放阅读框架中的部分，并在无半胱氨酸区引入一个终止密码子以仅仅产生N-末端结构域，或者只将开放阅读框架中开始于无半胱氨酸区的AYRLED序列，直至杆状病毒穿梭载体GP67内的，编码C-末端结构域的部分克隆引入而实现的。这就产生了这样一种嵌合蛋白质，它含有指导所需要的重组蛋白质(或片段)合成到内质网，因而确保分泌的，来自GP67病毒基因的信号肽。在纯化后，将由多种方法产生的独立的结构域在用NRK成纤维细胞的生物测定中进行比较。这些研究结果证实了以前对含有结构域特异性的抗-CTGF抗体的观察。通过蛋白水解消化完整的CTGF或者通过直接的重组表达而产生的N-末端结构域，作为胶原合成和肌成纤维细胞诱导如在图7和图8中所示的诱导物，均具有完全的活性。相反地，由上述两种方法中的任一方法所产生的C-末端结构域，在DNA合成测定中也具有完全的活性。这些数据证明CTGF单独的结构域保留有完全的生物学活性，并且能够彼此独立地刺激靶细胞产生特定的生物学效应。在最适浓度时，单独的结构域所诱导的生物应答与完整的CTGF或TGF-β有可比性。这就强烈地显示TGF-β的促有丝分裂(DNA合成)和促基质合成(细胞外基质合成，诸如胶原合成)活性是通过CTGF和其相应的结构域介导的。
其它生长因子可与本发明的CTGF片段一起使用，提高CTGF对细胞外基质产生的诱导活性。例如，评价了肽生长因子IGF-2对胶原和对CTGF的肌成纤维细胞表型诱导活性的效应。在有CTGF存在时，浓度为2ng/ml或更高的IGF-2导致胶原合成以及肌成纤维细胞表型的大量增加，正如图9所示。
对本发明所述方法和系统的多种修饰和变化，而不脱离本发明的范围和精神，对本领域的技术人员而言将是显而易见的。尽管将本发明与特定的优选实施方案联系在一起进行描述，但是应该理解并不应当将发明，正如权利要求书所述，不适当地限制在这样的特定实施方案。确实，旨在将那些为实施本发明而对所述方式的多种修饰(其对于分子生物学或相关领域的技术人员而言是显而易见的)包括在随后的权利要求书的范围内。本文所引用的所有参考文献，本文全文引用作为参考。
权利要求
1.一种能特异性结合结缔组织生长因子片段的抗体，其中所述结缔组织生长因子片段包括氨基酸序列，选自下列各项(a)SEQ ID NO4中第24位至第95位残基；(b)SEQ ID NO4中第96位至第180位残基；和(c)SEQ ID NO4中第24位至第180位残基。
2.权利要求1所述的抗体，其中，所述抗体具有抑制细胞的胶原或平滑肌α-肌动蛋白合成的能力。
3.权利要求2所述的抗体，其中，所述细胞是人包皮成纤维细胞。
4.权利要求1-3任一项所述的抗体，应用于治疗与细胞外基质合成、胶原合成和/或肌成纤维细胞分化的诱导相关的疾病或障碍中。
5.权利要求1-4任一项所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体。
6.权利要求5所述的抗体，其中所述抗体是人单克隆抗体。
7.权利要求1-4任一项所述的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体。
8.权利要求1-4任一项所述的抗体，其中所述抗体是人源化抗体。
9.一种组合物，包括有权利要求1-8任一项所述的抗体及药学上可接受的赋形剂或载体。
10.权利要求1-8任一所述抗体在制备治疗结缔组织生长因子相关疾病或障碍药物中的应用。
11.权利要求10所述的应用，其中，所述疾病或障碍选自肾脏纤维化，硬皮病，肺脏纤维化，肝脏纤维化，关节炎，肥大性结疤，动脉粥样硬化症，糖尿病型的肾病和视网膜病，高血压，肾脏障碍，与血管生成相关的障碍，皮肤纤维化障碍和心血管障碍。
12.一种能够结合编码结缔组织生长因子片段的核酸序列的反义分子，其中所述结缔组织生长因子片段包括选自下列各项的氨基酸序列(a)SEQ ID NO4中第24位至第95位残基；(b)SEQ ID NO4中第96位至第180位残基；(c)SEQ ID NO4中第24位至第180位残基；和(d)SEQ ID NO4中第1位至第180位残基。
13.权利要求12所述的反义分子，其中所述反义分子长度为大约15个到100个核苷酸。
14.一种组合物，包括有权利要求12-13任一项所述的反义分子及药学上可接受的赋形剂或载体。
15.权利要求12-13任一项所述的反义分子在制备用于治疗结缔组织生长因子相关疾病或障碍的药物中的应用。
16.权利要求15所述的应用，其中，所述疾病或障碍选自肾脏纤维化，硬皮病，肺脏纤维化，肝脏纤维化，关节炎，肥大性结疤，动脉粥样硬化症，糖尿病型的肾病和视网膜病，高血压，肾脏障碍，与血管生成相关的障碍，皮肤纤维化障碍和心血管障碍。
全文摘要
本发明涉及含有至少外显子2或外显子3并且具有诱导细胞外基质合成，尤其是胶原合成和肌成纤维细胞分化能力的CTGF片段。本发明进一步涉及使用所述CTGF片段鉴定能调制所述CTGF片段活性的组合物的方法以及所鉴定的组合物。本发明也涉及治疗与细胞外基质的过量产生相联系的CTGF－相关的障碍和疾病的方法。
文档编号A61P17/02GK1660911SQ20041010242
公开日2005年8月31日 申请日期1999年12月14日 优先权日1998年12月14日
发明者G·R·哥罗恩达思特 申请人:迈阿密大学