专利名称：酸性纤维母细胞生长因子(fgf－1)应用于护肤功效的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种组合物，包括用于制造护肤产品的酸性纤维母细胞生长因子(FGF-1)。
背景技术：
众所皆知，每个人的年龄关系着表皮细胞的复制和脱落，例如细胞周转，表皮细胞减少造成老化，这个过程通常会产生暗沉和老化的皮肤外观。除此之外，皮肤的微血管数目随着年龄增加而减少，而表皮下方的胶原骨架也会发生结构上的崩解，再就是老化和光伤害，因此弹性组织变性，这些都会造成皮肤产生皱纹和松弛的结果。
衰老在细胞层面上，指去氧核醣核酸的不适当修复，所造成细胞复制的缺损或者是不存在。另外或指失去位于细胞核及细胞质中有丝分裂的控制因子，造成包括不正常的细胞核和细胞质的物质互换、永久的关闭微血管床造成顶端的细胞脱落、最终失去细胞和胞器细胞膜的功能。
随着年龄增长所伴随而来的，时间效应的伤害包含皮肤产生皱纹和硬化。皮肤是由包括弹力蛋白和胶原蛋白的支撑物质所构成的，胶原蛋白是结缔组织中自色纤维的主要蛋白质成分，象是软骨和骨头的结缔组织，白色弹力蛋白是皮肤结缔组织中大血管的主要蛋白质，白色弹力蛋白可以使这些组织具有弹性，并维持这些组织原来的构型。胶原蛋白和弹力蛋白两者都具有纤维，这些纤维可以用亚胺键而连接在一起；一般相信哺乳类动物和人类的老化包括将亚胺键氧化成氨基化合物，造成皮肤弹性和皮肤延展性减少的特征。自由基的理论包括氧化产物产生的负面影响，引起组织老化，而使皮肤皱纹生成。
纤维母细胞生长因子家族是一个很大的生长因子家族，纤维母细胞生长因子家族与软组织生长和再生功能相关，其包含在蛋白质层面上具有不同程度相似性的数个成员，除了少数例外，这些生长因子成员似乎对于广泛的细胞皆具有促进其有丝分裂的功能，例如，生长因子会促进中胚层和神经外胚层原点的多种细胞增生，或/和促进血管增生。
生长因子家族成员的表现模式是非常不一样的，范围从非常局限表现于一些发育阶段中，到普遍表现在不同的组织和器官中。所有成员似乎都会和细胞外基质上含量很多的肝素，硫酸乙酰肝素蛋白多醣，黏多醣结合；并会在胞外基质处强力浓缩。
美国专利U.S.Pat.No.4,695,590描述一种延缓老化的方法，是给予一种化学合成物象是羟基二苯烷基的衍生物，较佳的给予方法是口服，一来是口服方便，二来是避免体内投药所可能造成的副作用，所以希望避免在体内给予化学合成物。
多种蛋白质因子是已知对于细胞生长和分化所必需，其中包括表皮细胞。很多类似此功能的蛋白质，已经从组织中萃取出来，并被鉴定出功能，象是表皮生长因子(EGF)，类胰岛素生长因子(IGF)，血小板衍生生长因子(PDGF)，纤维母细胞生长因子(FGF)，和类纤维母细胞生长因子。美国第4,959,353号专利(U.S.Pat.No.4,959,353)中描述利用表皮生长因子治疗角膜伤口，和美国第5,130,298号专利(U.S.Pat.No.5,130,298)中描述了表皮生长因子组合物，具有稳定对抗金属阳离子分解的功用，可用来治疗伤口。美国第5,104,977号专利(U.S.Pat.No.5,104,977)公开了利用转型细胞生长因子β(TGF-beta)或是转型细胞生长因子α(TGF-alpha)来治疗受伤的组织。然而，这些专利的举例说明中，蛋白质生长因子并没有用于减少未剥落或未受伤皮肤的表皮细胞老化的先例；之前的想法是认为，象生长因子这么大的蛋白质，无法穿透没有受伤或完整的皮肤到达适当的基底细胞层去增加细胞的复制，并因此减少细胞的老化。
因此找到一种简单的成分可达到护肤的效果仍是目前所需要的。
发明内容
本发明提供了一种促进纤维母细胞或是表皮细胞增生的组合物，包括有效剂量的酸性纤维母细胞生长因子。本发明同时提供了一种人类酸性纤维母细胞生长因子的多胜肽链，包括氨基酸序列列于SEQ ID NO.4或是其衍生物，SEQ ID NO.4 maegeittft altekfnlpp gnykkpklly Ssngghflrilpdgtvdgtr drsdqhiqlq lsaesvgevy ikstetgqyl amdtdgllyg sqtpneeSlf lerleenhyntyiskkhaek nwfvglkkng sSkrgprthy gqkailflpl pvssd；其中SEQ ID NO.4和其衍生物将SEQ ID NO.1的氨基酸序列第30、97和131个位置上的3个半胱氨酸取代成丝氨酸，设计称为CIIIS，具有高度抗氧化的特质。
除非在本发明中另行定义，否则所有在本发明中使用到的技术和科学专有名词，都和此专利所属技术领域的技术人员所能了解的定义相同，虽然方法和材料和那些在本发明中提到用来练习和测试本发明的相同，但是最佳的方法和材料则会在之后的文章中详细描述，为了方便起见，以下的名词定义将提供用以阐述本发明，使本发明更容易了解。
专有名词定义生长因子包括天然的和重组的蛋白质生长因子，以及具有生物活性蛋白质片段及其类似物；这些蛋白质生长因子可以减少表皮细胞和皮肤的老化现象。那些个别的蛋白质生长因子包括有表皮细胞生长因子(EGF)，纤维母细胞生长因子(FGF)，转型细胞生长因子α(TGF-alpha)，或者是已知可以减少表皮细胞和皮肤的老化现象的蛋白质片段及其类似物。
胶原蛋白是骨头、软骨和其它结缔组织的主要蛋白质成分，胶原蛋白是一种微纤维蛋白质，胶原蛋白的次单位与原胶原蛋白，包括三条多胜肽链且其氨基酸序列是(甘氨酸-X-Y)n，X指脯氨酸，Y指羟脯胺酸。
皮肤包覆着人体的薄膜，皮肤层包括表皮层和真皮层。
护肤产品用来保持人类皮肤的健康和年轻的产品，或是用来修复伤口和保持皮肤的完整性，包括化妆品和药品；护肤产品可以定义为每天使用或是当药物使用，当药物是使用于烧伤、烫伤、外伤和伤口。
减少老化的有效剂量纤维母细胞生长因子或是其含有化妆品上或药学上可接受的载体的组合物，应用于皮肤上可达到所预期的效果，例如延缓人类皮肤老化，此时生长因子或组合物的剂量。
人类皮肤的复杂结构是受到细胞激素调控来维持其柔软、平滑与弹性。然而随着年龄增加，细胞激素合成减少或是失去平衡会使皮肤干燥并失去弹性而产生皱纹。皮肤细胞间通常靠信号因子来传递信号，这些信号因子包括有碱性纤维母细胞生长因子(FGF-2 or bFGF)和角质细胞生长因子(KGF or FGF-7)，碱性纤维母细胞生长因子主要的功能包括老化组织的再生能力、合成胶原蛋白和弹力蛋白、活化纤维母细胞生长、促进表皮细胞生长和移动、合成玻尿酸和促进伤口愈合。角质细胞生长因子的主要功能包括促进细胞与细胞间隙的结合、促进细胞增生和分化、活化表皮细胞生长和伤口愈合。
另外一个皮肤老化的原因是胶原蛋白流失，胶原蛋白是动物体中非常重要的结构蛋白，占全部蛋白质的百分之三十。人类皮肤中，真皮层的胶原蛋白会受到紫外线照射所产生的自由基破坏而断裂，自由基不只会打断胶原蛋白，也会伤害产生胶原蛋白的纤维母细胞；再者，随着年龄增加，胶原蛋白的合成速率远比胶原蛋白分解的速度来的慢，造成胶原蛋白大量流失。
为了减少皮肤老化，提供胶原蛋白是非常重要且普遍的策略；然而，胶原蛋白的分子量过于巨大，无法穿透人类皮肤的表皮层，因此直接涂抹胶原蛋白于皮肤上并不能补充失去的胶原蛋白，除非胶原蛋白受过特殊处理。而从其它动物体所取得的胶原蛋白，安全性是一个必须考虑的问题，因为有很多人畜共通的疾病，例如牛海绵状的脑病变(BSE)或是猪的日本脑炎；另外，经济动物体内的抗生素和荷尔蒙残留是另一个令人忧心的考虑。
胶原蛋白依照氨基酸序列与多胜肽链的组成被区分成21种类型，不同类型的胶原蛋白会在不同的组织中形成。胶原蛋白是由纤维母细胞所产生，因此，据此发展出的一个对于供给胶原蛋白完善的策略，即是提供生长因子刺激产生胶原蛋白的纤维母细胞生长，进而产生胶原蛋白，达到补充胶原蛋白的目的。
本发明提供一个新的组合物，这个组合物是用来促进纤维母细胞或是表皮细胞增生，其中包含有效剂量的酸性纤维母细胞生长因子(FGF-1)。
酸性纤维母细胞生长因子，是一种酸性的纤维母细胞生长因子，具有促进纤维母细胞生长及进行有丝分裂的活性；酸性纤维母细胞生长因子也会刺激其它不同类型细胞的增生，并刺激细胞合成胶原蛋白和弹力蛋白。且酸性纤维母细胞生长因子具有很强的促进血管新生的能力，所以可以运用到伤口愈合方面。较佳的实施例为一种组合物，包括人类的酸性纤维母细胞生长因子，其中人类酸性纤维母细胞生长因子包括野生型人类酸性纤维母细胞生长因子、重组型人类酸性纤维母细胞生长因子、突变型人类酸性纤维母细胞生长因子和以上的衍生物；其中，野生型人类酸性纤维母细胞生长因子的氨基酸序列列于SEQ ID No.1。提供人类酸性纤维母细胞生长因子到人体为一安全性较高的考虑，提供人类酸性纤维母细胞生长因子刺激纤维母细胞的生长，更进一步可活化胶原母细胞产生胶原蛋白；较佳的实施例为人类酸性纤维母细胞生长因子刺激(1)碱性纤维母细胞生长因子信号传递路径激活，进一步促进纤维母细胞增生，(2)角质细胞生长因子信号传递路径激活，而促进角质细胞增生。
因此，本发明的组合物可以应用于制备护肤产品。在较佳的实施例中，护肤产品进一步包括胶原蛋白，具有皮肤的再生能力、刺激胶原蛋白合成、皱纹消除、减少老化、维持皮肤弹性、伤口愈合或是血管增生的能力。最佳实施例为护肤产品更进一步包含药学或是化妆品上可接受的载体，可以让护肤产品以水溶液、乳液、面膜、凝胶、乳剂、香膏、软膏药膏、液态、粉状或是其它可用于主体或内用可接受的类型，而且可以施用于象是完整皮肤、烧烫伤和伤口的组织上。
本发明所指的人类酸性纤维母细胞生长因子，利用聚丙烯酰胺胶电泳在还原的状态下分析，分析的结果是分子量大约17.3kDa，酸碱值大约为7的蛋白质。人类酸性纤维母细胞生长因子不只会刺激纤维母细胞的生长，也会刺激表皮细胞的生长。纤维母细胞和表皮细胞的增生，分别通过碱性纤维母细胞生长因子信号传递路径和角质细胞生长因子的信号传递路径所造成。纤维母细胞的增生是正相关于人体中胶原蛋白的产生，通过人类酸性纤维母细胞生长因子刺激所增生的纤维母细胞，可以有效的提供胶原蛋白，维持人类皮肤的弹性和减少皮肤的老化，进一步促进表皮细胞的增生，而加强皮肤细胞的再生能力。
酸性纤维母细胞生长因子具有另一种促进伤口愈合的能力，其为一有效的血管增生因子，可诱发新微血管形成；且酸性纤维母细胞生长因子可以增加包含平滑肌肉细胞和内皮细胞在内的中胚层细胞移动；已知酸性纤维母细胞生长因子用来治疗啮齿动物皮肤损伤，可有效缩短伤口恢复的时间。本发明中所提供的组合物，就是用来增加包含平滑肌肉细胞和内皮细胞的中胚层细胞移动，这将促进皮肤的张力强度和伤口快速产生血管，而加速伤口愈合过程。这个组合物可以用来治疗伤口、促进伤口愈合；或是治疗因为身体外伤或是外科手术程序中的伤口，例如皮肤的、血管的、软组织的或骨头的伤口；也可应用于骨头和脊椎骨折、烧伤、和软组织的损伤。这个组合物也可用来治疗因为器官外伤所造成的缺血组织部位，包括中枢神经系统组织和周边神经组织，以及心肌梗塞后的血管增生过程。
本发明另外提供缩短型人类酸性纤维母细胞生长因子，也就是缺少了序列中第二到第十五个氨基酸，这种形式的人类酸性纤维母细胞生长因子可以在人体中发现，也就是人类酸性纤维母细胞生长因子通过蛋白质分解后的产物，缩短的人类酸性纤维母细胞生长因子的氨基酸序列列于SEQID NO.2。
本发明同时提供突变型人类酸性纤维母细胞生长因子，具有高度抗氧化的特征，包含的氨基酸序列列于SEQ ID NO.3与SEQ ID NO.4。突变型的制备将野生型人类酸性纤维母细胞生长因子氨基酸序列中的半胱氨酸取代成丝氨酸。SEQ ID NO.3所呈现的氨基酸序列，是将SEQ ID NO.1氨基酸序列第131个位置上的半胱氨酸取代成丝氨酸，设计称为C131S；SEQID NO.4所呈现的是将SEQ ID NO.1氨基酸序列第30、97和131个位置上的3个半胱氨酸取代成丝氨酸，设计称为CIIIS。氨基酸取代后的突变型人类酸性纤维母细胞生长因子可以减少自由基的攻击，而增加抗氧化的能力，而且半衰期比野生型长，也就是突变型分解的速度比野生型慢。突变型更进一步包括以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4号为基础制备的衍生物，以及用上述取代原则制备出的衍生物。而包含突变型人类酸性纤维母细胞生长因子的组合物应用于护肤上，可以维持较长也较持久的纤维母细胞和表皮细胞增生能力。
因此，本发明提供一个人类酸性纤维母细胞生长因子的多胜肽链，包括SEQ ID NO.4(CIIIS)所呈现的氨基酸序列及其衍生物，将SEQ ID NO.1的氨基酸序列第30个、97个和第131个位置上的3个半胱氨酸取代成丝氨酸，具有高度抗氧化的特征。
人类酸性纤维母细胞生长因子包括野生型、重组型、突变型和衍生物通过下列方法所制备，此方法包含(a)构建带有人类酸性纤维母细胞生长因子基因的重组载体，(b)制备可以表达重组载体的宿主细胞，(c)利用肝素亲和性管柱从培养的宿主细胞中纯化人类酸性纤维母细胞生长因子。原始的人类酸性纤维母细胞生长因子基因来源于人类，此基因可为完整的基因或是部份的基因，只要可以表现酸性纤维母细胞生长因子功能即可。将人类酸性纤维母细胞生长因子基因插入到重组载体中，此载体可选自细菌、病毒、或是噬菌体的载体。再将带有人类酸性纤维母细胞生长因子基因的重组载体，转化或是转染到适当的宿主细胞内，象是细菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳类细胞。将转化或是转染的宿主细胞培养在适当的环境中，而表达出出人类酸性纤维母细胞生长因子。分离和纯化人类酸性纤维母细胞生长因子，利用象是众所周知的亲和性管柱，例如肝素亲和性管柱。
基于前面的描述，本发明所提供的包含人类酸性纤维母细胞生长因子的组合物，可以被应用于护肤产品上。此护肤产品可以应用于化妆品或是制药上，包括每日使用于肌肤美容或是伤口愈合过程。此组合物可进一步包含一成分，此成分选自化妆品可接受的载体或是制药可接受的载体。本产品型态包含有水溶液、半固体和固体；象是化妆水、乳液、面膜、凝胶、乳剂、香膏、软膏药膏、液态的、粉状的或是其它可用于主体或内用可接受的类型。
因为更年轻和更愉悦的外表，是本发明提供的方法所期望看到的结果，主要载体就是化妆品或制药可接受的载体，这里所指的就是惯用于化妆品或制药上的无毒性载体，可以使化妆品上或药品上使用时更为方便，且可维持酸性纤维母细胞生长因子直接用于皮肤表面时的稳定性与其生物有效性。例如将酸性纤维母细胞生长因子溶解于水溶液中、分散或乳化于基质中，视使用的方便性制备成水溶液的形式，或是和半固体(明胶)或固体载体混合形成胶状、粉末状、膏状、乳液、化妆水等。适当的化妆品或制药可接受的载体，是与该所属领域内技术人员所能了解的相同，包括化妆品或制药可接受的象是液体、乳霜、油、化妆水、乳液、凝胶或固体形式包括美容用晚霜、粉底霜、防晒乳霜、防晒化妆水、护手乳、粉底和粉底液、面膜等。这个组合物可以包含其它利于医疗的有效成分，尤其在伤口愈合方面，象是上皮细胞生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、或转型细胞生长因子(TGF-alpha)。另一方面来说，这个组合物可以包含惯用添加于化妆品的其它成分，象是香精、雌激素、维他命A、C、E与α烃基酮酸如焦葡萄酸、乳酸或是乙醇酸、羊毛脂、芦荟、甲基化或是丙烷基防腐剂、色素等。
适合的化妆品或制药可接受的载体包含水、凡士林、凡士林油、矿物油、植物油、动物油、有机和无机蜡，象是微晶蜡、石蜡、地蜡；天然聚合物象是苍耳烷、几丁质、纤维素、胶原蛋白、淀粉和阿拉伯胶，合成的聚合物象是以下所讨论的酒精、多元醇等。因为无毒性的主体载体特点多半是由容易和水混合的载体组成，象是这些容易和水混合的主体化妆品或制药可接受的载体组成，不只包含可以混合前述一个或多个其它适当成分，另外亦包含可以维持或是减缓释放速率的载体，包括水合物、可分散于水的或是水溶性成分，象是微脂粒、微小海绵、微粒子、微胶囊、水性药膏、水溶于油或是油溶于水的乳剂、凝胶等。
假如如预期的，一个或是多个添加成分，通常发现于主体化妆品组成中，包括其载体的种类有保湿露、保湿霜、香料、缓冲液、色素、防腐剂、维他命ACE、乳化剂、分散剂、润湿剂、香料剂、胶体剂、稳定剂、涂料、抗菌剂、防晒成分、酵素等。以上为所属领域技术人员都能选择适当的特定添加物，包括种类和数量。
图1显示重组酸性纤维母细胞生长因子的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和免疫染色的结果。(A)从100ng增加到500ng(100，250，and 500ng)浓度的蝾螈、牛和人的重组酸性纤维母细胞生长因子FGF-1，先和同体积的牛血清白蛋白混合后，进行15％聚丙烯酰胺凝胶电泳，再进行银染色法。(B)图是将和(A)一样的15％聚丙烯酰胺胶片转印到硝化纤维纸上，并用抗牛的FGF-1胜肽炼的多株抗体(1∶1000)进行免疫反应，标的蛋白质再用山葵过氧化氢酶键结的二级抗体检测。三角形标示所指是缓慢移动的蝾螈和人的重组FGF-1，箭头所指是牛重组FGF-1，蛋白质分子量标示在左边。
图2显示牛和人的重组酸性纤维母细胞生长因子FGF-1刺激Swiss/3T3纤维母细胞进行有丝分裂反应。当Swiss/3T3纤维母细胞生长在24个孔洞生长盘到达八分满后，然后血清饥饿24个小时，也就是不给予血清；将牛的(实心圆圈)和人的(空心圆圈)重组FGF-1按照指示的浓度直接加入血清饥饿后的细胞中，然后细胞继续培养20个小时，之后加入1μCi[3H]同位素标定的胸腺嘧啶核苷，作用6个小时后检测细胞的放射性，所得到的值是两组重复样本的平均cpm值(±SE)。
图3显示酸性纤维母细胞生长因子FGF-1媒介抑制表现蝾螈和人的角质细胞生长因子接受器KGFR的MM14骨胳肌肌肉细胞分化；然而纤维母细胞生长因子FGF-2对于KGFR并无反应。经过转染的细胞培养于没有外加生长因子(实心柱状图)、外加FGF-1(空心柱状图)、外加FGF-2(点状柱状图)或外加FGF-7(斜条纹柱状图)，每一组所得到的值是以没有外加生长因子的转染细胞当1.0。
图4显示用氯化铜处理人和牛的、野生型和突变型的酸性纤维母细胞生长因子FGF-1。人的野生型(第1、2和9行)、人突变型C131S(第3、4和10行)、牛野生型(第5、6和11行)和牛突变型S131C(第7、8和12行)；在没有氯化铜处理下(第1、3、5和7行)或是氯化铜存在下(第2、4、6和8到12行)。反应在没有双硫苏醣醇(DTT)(第1到8行)或有双硫苏醣醇(第9到12行)进行，将反应产物利用未还原的百分之十五的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析并转印到硝化纤维纸上，再用抗FGF-1抗体进行免疫反应，标的蛋白质再用ECL化学发光试剂检测，蛋白质分子量指示为kDa。
具体实施例方式
以下实施例提供用于解释本发明而非限制本发明。
实施例一(A)构建野生型酸性纤维母细胞生长因子表达载体人类和牛的酸性纤维母细胞生长因子基因编码，是利用具有限制酶切位点的寡聚核苷酸引物，在已存在的互补脱氧核醣核酸克隆上通过聚合酶连锁反应而扩增；这些限制酶切位点便于将基因插入原核生物的表达载体pET20b(+)(Novagen)中，克隆、表达和纯化蝾螈的酸性纤维母细胞生长因子已经在先前被描述过(Partie et al.Growth factor(1997)1439-57)。人类的酸性纤维母细胞生长因子DNA互补链(Chiu et al.Oncogene(1990)5755-762)利用正向引物BEF1(5-TGA AGC CAT ATG GCT GAA GGGGA-3)和反向引物HBGF605(5-AGA TCT CTT TAA TCA GAA GAGACT-3)进行扩增；而牛的酸性纤维母细胞生长因子的DNA互补链(Halleyet al.Nucleic Acid Res.(1988)1610913)，利用正向引物BEF1(5-TGAAGC CAT ATG GCT GAA GGG GA-3)和反向引物BER3(5-CAA CAGATC TCT TTA ATC AGA GGA GAC-3)扩增。聚合酶连锁反应的条件为pH 8.5的10mM Tris-HCl、50mM氯化钾、1.5mM氯化镁、0.01％Tween20、0.01％Triton X-100、0.25mM脱氧核苷三磷酸、引物10pmol和2单位的Taq聚合酶；反应起始于变性温度95℃2分钟，接着是30个循环的反应，在95℃下变性1分钟，引物在42℃下退火1分钟(人类的纤维母细胞生长因子是用50℃)，然后是延长产物于72℃下1分钟，和最后72℃7分钟的延长时间。
结果从牛酸性纤维母细胞生长因子的DNA互补链扩增得到489个碱基的产物，利用洋菜凝胶纯化，再用限制酶NdeI和BglII切割，并且插入先用限制酶NdeI和BamHI切割的表达载体pET20b(+)中，进而产生表达牛纤维母细胞生长因子的载体，称为pETbovFGF-1。另外，利用人酸性纤维母细胞生长因子的DNA互补链当模板，扩增得到485个碱基的产物，再由洋菜凝胶中纯化出，首先插入用限制酶SmaI切割后的pBluescript载体中，得到的重组载体再用限制酶NdeI和BglII切割，插入先用限制酶NdeI和BamHI切割的表达载体pET20b(+)中，进而产生表现人类纤维母细胞生长因子的载体，称为pEThumFGF-1。
(B)构建突变型纤维母细胞生长因子1表达载体在酸性纤维母细胞生长因子氨基酸序列第139个氨基酸位置，从络氨酸突变成苯氨基丙酸(人类Y139F)；而在牛和蝾螈的同源氨基酸序列上，则是由苯氨基丙酸突变成络氨酸(牛F139Y and蝾螈F139Y)，利用clontech公司所提供的定点突变技术(Clontech)针对之前所描述的人类牛和蝾螈的酸纤维母细胞生长因子表达载体进行突变的步骤(Myers et al.JBiol Chem(1995)2708257-8266)，用在这些载体的正向选择引物是用5’-GCA GCC ACT AGT AAC AGG ATT-3’，将pET20b(+)载体上的AlwnI限制酶切割位置改变成SpeI；用来突变人类、牛和蝾螈酸性纤维母细胞生长因子的反向突变引物，分别是用5’-CTT TCT GGC CAA AGT GAGTCC-3、5-CTT TCT GGC CGT AGT GAGTCC-3’、5’-CTT TTT GGC CATAGT GGG TCC-3’。
选择引物同时也用在将人类酸性纤维母细胞生长因子第131个位置上的半胱氨酸改变成丝氨酸(人类C131S)，和将牛酸性纤维母细胞生长因子第131个位置上丝氨酸改变成半胱氨酸(牛S131C)的突变反应中，突变用引物用于人类C131S和牛S131C，其序列分别是5’-GGA CCG CGT TTGGAG CTC CCA TTC-3’，和5’-GGA CCG AGT TTA CAC CTT CCGTTC-3’，突变后载体则用限制酶切割结果分析确定，或是直接定出载体的去氧核醣核酸序列决定其正确性。
野生型人类酸性纤维母细胞生长因子的氨基酸序列列于SEQ IDNO.1，然而SEQ ID NO.2的人类酸性纤维母细胞生长因子也会在人体中发现，那就是缩短型的野生型人类酸性纤维母细胞生长因子，是人类酸性纤维母细胞生长因子通过蛋白酶分解而来的产物，其第二到十五个的氨基酸被删除；SEQ ID NO.3所指的就是将SEQ ID NO.1中131个位置的半胱氨酸取代成丝氨酸，设计称为C131S；SEQ ID NO.4所呈现的是将SEQ IDNO.1氨基酸序列第30、97和131位置上的3个半胱氨酸取代成丝氨酸，设计称为CIIIS。
实施例二纯化酸性纤维母细胞生长因子蛋白质酸性纤维母细胞生长因子的表达载体，用来转化细菌的表达宿主BL21(DE3)pLysS中，然后根据之前所叙述(Partie et al.Growth factor(1997)1439-57)诱发蛋白的表达并将其纯化出，除此之外取自于肝素亲和性管柱不同时间点所分离出不同管的15μl萃取样本，进行15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色法，测定出蛋白的含量和纯度。蝾螈的野生型酸性纤维母细胞生长因子的前面29个氨基酸序列，利用蛋白质测序机器ProteinSequencer 475A(PE Applied Biosystems，Foster City，CA)决定，已经测出的N端氨基酸序列，如预期的是由甲硫氨酸开始，而后在蛋白质形成时被切割；同时使用基质辅助激光解吸附质谱仪(MALDI)来决定所纯化出重组蛋白质的分子量，LASERMAT 2000质谱仪质量分析机器(Finnigan MAT，SanJose，CA)也用来作以上分子量的分析。事先估计的分子量、观察到的分子量和百分比误差的结果陈列于下人类野生型酸性纤维母细胞生长因子(17 330.0；17 331.3；+0.008％)、人类突变型酸性纤维母细胞生长因子C131S(17 314.0；17 311.2；-0.016％)和蝾螈突变型酸性纤维母细胞生长因子F139Y(17 414.8；17 410.3；-0.026％)。两种蛋白质序列分析和分子量利用质谱仪来决定，并可以帮助证实每一个重组蛋白的相同性。天然的牛的酸性纤维母细胞生长因子(R&D Systems，Minneapolis，MN)，以具有140个氨基酸的形式存在，也就是带有牛的酸性纤维母细胞生长因子中第16到155个位置的氨基酸(amino acids 16-155)。图1结果显示纯化的酸性纤维母细胞生长因子纯度有98％。
实施例三细胞有丝分裂试验
Swiss/3T3细胞培养于加有10％牛血清和抗生素盘林西林和链霉素(penicillin/streptomycin)的Dulbecco’s-modified Eagle’s(DMEM)培养液中，将两万个细胞分别分装到24个孔的培养盘中，当细胞达到八分满时，用一倍的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗一次后，加入低血清含量的培养液中(DMEM，0.5％calf serum，penicillin/streptomycin)培养24小时后，细胞用重组的人类或是牛纤维母细胞生长因子在有肝素(10μg/mL)的存在下刺激20小时，然后加入1μCi的[3H]同位素标定的胸腺嘧啶(NEN)，再培养六个小时；牛血清是10％的浓度当成阳性控制组，标志好的细胞利用一毫升的一倍的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗二次，再用5％的冷三氯醋酸清洗二次，最后用一毫升的一倍的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗二次，然后溶解细胞于0.8毫升的0.25氢氧化钠中，取出0.1毫升用贝克曼仪器(Beckman scintillation counter)测量其细胞所含放射量。
人类酸性纤维母细胞生长因子具有引起Swiss/3T3老鼠纤维母细胞进行有丝分裂的能力，并且和用于这些研究中的重组牛酸性纤维母细胞生长因子作比较，结果显示于图3。最适当的人类酸性纤维母细胞生长因子，可以引起Swiss/3T3老鼠纤维母细胞进行有丝分裂的浓度是每毫升10ng。
实施例四酸性纤维母细胞生长因子媒介纤维母细胞生长因子2和角质细胞生长因子信号传递路径表达有蝾螈和人的角质细胞生长因子接受器(KGFR)的MM14骨胳肌肉细胞的增生，会受到酸性纤维母细胞生长因子的抑制，然而碱性纤维母细胞细胞生长因子FGF-2却无法和角质细胞生长因子接受器产生反应。角质细胞生长因子KGF(也称之为FGF-7)可以抑制表达有蝾螈和人的KGFR的MM14骨胳肌肉细胞的增生。带有α心肌肌动蛋白/萤光素的报告质粒(α-cardiac actin/luciferase reporter plasmid)，及带有巨噬细胞病毒/β半乳糖酵素活性基因的质粒(CMV-LacZ plasmid)，和pBJ5表达载体转染到MM14肌原细胞中，而pBJ5表达载体中带有蝾螈的角质细胞生长因子接受器的载体是pNKGFR，或是带有人角质细胞生长因子接受器的载体是pHKGFR，将这些载体转染后的细胞，培养于具有外加生长因子(酸性纤维母细胞生长因子，碱性纤维母细胞生长因子或是角质细胞生长因子)，或是没有外加生长因子的培养液中，然后收集细胞进行萤光素试验和β半乳糖酵素活性试验。萤光素报告活性结果显示α心肌肌动蛋白/萤光素活性，是除了测量巨噬细胞病毒/β半乳糖酵素活性外，可以从收集的细胞萃取物测量到的另一个报告活性。
将每一组转染细胞培养于没有外加生长因子状态下所得到的数值当1.0，转染细胞中带有蝾螈的角质细胞生长因子接受器载体pNKGFR，或是和带有人角质细胞生长因子接受器载体pHKGFR，但在没有生长因子的培养条件下所得到的详细数据，相对于pBJ5载体本身，分别是72％和62％，这个结果显示增生中的MM14细胞会表达角质细胞生长因子，MM14细胞所表达的角质细胞生长因子足够活化转染的角质细胞生长因子接受器，而且会部分抑制报告载体的活化。结果显示于图3，是取自于三次个别不同实验的结果。
结果显示酸性纤维母细胞生长因子会活化角质细胞生长因子接受器和碱性纤维母细胞生长因子接受器；然而碱性纤维母细胞生长因子并不能活化角质细胞生长因子接受器，且角质细胞生长因子也不能活化碱性纤维母细胞生长因子接受器。所以，酸性纤维母细胞生长因子具有同时活化纤维母细胞生长因子和角质细胞生长因子信息传导路径的活性效果。
实施例五氯化铜处理的野生型和突变型纤维母细胞生长因子二毫克的酸性纤维母细胞生长因子，与酸碱值7.4的Tris-HCl(达到最终浓度20mM)，及最终浓度10mM的氯化铜混合于总体积20μl中，于室温下作用三十分钟，反应于加入二倍的SDS无还原样本缓冲液(包括10mM EDTA)而终止，并且直接加入百分之十五的聚丙烯酰胺凝胶中，不用煮沸，凝胶电泳后，执行之前描述的西方墨点法，让纤维母细胞生长因子蛋白质可于硝化纤维纸上所见。在一些实验中，氯化铜处理的蛋白质中，加入蛋白质还原剂双硫苏醣醇到最终浓度100mM，并且于加入15％的聚丙烯酰胺凝胶前煮沸，再执行西方墨点法。
结果显示于图4，野生型人类和牛的酸性纤维母细胞生长因子，和人类突变型C131S、牛突变型S131C酸性纤维母细胞生长因子，会形成二聚物的能力，可以用氯化铜处理蛋白质的方法来试验。因为之前研究显示，氯化铜会诱发人类酸性纤维母细胞生长因子会形成二聚物(Engleka et al.JBiol Chem(1992)26711307-11315)，如预期的，野生型人类酸性纤维母细胞生长因子在没有氯化铜存在下，在凝胶上移动到单体的分子量位置上；但是氯化铜存在时，在凝胶上会转移到二聚物的分子量位置上(如图4第1行和第2行)；有趣的是人类突变型C131S，在氯化铜处理下，会形成很少的二聚物(如第3行和第4行)，此种结果支持第131个氨基酸的位置是人类纤维母细胞生长因子在氯化铜处理下，会形成很多二聚物的氨基酸位置；反过来说，这些结果也证明两个固有的半胱氨酸位置，半胱氨酸30和半胱氨酸97，在形成二聚物并没有有意义的贡献；和这个观察现象一致的是，不管野生型和突变型S131C牛酸性纤维母细胞生长因子，具有额外的半胱氨酸在第61个位置上，形成二聚物的程度和野生型人类酸性纤维母细胞生长因子相似(第5行到第8行)。接下来利用蛋白质还原剂双硫苏醣醇，还原氯化铜处理的酸性纤维母细胞生长因子蛋白质，结果显示二聚物的过程是一种可逆反应(第9行到第12行)。
序列表<100>综合信息<160>序列表中序列的个数4<200>序列特征<210>序列标识符1<211>序列的长度155<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人类<220>
<223>其它信息酸性纤维母细胞生长因子野生型<400>11 maegeittft altekfnlpp gnykkpklly csngghflri lpdgtvdgtr drsdqhiqlq61 lsaesvgevy ikstetgqyl amdtdgllyg sqtpneeclf lerleenhyn tyiskkhaek121 nwfvglkkng sckrgprthy gqkailflpl pvssd<210>序列标识符2<211>序列的长度141<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人类<220>
<223>其它信息酸性纤维母细胞生长因子缩短型<400>21 mfnlppgnyk kpkllycsng ghflrilpdg tvdgtrdrsd qhiqlqlsae svgevyikst61 etgqylamdt dgllygsqtp neeclflerl eenhyntyis kkhaeknwfv lkkngsckr
121 gprthygqka ilflplpvss d<210>序列标识符3<211>序列的长度155<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人类<220>
<223>其它信息酸性纤维母细胞生长因子C131S当半胱氨酸在第131个位置时，我们使用的编号系统，为野生型酸性维母细胞生长因子蛋白质的第二个氨基酸，即丝氨酸，在第一个位置。使用这种编号系统是因为在蛋白质合成后，起始氨基酸甲硫氨酸通常会被删除。因此，在人类细胞中的原蛋白质通常不具有第一个甲硫氨酸，且长度为154个氨基酸。当呈现为全长155个氨基酸的蛋白质时，半胱氨酸131实际上在第132个位置。
<400>31 maegeittft altekfnlpp gnykkpklly csngghflri lpdgtvdgtr drsdqhiqlq61 lsaesvgevy ikstetgqyl amdtdgllyg sqtpneeclf lerleenhyn tyiskkhaek121 nwfvglkkng sSkrgprthy gqkailflpl pvssd<210>序列标识符4<211>序列的长度155<212>序列的类型蛋白质<213>生物体人类<220>
<223>其它信息酸性纤维母细胞生长因子CIIIS当半胱氨酸在第30、97和131个位置时，我们使用的编号系统，为野生型酸性维母细胞生长因子蛋白质的第二个氨基酸，即丝氨酸，在第一个位置。使用这种编号系统是因为在蛋白质合成后，起始氨基酸甲硫氨酸通常会被删除。因此，在人类细胞中的原蛋白质通常不具有第一个甲硫氨酸，且长度为154个氨基酸。当呈现为全长155个氨基酸的蛋白质时，半胱氨酸30、97和131实际上分别在第31、98和132个位置。
<400>41 maegeittft altekfnlpp gnykkpklly Ssngghflri lpdgtvdgtr drsdqhiqlq61 lsaesvgevy ikstetgqyl amdtdgllyg sqtpneeSlf lerleenhyn tyiskkhaek121 nwfvglkkng sSkrgprthy gqkailflpl pvssd
权利要求
1.一种促进纤维母细胞或是表皮细胞增生的组合物，其特征是包括有效剂量的酸性纤维母细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征是该酸性纤维母细胞生长因子为人类酸性纤维母细胞生长因子。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征是该人类酸性纤维母细胞生长因子选自于野生型人类酸性纤维母细胞生长因子、重组型人类酸性纤维母细胞生长因子、突变型人类酸性纤维母细胞生长因子和上述细胞生长因子的衍生物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征是该野生型人类酸性纤维母细胞生长因子的氨基酸序列列于SEQ ID NO.1。
5.根据权利要求3所述的组合物，其特征是该人类酸性纤维母细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所列，此氨基酸序列是缩短型的人类酸性纤维母细胞生长因子缺少SEQ ID NO.1的第2到15个的氨基酸。
6.根据权利要求3所述的组合物，其特征是该人类酸性纤维母细胞生长因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所列，为突变型人类酸性纤维母细胞生长因子，为SEQ ID NO.1中的第131个半胱氨酸被丝氨酸取代，设计称为C131S。
7.根据权利要求2所述的组合物，其特征是该人类酸性纤维母细胞生长因子为分子量17.3kDa的蛋白质，利用聚丙烯酰胺胶电泳，在还原的状态下分析所得。
8.根据权利要求1所述的组合物，其特征是该酸性纤维母细胞生长因子具有促进纤维母细胞进行有丝分裂的活性。
9.根据权利要求1所述的组合物，其特征是该酸性纤维母细胞生长因子可刺激碱性纤维母细胞生长因子信号传递路径，而促进纤维母细胞的增生。
10.根据权利要求1所述的组合物，其特征是该酸性纤维母细胞生长因子可刺激角质细胞生长因子信号传递路径，而促进表皮细胞的增生。
11.根据权利要求1所述的组合物，其特征是可应用于护肤产品。
12.根据权利要求11所述的组合物，其特征是所指护肤产品包括胶原蛋白。
13.根据权利要求11所述的组合物，其特征是该护肤产品具有皮肤再生能力、刺激胶原蛋白合成、消除皱纹、减少老化、维持皮肤弹性、伤口愈合或血管化增加。
14.根据权利要求11所述的组合物，其特征是该护肤产品进一步包括化妆品或是制药可接受的载体。
15.根据权利要求11所述的组合物，其特征是所述产品类型包括水溶液、乳液、面膜、凝胶、乳剂、香膏、软膏药膏、液态的、粉状的或是其它可用于主体或内用可接受的类型。
16.根据权利要求13所述的组合物，其特征是该产品可用于完整的皮肤，烧烫伤和伤口上。
17.根据权利要求1所述的组合物，其特征是人类酸性纤维母细胞生长因子由以下方法所制备(a)构建带有人类酸性纤维母细胞生长因子基因的重组载体，(b)制备表达重组载体的宿主细胞，(c)从培养的宿主细胞中纯化人类酸性纤维母细胞生长因子。
18.根据权利要求17所述的组合物，其特征是该重组载体选择自细菌、病毒或是噬菌体载体。
19.根据权利要求17所述的组合物，其特征是适当的宿主细胞选自细菌、酵母菌、昆虫细胞或哺乳类细胞。
20.一种人类酸性纤维母细胞生长因子的多胜肽链，其特征是包括氨基酸序列列于SEQ ID NO.4或是其衍生物。SEQ ID NO.4maegeittft altekfnlpp gnykkpklly Ssngghflri lpdgtvdgtr drsdqhiqlqlsaesvgevy ikstetgqyl amdtdgllyg sqtpneeSlf lerleenhyn tyiskkhaeknwfvglkkng sSkrgprthy gqkailflpl pvssd其中SEQ ID NO.4和其衍生物将SEQ ID NO.1的氨基酸序列第30、97和131个位置上的3个半胱氨酸取代成丝氨酸，设计称为CIIIS，具有高度抗氧化的特质。
21.根据权利要求20所述的多胜肽链，其特征是比权利要求4所述的野生型人类酸性纤维母细胞生长因子具有更长的半衰期。
全文摘要
本发明组合物，包括人类酸性纤维母细胞生长因子，应用于护肤，人类酸性纤维母细胞生长因子，构建入重组表达载体中，用分子特征来定性，人类酸性纤维母细胞生长因子，具有活化碱性纤维母细胞生长因子和角质细胞生长因子信号传递路径，并引发纤维母细胞和表皮细胞增生的活性与进行有丝分裂。突变型人类酸性纤维母细胞生长因子比野生型人类酸性纤维母细胞生长因子具有较长半衰期，和较强的抗氧化能力，且较不容易被分解。
文档编号A61Q19/00GK1853609SQ20051006623
公开日2006年11月1日 申请日期2005年4月25日 优先权日2005年4月25日
发明者邱英明, 温东光 申请人:邱英明