酪蛋白水解物及其生产过程与应用的制作方法

专利名称：酪蛋白水解物及其生产过程与应用的制作方法
背景技术：
本发明涉及通过水解动物乳酪蛋白所获得的、具有包括血管紧张素转化酶抑制活性及降血压作用在内的多种功能的、并用于多种食品与药物中的酪蛋白水解物，以及制备该酪蛋白水解物的方法与其用途。
背景技术：
已报道很肽具有多种功能，譬如降血压作用、抗菌活性、钙增溶效应及免疫调节作用，并且这些肽已用于食品与药物中。
例如，降压肽已在企划中，其中很多具有血管紧张素转化酶(本文后文中缩写为ACE)抑制活性。ACE将一个前体——血管紧张素I，转化为在活体内具有血管收缩活性的血管紧张素II，使血压上升。因此具有ACE抑制活性的肽就可以通过抑制ACE来抑制活体内血管紧张素II的产量，从而表现出降血压作用。在降压肽的发展过程中，研究通常一开始就直接针对具有ACE抑制活性的肽，因此企划中的肽的降血压作用主要通过使用ACE抑制效应作为参考指标。已经提出了许多使用ACE抑制活性作为参考指标来进行评估的具有降血压作用的药剂，正用于高血压的预防与治疗。
在功能肽，譬如使用ACE抑制效果来评估其降血压作用的肽的生产中，特别是在通过使用酶分解食物蛋白而进行的功能肽的生产中，在酶分解之后一般需要进行诸如浓缩、纯化以及对分解产物进行分离等复杂步骤，以提高功效的表现度。
相对于通过消化道吸收进入血液从而在活体内表现其功能的肽，推测在体内非分解性的肽由于具有高度可吸收性并对活体内的多种分解酶具有抗性而更有优势。然而，在细节上仍不清楚存在哪种肽时体内分解抗性增强。因此，期望开发食品或药物的酶分解产品以及生产这种产品的方法，该产品在体内具有高度的分解抗性，并能在勿需诸如浓缩、纯化或者在酶分解后进行分离等复杂程序下有效表现其预期功能。
例如，专利文献1公布了一种以大豆蛋白为原料用来生产低分子量肽混合物的方法，它主要由二肽和三肽组成，平均链长不超过3，具有优异的肠道吸收性，肽混合物通过2种或更多种具有蛋白内切酶活性并且基本上不具蛋白外切酶活性的酶的同时或者顺序作用，其中所生成的游离氨基酸不高于5％。专利文献2公布了使用大豆蛋白分解产物的功能性食品及其生产方法，该分解产物通过使用诸如来源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的蛋白酶等酶来分解热变性的大豆蛋白进行制备含有作为活性成分的由Ala Tyr、Gly Tyr Tyr、Ala Asp Phe与Ser AspPhe所组成的二肽及三肽。优选地，分解产物的平均肽链长为2至4，含有20至30重量％的游离氨基酸。
然而，这些大豆蛋白酶分解产物的组分同动物乳酪蛋白酶分解产物的组分非常不同。因此上述专利文献，对于以动物乳酪蛋白为起始材料，勿需使用诸如浓缩、纯化及分离等复杂程序即可制备出具有高浓度活性成分并在活体内具有优秀可吸收性的酪蛋白分解产物及酪蛋白水解物的方法而言，没有什么启示。
在另一方面，专利文献3和4提及了通过使用诸如蛋白酶及肽酶分解动物乳酪蛋白来制备具有多种功能的肽的方法，以及利用这些方法获得的具有特殊功能的肽。
不过，在这些发布中所公布的酶分解产物是用来获取作为活性成分的特殊肽的。因此，在这些发布中，对于平均链长在2.1或以下的动物乳酪蛋白的水解物、该水解物的特定加工程序、以及具有特殊平均链长的酪蛋白水解物的效力，没有什么指导。
专利文献1JP-5-252979-A专利文献2JP-2003-210138-A专利文献3JP-6-128287-A专利文献4JP-2001-136995-A发明概述本发明的目的是提供一种含有在体内具有最低酶分解性的、在体内非分解性的肽与游离氨基酸的酪蛋白水解物，并能够在活体内表现出诸如降血压作用等功能。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述酪蛋白水解物的方法，该方法勿需复杂程序便可以轻易有效地生产上述酪蛋白水解物。
本发明还有一个目的是提供一种具有ACE抑制活性或者降血压作用的试剂，它含有在体内非分解性的肽与游离氨基酸，在活体内具有优异的降血压作用，并用于多功能食品或药物。
本发明人为了实现上述目的进行了锐意研究发现通过水解动物乳酪蛋白使其平均链长2.1或以下个氨基酸残基数，可以获得含有游离氨基酸与诸如三肽及二肽这样的低分子量肽的酪蛋白水解物，其中有效形成了游离氨基酸与羟基端具有Pro残基的体内非分解性的肽分子。
本发明人还发现羟基端具有Pro残基的体内非分解性的肽分子对体内的肽酶具有很高的分解抗性，因此很可能这类非分解性肽可在活体内充分表现其功能，并且酪蛋白水解物含有高含量的诸如二肽和三肽这样的在体内具有良好吸收性的肽，因此酪蛋白水解物能够在活体内充分表现多种功能，从而完成了本发明。
而且，本发明人从多种已知酶中对可有效产生本发明中酪蛋白水解物的酶进行了研究，发现一类特别的酶能够非常有效地生成本发明中的酪蛋白水解物。
根据本发明，提供了一种通过水解动物乳酪蛋白所获得的、由游离氨基酸与平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的肽所组成的酪蛋白水解物。更具体地，本发明所提供的上述酪蛋白水解物，其中肽含有由具有Xaa Pro序列的二肽及具有Xaa Pro Pro序列的三肽所组成的体内非分解性的肽，其中具有Xaa Pro序列的二肽其含量水解物中肽与游离氨基酸总量的5重量％或以上，具有Xaa Pro Pro序列的三肽其含量水解物中肽与游离氨基酸总量的1重量％或以上。且Xaa可以是任意氨基酸。
根据本发明，还提供了一种制备上述酪蛋白水解物的方法，它包括用一组能够将动物乳酪蛋白分解成平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的酪蛋白水解物的酶水解动物乳酪蛋白，使其平均链长在2.1或以下的步骤(A)。
根据本发明，还提供了一种具有ACE抑制活性或者降血压作用的试剂，它含有作为活性成分的上述酪蛋白水解物。
根据本发明，进一步提供了上述酪蛋白水解物在具有ACE抑制活性或者降血压作用的功能性食品或药物的生产中的用途。
本发明中的酪蛋白水解物通过水解动物乳酪蛋白使其平均链长2.1或以下个氨基酸残基数来获得，含有游离氨基酸与诸如体内非分解性的肽这样的低分子量肽。因此所述酪蛋白水解物通过口服施用，可在活体内表现出优异的体内可吸收性及多种功能，并可用于多种功能性食品、药物及食品添加剂。例如，此酪蛋白水解物可期望用在以本水解物作为活性成分的具有ACE抑制活性或者降血压作用的试剂中。
本方法包括使用一组能够将动物乳酪蛋白分解成平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的酪蛋白水解物的酶来水解动物乳酪蛋白使其平均链长在2.1或以下的步骤(A)。这样，本方法可以轻易有效地生产本发明中的酪蛋白水解物。因此，本方法在本发明中酪蛋白水解物的工业生产中具有优势。
附图的简要描述

图1所示的是实施例1中所进行的Xaa Pro及Xaa Pro Pro体内吸收性与分解抗性的评估结果。
图2所示的是测定实施例1中依赖于所制备的酪蛋白水解物粉末的剂量的降血压作用的实验结果。
图3所示的是分析实施例1中在0至0.6M NaCl线性梯度下的结合蛋白洗脱模式与蛋白水解活性之间的关系。
图4所示的实施例3中所用酶组对酪蛋白的分解时间与所获得的酪蛋白水解物的ACE抑制活性之间的关系。
图5所示的是实施例3中平均链长与使用酶组水解酪蛋白所获得的酪蛋白水解物的ACE抑制活性之间的关系。
发明的优选实施例以下对本发明进行详细说明。
本发明的酪蛋白水解物含有通过水解动物乳酪蛋白使其平均链长的氨基酸残基数目在特定范围内而获得的游离氨基酸与肽，优选地，游离氨基酸与肽的量不少于酪蛋白水解物总量的80重量％，更优选地为80至90重量％。特别优选地，水解物中的肽为特定含量的含有具有Xaa Pro序列的二肽及具有Xaa Pro Pro序列的三肽的体内非分解性的肽。所述肽可以是肽盐。
在本文用法中，平均链长可以表示为通过水解动物乳酪蛋白所生成的肽与游离氨基酸的总摩尔数，与相同重量的酪蛋白酸水解物中所有氨基酸的摩尔数的比值。此处，酪蛋白酸水解物通过将酪蛋白分解为氨基酸来获得。
平均链长可通过例如，利用使用同氨基基团发生显色反应的OPA(邻苯二醛)试剂的OPA方法来评估水解物中的摩尔浓度来进行确定，即平均链长＝(酪蛋白酸水解物中的摩尔数)/(酪蛋白酶水解物中的数目)。
在本文用法中，体内非分解性的肽指在羧基端具有Pro的二肽XaaPro与三肽Xaa Pro Pro，当它们在活体内被肠道吸收时，对体内肽酶具有很高的分解抗性。
根据本发明，水解动物乳酪蛋白获得的水解物的平均链长在2.1或以下个氨基酸残基，优选地为1.1至2.1，更优选地为1.3至2.1。平均链长若长于2.1，所期望的二肽和三肽以及游离氨基酸的含量便会降低，这样所期望的体内吸收及体内非分解性的肽含量也降低。
本发明酪蛋白水解物中具有Xaa Pro序列的二肽含量通常水解物中肽与游离氨基酸总量的5重量％或以上，优选地为5至25重量％。低于5重量％时，所期望的体内可吸收性便会降低，功能表现不足。
本发明酪蛋白水解物中具有Xaa Pro Pro序列的三肽含量通常水解物中肽与游离氨基酸总量的1重量％或以上，优选地为1至5重量％。低于1重量％时，所期望的体内可吸收性便会降低，功能表现不足。
在本发明的酪蛋白水解物中，具有Xaa Pro序列的二肽及具有XaaPro Pro序列的三肽中的Xaa可以为任意氨基酸。
优选地，本发明的酪蛋白水解物可含有Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro和Tyr Pro作为具有Xaa Pro序列的二肽，含有SerPro Pro、Ile Pro Pro和Val Pro Pro作为具有Xaa Pro Pro序列的三肽。
当本发明的酪蛋白水解物含有这类二肽和三肽时，可特别有效地表现出ACE抑制活性与降血压作用。
本发明的酪蛋白水解物除肽外还含有游离氨基酸。游离氨基酸的含量通常为水解物中肽与游离氨基酸总量的35至50重量％，优选地为40至45重量％。
本发明的酪蛋白水解物除肽与游离氨基酸外还可随意含有例如，脂肪、灰质、碳水化合物、食物纤维及水分，这些通常包含在商品化的动物乳酪蛋白中的物质，其含量为10至20重量％。部分或者全部这类成分如果需要可以除去。
本发明的酪蛋白水解物可通过例如，包括使用一组能够将动物乳酪蛋白分解成平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的酪蛋白水解物的酶来水解动物乳酪蛋白使其平均链长在2.1或以下的步骤(A)在内的本发明的方法来制备。
动物乳酪蛋白是一种具有高Pro含量的蛋白，并确认其可安全用于食品及其它类似领域，可以是，例如，来源于牛奶、马奶、山羊奶和绵羊奶的酪蛋白，其中牛奶酪蛋白是特别优选的。
水解的动物乳酪蛋白中酪蛋白的浓度没有特别限定，优选地为本发明水解物有效产量的3至19重量％。
本发明方法中所用的酶组可以是任意一组酶，其中适合选取并联合使用的是能够将动物乳酪蛋白分解成平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的酶。例如，可以使用含有能够剪切Xaa Pro Xaa或Xaa Pro ProXaa羧基端肽键的肽酶的酶组(X)。
优选地，酶组(X)在活性中心含有具有丝氨酸的丝氨酸蛋白酶，或者在活性中心含有具有金属的金属蛋白酶。金属蛋白酶可以是中性蛋白酶I、中性蛋白酶II或者亮氨酸氨肽酶。通过使用至少一种这些金属蛋白酶，可在短时间内有效获得目的水解物，即便是在一步反应中也如此，因此是优选的。优选地，能够剪切Pro Xaa肽键的肽酶是等电点在酸性区域的酶。
酶组或者酶组(X)可以是，例如，一组来源于诸如米曲霉等曲霉中的胞外酶。这样的一组胞外酶可以通过在合适培养基中培养细胞体并用水提取胞外产生的酶来获得。来源于米曲霉并且等电点在酸性区域的一组胞外酶是特别优选的。
来源于米曲霉的一组胞外酶可以是诸如SUMIZYME FP、LP或MP(均为注册商标，由新日本化学公司制造)、UMAMIZYME(注册商标，由天野酶公司制造)、Sternzyme B11024和PROHIDROXYAMPL(均为商品名，由HIGUCHI INC.制造)、ORIENTASE ONS(注册商标，由HANKYU BIOINDUSTRY CO.制造)以及DENAZYME AP(注册商标，由NAGASE SEIKAGAKU制造)等商业化产品，其中SUMIZYME FP(注册商标，由新日本化学公司制造)是特别优选的。
这些商品化的酶通常具有特殊的优化条件。这些条件，譬如所用的酶量及反应时间，可以根据所用的酶组进行适当调节以便获得本发明的酪蛋白水解物。
在水解时，酶组可以是譬如，以酶组/动物乳酪蛋白的重量比1/1000或以上添加到动物乳酪蛋白的水溶液中，优选地为1/10至1/1000，更优选地为1/10至1/100，最优选地为1/10至1/40。
根据所用酶组适当选择反应条件以便获得目的酪蛋白水解物。在25至60℃、优选地为45至55℃，pH为3至10、优选地为5至9、更优选地为5至8时，反应通常是有效的。酶反应时间通常为2至48小时，优选地为7至15小时。
酶反应可通过使酶灭活来终止。通常，在60至110℃使酶失活来终止反应。
终止酶反应后，优选地，可按需要通过离心或者多种过滤器除去所产生的沉淀。
此外，可除去所获得水解物中具有苦味或臭味的肽，使用活性炭、疏水性树脂或类似物质可有效实现这一点。例如，可将相对于酪蛋白量为1至20重量％的活性炭添加到水解物中，反应1至10小时以除去这类苦味或者臭味组分。所用的活性炭可以通过诸如离心或者膜过滤等传统方法来除去。
步骤(A)中获得的含有酪蛋白水解物的反应液可以添加到诸如饮料等液体产品中。为了提高本发明中酪蛋白水解物的多功能性，优选地，反应液可浓缩并干燥成粉末。
这种粉末可用作多种功能性食品、食品添加剂、药物及其活性组分。粉末可与多种辅助添加剂随意混合以改善营养平衡或者口味。这类辅助添加剂的实施例可以包括多种碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质、甜味剂、调味剂、色素以及质地改良剂。
含有本发明酪蛋白水解物的粉末可以通过添加到例如，饮料、酸奶、液体食品、果冻、糖果、蒸煮食品、糖块、小甜饼、松糕、面包、饼干、巧克力和其它类似食品中来使用，或者通过配制成胶囊、片剂或其它类似物来使用。
由于本发明的酪蛋白水解物可以通过上述方式来应用，因此所述水解物可有效用于诸如多种运动饮料、普通饮料、普通食品、膳食补充剂、营养功能食品等对健康有益的功能性食品的生产中，或者用于药物的生产中。
在后面将要讨论的实施例中已确认本发明的酪蛋白水解物具有ACE抑制活性与降血压作用，因此所述的水解物可用作，例如，在具有这类活性及效应的功能性食品生产中的试剂，或者用作药片生产中的试剂。
当本发明中的酪蛋白水解物用作具有ACE抑制活性及降血压作用的试剂时，为了能够分解，对人口服施用该试剂的优选剂量通常为每个施用者的酪蛋白水解物中肽与游离氨基酸为0.1至100mg/kg，优选地为1至20mg/kg。因此当通过添加到多种饮料、食品或者药物中的方式来使用时，本发明中的酪蛋白水解物或者具有ACE抑制活性及降血压作用的试剂的量，可以根据上述剂量来进行适当选择。
根据本发明的方法，通过使用含有上述酶组(X)的一组酶在一步反应中水解动物乳酪蛋白，同传统方法相比，动物乳酪蛋白中所含的Xaa Pro Pro，尤其是Ile Pro Pro和/或Val Pro Pro，已确认具有包括降血压作用与减压效应在内的多种功能，可以以接近理论回收的高产量，譬如60％或以上，优选地，70％或以上来获得。因此，该方法不仅是制备本发明中的酪蛋白水解物的方法，还是从动物乳酪蛋白或者具有高Xaa Pro Pro含量的食品蛋白中生产含大量的目的Xaa Pro Pro或者其纯化产物的分解产品的有效方法。
实施例本发明现在将通过参考实施例、分析实施例及比较实施例对本发明进行更详细的阐述，这些实施例仅起解说作用并不意味着限定本发明。
实施例1与比较实施例1至81g来源于牛奶的酪蛋白(由日本NZMP生产)在约80℃时添加到99g蒸馏水中并彻底混合。向混合物中添加1N的氢氧化钠(由WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.生产)溶液，调节pH至7.0。温度调节为20℃以制备成底物液。
对于所获得的底物液，向其中加入表1中所示的每一种酶使酶/酪蛋白的重量比为1/25。混合物于50℃反应14小时，然后于110℃高压中10分钟使酶灭活，从而获得酪蛋白酶解产物溶液。所获得的酶解产物溶液经喷雾干燥后制备成粉末。
所获得的粉末用来分析其组分。通过凯氏定氮法测定蛋白，使用氨基酸分析仪测定氨基酸。从蛋白的量中减去氨基酸的量所作为肽的量。此外，通过酸水解的方法来测定脂肪的量，通过直接燃烧来测定灰分，通过烘箱法来测定水分。从100％中减去每种组分的量，剩余的则视为碳水化合物的量。结果，测定粉末中含有35.8重量％的氨基酸、45.7重量％的肽、6.6重量％的水分、0.2重量％的脂肪、4.1重量％的灰分及7.6重量％的碳水化合物。
<平均链长的测定>
通过使用同粉末中游离氨基酸与肽的氨基基团反应的OPA试剂来测定摩尔数、类似地来测定酪蛋白酸水解物的摩尔数，通过比较二者的比值可确定在获得的粉末中所含氨基酸与肽的平均链长。结果如表1所示。
将40mg邻苯二醛(荧光分析的保证试剂，由NACALI TESQUE，INC.生产)溶解在1ml甲醇中，并加入100μl β-巯基乙醇。使用预先混有2.5ml 20％十二烷基硫酸钠的25ml 100mM四硼酸钠溶液将邻苯二醛稀释至25ml，并进一步使用蒸馏水稀释至50ml以制备OPA试剂。
用每一种酶(表1)反应所获得的每个1％酪蛋白酶水解物的粉末样品以适当的浓度溶于合适的溶剂中，并于15000rpm离心10分钟。取出50μl上清。然后加入1ml上面制备的OPA试剂，剧烈振荡，置于室温下5分钟。使用吸收光度计(商品名为Ubest-35，由JASCOCORPORATION制造)测定340nm处的吸光度。
制备1％酪蛋白酸水解物，适当稀释，使用相同方法进行测定以获得标准曲线，从中可判定吸光度与摩尔浓度之间的关系。根据下式来计算平均链长平均链长＝(1％酪蛋白酸水解物的摩尔浓度)/(各1％酪蛋白酶水解物样品的摩尔浓度)
表1
1)、3)、8)、9)由新日本化学工业公司生产；2)由HIGUCHI，INC.生产；4)由田野酶公司生产；5)由NAGASE&CO.，LTD.生产；6)由大和化成公司生产；7)由NOVOZEME日本生产<组成肽的氨基酸的测定>
实施例1中的粉末溶解在适量的蒸馏水中，使用自动肽分析仪(商品名PPSQ-10，由SHIMADZU CORPORATION制造)进行分析，以从N-末端确定粉末中的氨基酸残基。结果如表2所示。顺便提一下，自动肽分析仪不检测游离氨基酸。
第五个氨基酸残基的总量为120pmol，第六个氨基酸残基的总量为100pmol。从这些结果可以看出粉末中所含绝大多数肽为二肽和三肽。此外还发现肽第二个残基为Pro的百分比为49.5％，这是非常高的，肽第三个残基为Pro的百分比为29.8％，这也是很高的。
因此，可以预期粉末含有大量的Xaa Pro和Xaa Pro Pro，它对体内蛋白酶的酶分解具有高抗性，因此这些肽是用作功能性肽的最佳选择。
表2
<Xaa Pro和Xaa Pro Pro在活体中吸收与分解抗性的评估>
为了评估实施例1与表1中所制备的酪蛋白酶水解物粉末中所含的序列为Xaa Pro和Xaa Pro Pro的肽在活体中的吸收与分解抗性，在大鼠中按下述方法检测口服施用后进入血液中的所吸收的肽。
对于两只六周龄的SD大鼠，将作为Xaa Pro Pro例子的Val ProPro以及用作没有Pro的二肽的Gly Gly按500mg/每只动物通过口服施用。每隔一段时间从门静脉抽取血液样品，测定血液中每种肽的吸收。结果如图1所示。
通过图1，可以确认Gly Gly很容易在体内被分解，因此可检测到Gly，而Val Pro Pro相对稳定地吸收入血液。从这些结果，可以预料序列分别为Xaa Pro及Xaa Pro Pro的二肽与三肽，在活体内表现出高吸收性及分解抗性。
<降血压作用的评估>
表1中所示的实施例及比较实施例中所制备的每种酪蛋白水解物粉末以每剂32mg/kg体重对5只27周龄的自发性高血压大鼠(SHR)通过口服施用。使用Tail-cuff PB-98(由SOFTRON制造)通过尾-套法在施用前及施用5小时后测定血压，以评估血压的改变。作为对照，使用酪蛋白替代粉末进行施用，进行相同的评估。测定血压之前，在一个置于45℃8分钟的预热的盒子(由CSI日本制造)中温暖大鼠。结果如表3所示。
从表3中，发现以酪蛋白为对照时血压没有变化，而施用实施例1中的粉末时观察到降血压作用。另一方面，使用比较实施例中的任一粉末都没有观察到血压的改变。因此表明，含有特定量Xaa Pro及XaaPro Pro并且其平均链长在2.1或以下的实施例1中的酪蛋白水解物具有优异的降血压作用。
此外，依照上述方法，使用实施例1中所制备的酪蛋白水解物粉末对剂量依赖的降血压作用进行检验。结果如表4与图2所示。
<ACE抑制活性的评估>
将来源于牛肺的ACE(由WAKO PURE CHEMICALINDUSTRIES，LTD.生产)以0.1U的量溶解在pH为8.3的硼酸缓冲液中，以获得ACE溶液。将使用蒸馏水把表1中所示的每种酶水解物粉末稀释50倍所制备的80μl稀释的酶水解物溶液、200μl 5mM马尿酰组胺酰亮氨酸(由SIGMA生产)、及20μl上面所制备的ACE溶液加入试管中，于37℃反应30分钟。随后，通过添加250μl 1N的盐酸终止反应。然后加入1.7ml乙酸乙酯并振荡。取1.4ml乙酸乙酯层置于另一个试管中，并在120℃蒸发约60分钟以获得干燥产物。将干燥产物溶解在1ml蒸馏水中，测定使用乙酸乙酯所抽提的马尿酸在228nm处的吸光度。作为对照，测定了不含有稀释酶水解物溶液的溶液以及不含有稀释酶水解物溶液与ACE溶液的溶液的吸光度。通过所获得的吸光度，ACE抑制活性可以根据下面的公式进行计算。结果如表3所示。
ACE抑制活性(％)＝[(A-B)/A]×100A(不添加稀释酶水解物溶液但添加ACE溶液的溶液的吸光度)-(不添加稀释酶水解物溶液与ACE溶液的溶液的吸光度)B(添加稀释酶水解物溶液与ACE溶液的溶液的吸光度)-(添加稀释酶水解物溶液但不添加ACE溶液的溶液的吸光度)表3
表4
<酶水解物中肽的测定>
将表1所示的实施例1中的酶水解物粉末以10mg/ml的浓度溶解在蒸馏水中。另一方面，制备具有表5中序列的化学合成的每种标准肽的25μg/ml、50μg/ml和100μg/ml溶液。这些溶液在下述条件下通过LC/MS进行分析。在粉末溶液的分析中所显示的峰中，同标准肽具有相同分子量与保留时间的峰表明与标准肽具有相同的序列。粉末溶液的峰同标准肽的峰进行比较，以判断粉末溶液中如表4所示的每种肽的含量。结果如表5所示。
发现通过将粉末溶于蒸馏水所制备的溶液中，肽与游离氨基酸的量为8.15mg/ml，肽的量为4.57mg/ml，肽中Xaa Pro的量为514.5μg，因此Xaa Pro相对于粉末中肽与游离氨基酸总量的百分比为6.3％。此外，肽中Xaa Pro Pro的量为116.5μg，因此Xaa Pro Pro相对于粉末中肽与游离氨基酸总量的百分比为1.4％。
<所用仪器>
高效液相层析/质谱仪LCMS-2010；系统控制器SCL-10Advp；自动注射器SIL-10AdVp；溶剂传输泵LC-10Advp×2；柱温箱CT-10AdVp；光二极管阵列检测器SPD-M10AVP，联机除气装置DGU-14A(均为商品名，由SHIMADZU CORPORATION制造)；柱子Develosil C30-UG-3(2.0mmI.D.×150mmL)(由野村化学公司制造)<测定条件>
移动相A0.1重量％甲酸水溶液；移动相B100％乙腈溶液；时间程序1％B(0分钟)-7.5％B(30分钟)-80％B(30.01分钟)-100％B(35分钟)-0％B(35.1分钟)-停止(45分钟)；进样量5μl；柱温度50℃；检测波长200至300nm；离子化模式ESI(+)；雾化载气流速4.5L/min；应用电压+4.5kV；CDL温度250℃；加热决温度200℃；CDL电压0.0V；Q-阵列电压SCAN；分析模式SIM测定；分析范围EP(m/z＝245.2)，IP(m/z＝229.3)，MP(m/z＝247.3)，QP(m/z＝244.2)，RP(m/z＝272.3)，SPP(m/z＝300.3)，VPP(m/z＝312.1)，IPP(m/z＝326.1)；进样时间0.5sec/Ch。
表5
分析实施例1<酶的鉴定>
在实施例1中所用的来源于米曲霉的胞外酶中，对获得本发明酪蛋白水解物所必需的酶按下面的方法进行分析。顺便提一下，若非特殊说明，下面所有的操作均在4℃下进行。若非特殊说明，所使用的试剂均为由和光纯药生产的特级试剂。
<多种抑制试剂对酶的影响>
将2000mg SUMIZYME FP(注册商标，由新日本化学工业公司生产)溶解在10ml pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液中，通过醋酸纤维素膜(DISMIC-25cs，孔径0.45μm，由ADVANTEC生产)除去不溶解部分，获得粗酶溶液。
该粗酶溶液按照实施例1中的相同方式同1％酪蛋白反应。当向反应体系中添加金属蛋白抑制剂EDTA(乙二胺四乙酸)，或者丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲基磺酰氟)时，平均链长变长，无法获得目的水解物。这说明金属蛋白酶或者丝氨酸蛋白酶在本发明酪蛋白水解物的生成中起重要作用。
(使用离子交换树脂进行分离)将20ml阴离子交换树脂DEAE葡聚糖纤维素(由AMERSHAMBIOSCIENCES K.K.生产)活化，使用pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液进行平衡，然后填充在直径1.5cm×12cm的玻璃柱中。当所有的洗脱液作为不吸收的样品进行收集时，粗酶溶液以1.0ml/min的流速被吸收。然后使用用量为10倍凝胶体积的pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液对柱子进行彻底清洗，并用200ml含线性梯度NaCl(0至600mM)的pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液进行洗脱。洗脱液分装成100小份，每份5ml。对每份均测定其280nm处的吸光度、蛋白酶活性及ACE抑制活性。
(蛋白酶活性的测定)将20mg荧光材料(荧光素异硫氰酸盐)标记的酪蛋白(FITC-酪蛋白，由SIGMA生产)溶解在5ml pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液中，制备底物液。将10μl每份溶液与20μl底物液进行混合，于55℃反应10分钟。通过加入120μl 5％的三氯乙酸溶液终止反应，所得到的反应液于1500rpm离心。取60μl上清液，于3ml pH值为8.5的0.5M的Tris盐酸盐混合，使用荧光计(F-1300，由HITACHI，LTD.制造)进行测定以确定485nm处的激发波长，以及525nm处的荧光波长。
根据每个DEAE葡聚糖纤维素洗脱流分在280nm处的吸光度测定结果，可以确认大约73％的蛋白吸附在阴离子交换树脂上。图3所示的是使用线性梯度为0至0.6M NaCl时结合蛋白的洗脱模式以及蛋白水解活性。
21至60流分在其中含有非常多的蛋白。此外，对每份洗脱酶溶液的活性进行了评估，以在水解酪蛋白中生成ACE抑制组分。结果，基本确认20至60流分具有生成ACE抑制组分的活性。
在另一方面，主要在19至27流分(在0.1M至0.2M NaCl)中观察到以FITC-酪蛋白为底物测定的蛋白酶活性，这表明在ACE抑制组分的生成中蛋白酶活性具有重要功能。通过这些结果，可以发现蛋白酶活性在从酪蛋白中纯化ACE抑制组分的酶活性中具有重要作用。
(所含蛋白酶的鉴定)从DEAE葡聚糖纤维素洗脱流分中，回收具有蛋白酶活性的21至35流分，于5公升pH值为7.2的5mM磷酸缓冲液中进行透析。将Sephacryl S-300HR(由AMERSHAM BIOSCIENCES K.K.生产)悬浮于含200mM NaCl的pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液中，彻底除气，然后填充在直径18cm×100cm的玻璃柱中。使用含200mM NaCl的pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液以2ml/min的恒定流速对该柱进行充分平衡。将该柱用于透析样品，回收每份为10ml的100个流分。对每份均测定280nm处的吸光度与使用FITC-酪蛋白作为底物的蛋白酶活性。
(聚丙烯酰胺凝胶电泳)取10μl每份溶液，与10μl含pH值为6.8的0.125M Tris缓冲液、3％SDS、5％β-巯基乙醇、10％甘油及0.01％溴酚蓝的上样缓冲液混合，于95℃加热5分钟，室温冷却。所获得的样品依据Laemmli方法(Nature，227，680(1970))，使用mini-slab(由ATTO CORPORATION制造)与特定浓度的聚丙烯酰胺凝胶在每凝胶30mA的条件下进行电泳。电泳结束后，将凝胶浸泡在含0.25％的考马斯亮蓝R-250、50％甲醇及7.5％乙酸的考马斯亮蓝染色溶液中10分钟，然后浸润在含5％甲醇和7.5％乙酸的脱色液中直至背景彻底脱色。通过使用分子量标记(由AMERSHAM BIOSCIENCES K.K.生产)参考每条蛋白带的迁移率来计算分子量。
吸附在阴离子交换树脂上的具有生成ACE抑制组分活性的流分，通过Sephacryl S-300树脂进行凝胶过滤，在同分子量与约45kDa相对应的流分中观察到活性。这些流分在12.5％的凝胶中通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析，在44kDa及40kDa处观察到实质上单一的条带。将这些条带切下，用来分析N-末端序列。结果表明44kDa处的条带具有同曲霉菌中已知的中性蛋白酶I高度同源的序列，40kDa处的条带具有同曲霉菌中已知的中性蛋白酶II高度同源的序列。
通过这些结果，可以确定吸附在阴离子交换树脂上的使酪蛋白产生ACE抑制组分的蛋白酶，至少含有两种蛋白酶中性蛋白酶I与中性蛋白酶II。
进一步水解使用蛋白酶、肽酶作用于肽水解酪蛋白生成的组分，将在下面的方法中进行分析。
为了鉴定产生本发明的特有特征的含较高含量Xaa Pro与Xaa ProPro的酶，合成了多种Val Pro Pro的前体肽，评估了它们转化为Val ProPro的可处理性。
(作用于氨基末端的酶的纯化)从DEAE葡聚糖纤维素洗脱流分中，回收具有生成ACE抑制组分活性的21至37流分，于5升pH值为7.2的5mM磷酸缓冲液中进行透析。将羟基磷灰石(由WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES，LTD.生产)悬浮于pH值为7.2的5mM磷酸缓冲液中，彻底除气，然后填充在直径1.5cm×12cm的塑料柱中。使用不少于10倍羟基磷灰石用量的含pH值为7.2的5mM磷酸缓冲液洗柱。将该柱用于具有生成ACE抑制组分活性的透析流分，回收所有通过该柱的流分。
(氨肽酶活性的测定)通过下面方法测定氨肽酶的活性。将合成的肽Val Val Val Pro Pro以50μg/ml的浓度溶解在pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液中，制备底物液。将45μl该底物液同5μl酶流分混合，在恒温箱中于55℃反应30分钟。通过在98℃加热5分钟来终止反应。取适量该反应液，在高效液相层析/质谱仪(由SHIMADZU CORPORATION制造)中进行分析以评估生成的Val Pro Pro的量。
吸附在阴离子交换树脂上的具有生成ACE抑制组分活性的流分，在10％凝胶中进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，切下32kDa处的条带。主要蛋白经抽提、纯化后为32kDa的实质上单一的蛋白。对该蛋白N-末端序列进行分析，表明直至N-末端第十个残基的序列同曲霉菌中已知的亮氨酸氨肽酶的序列同源。可以得出结论，具有已确认生成ACE抑制组分活性的流分含有亮氨酸氨肽酶。
通过这些结果，可以推断吸附在阴离子交换树脂上的具有生成ACE抑制组分活性的流分至少含有具有氨肽酶活性的亮氨酸氨肽酶，它在生成ACE抑制组分的活性中起重要作用。
(可作用于羧基末端的酶的测定)将合成的肽Val Pro Pro Phe Leu以45μg/ml的浓度溶解在pH值为7.2的50mM磷酸缓冲液中，制备底物液。将50μl该底物液同5μl每种酶溶液混合，在恒温箱中于55℃反应30分钟。通过在98℃加热5分钟来终止反应。取适量该反应液，在高效液相层析/质谱仪(由SHIMADZU CORPORATION制造)中进行分析以评估生成的Val ProPro的浓度。
对每个DEAE葡聚糖纤维素洗脱流分作用于羧基末端的能力进行评估，发现30至50流分具有将Val Pro Pro Phe Leu转化为Val Pro Pro的酶活性。
实施例2(通过纯化酶复合物确认酪蛋白水解物的ACE抑制活性)通过分析实施例1，确认来源于米曲霉胞外酶(SUMIZYME FP(注册商标，由新日本化学工业公司生产))的吸附在阴离子交换树脂上的流分所具有的生成ACE抑制组分的活性，包括四种酶活性，即，至少含有中性蛋白酶I与II的蛋白酶活性、包括亮氨酸氨肽酶的氨肽酶活性、直接在脯氨酸后面剪切羧基末端的活性。
通过被吸附的流分(参见图3)，提供了具有高蛋白酶活性的流分I(图3中的1至35流分)、具有较高的直接在脯氨酸后面剪切羧基末端活性的流分II(图3中的36至55流分)、其后的流分III(图3中的流分56至100)及具有蛋白酶活性的未吸附流分。
按表6所示将每流分单独或者联合加入到来源于牛奶的1％酪蛋白溶液中，于55℃反应13小时制备酪蛋白水解物。反应结束后，按照实施例1中描述的方法测定每份所获得的酪蛋白水解物的ACE抑制活性与平均链长。作为对照，对相当于1/10000提纯后的量的粗酶溶液进行同样测定。结果如表6所示。
表6
通过表6，发现具有强ACE抑制活性的组分包含在未吸附流分、具有高蛋白酶活性的流分以及直至具有直接在脯氨酸后面剪切羧基末端活性的流分中。还发现约300mM NaCl洗脱的酶组产生ACE抑制组分，因此流分III不是必要的。
对用表现出很强的生成ACE抑制组分活性的每个流分通过水解所获得的酪蛋白水解物的平均链长，进行了测定和比较。发现未吸收流分、流分I与流分II的平均链长大于2.1，但合并这些流分后，获得了平均链长在2.1或以下的酪蛋白水解物。
实施例3将15g来源于牛奶的酪蛋白(由日本NZMP生成)加入到约80℃的85g蒸馏水中并彻底混合。向混合物中加入1N氢氧化钠溶液调节pH值为7.0。将温度调节未20℃以制备底物液。
对于所获得的底物液，向其中加入作为酶组的来源于米曲霉的胞外酶——SUMIZYME FP(注册商标，由新日本化学工业公司生成)，使得酶/酪蛋白的重量比为1/25。混合物于50℃反应20小时，在不同时间间隔上取样混合液按照与实施例1中相同的方式评估ACE抑制活性及平均链长。结果如图4与5所示。表现出最大ACE抑制活性的于反应12小时后获取的酶分解溶液，喷雾干燥以获得肽混合物粉末。
通过图4和5，可以确认随反应时间增加ACE抑制活性也增加，反应12小时后开始降低。通过对肽的量进行评估还确认平均链长为约1.3至2.1时ACE抑制活性也随之增加。
权利要求
1.一种酪蛋白水解物，其是通过水解动物乳酪蛋白所获得的、含有平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的游离氨基酸与肽。
2.权利要求1中酪蛋白水解物，其中所述肽包含具有Xaa Pro序列的二肽及具有Xaa Pro Pro序列的三肽的、体内非分解性的肽，其中所述具有Xaa Pro序列的二肽其含量水解物中游离氨基酸与肽总量的5重量％或以上，具有Xaa Pro Pro序列的三肽其含量水解物中游离氨基酸与肽总量的1重量％或以上。
3.权利要求1的酪蛋白水解物，其可用于食品添加剂或药物。
4.权利要求2的酪蛋白水解物，其中所述具有Xaa Pro序列的二肽包括Ile Pro、Glu Pro、Arg Pro、Gln Pro、Met Pro和Tyr Pro，所述具有Xaa Pro Pro序列的三肽包括Ser Pro Pro、Ile Pro Pro和Val ProPro。
5.制备权利要求1的酪蛋白水解物的方法，包括使用一组能够将动物乳酪蛋白分解成平均链长2.1或以下个氨基酸残基数的酪蛋白水解物的酶来水解动物乳酪蛋白使其平均链长在2.1或以下的步骤(A)。
6.权利要求5的方法，其中所述酶组是来源于米曲霉的胞外酶。
7.权利要求5的方法，其中所述水解是使用所述酶组在一步反应中进行的。
8.权利要求5的方法，其中所述酶组是包含能够剪切Pro Xaa的肽酶的酶组(X)。
9.权利要求8的方法，其中所述酶组(X)进一步含有金属蛋白酶及丝氨酸蛋白酶至少其中之一的酶。
10.权利要求8的方法，其中所述酶组(X)进一步含有中性蛋白酶I、中性蛋白酶II及亮氨酸氨肽酶至少其中之一的酶。
11.权利要求8的方法，其中所述酶组(X)是来源于米曲霉的胞外酶。
12.权利要求8的方法，其中所述能够剪切Pro Xaa的肽酶是等电点在酸性区域的一组酶。
13.权利要求5的方法，其中在所述步骤(A)中，所述水解的动物乳酪蛋白中酪蛋白的浓度为3至19重量％，所述酶组同动物乳酪蛋白的质量比1/100或以上。
14.具有血管紧张素转化酶抑制活性或降血压作用的试剂，其包括权利要求1的酪蛋白水解物作为其活性成分。
全文摘要
本发明涉及一种含有在体内具有最低酶分解性的游离氨基酸及体内非分解性的肽的酪蛋白水解物，预计它能够在活体内表现出诸如降血压作用等功能，以及其应用。本发明中的酪蛋白水解物含有游离氨基酸以及诸如包括Xaa Pro及Xaa Pro Pro在内的体内不被分解肽这样的肽，它通过水解动物乳酪蛋白使其平均链长2.1或以下个氨基酸残基数来获得，具有ACE抑制活性或者降血压作用。
文档编号A61K38/01GK1833031SQ20048002221
公开日2006年9月13日 申请日期2004年7月30日 优先权日2003年8月1日
发明者山本直之, 水野征一, 西村新吾, 后藤孝信, 松浦启一, 筱田直 申请人:卡尔皮斯株式会社