专利名称：：α<sub>s1</sub>-酪蛋白来源的阿片肽(AOPP)及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物制药领域，更具体的说，是涉及一种ocsl-酪蛋白来源的阿片肽(A0PP)。
背景技术：
：乳是外源性阿片肽的通常来源，一般把来自于酪蛋白的阿片肽，叫酪啡肽(Casomorphin，CM),来自于乳清蛋白的阿片肽，叫乳啡肽(Lactorphins)。1979年Brantl等人最早报道从喂食了牛乳酪蛋白酶解物的豚鼠的回肠纵行肌毛细血管中发现了具有类吗啡活性的短肽，他们首先从酶解的(3-酪蛋白水解产物中分离到一个七肽物质(Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-lie)为|3-酪蛋白第60-66氨基酸残基片断，命名为P-酪啡肽-7(P-CM-7),与ju受体具有良好的亲和力，并呈现出阿片肽类所具有的特征，如依赖性、呼吸抑制性等。随后人工合成了P-CM-7和它的同系物P-CM-6、P-CM-5、(3-CM-4,并证明(3-CM-5在豚鼠回肠试验中具有最强的阿片活性。Meisel等则从饲喂牛酪蛋白的微型猪空肠食糜中分离到一个阿片肽，对应(3-酪蛋白第60~70氨基酸残基片断Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-1le-Pro-Asn-Ser-Leu，称为(3-CM-11，是p-CM-7的前体。'一般来讲，从含3个氨基酸到含7个氨基酸的小肽均称为P-酪啡肽，7个以上则称P-酪啡肽前体。研究结果表明对于所有不同数量氨基酸残基的酪啡肽，要保持其生物活性，N-末端Tyr-Pro-Phe-氨基酸结构不能改变，这种结构是其与阿片受体结合不可缺少的，所有类型的P-酪啡肽都是P-CM-11的C-末端丟掉一或多个氨基酸残基形成的。p-酪啡肽由于脯氨酸的含量高，可避免被胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶降解。但当它被肠吸收后，会被肠粘膜上的二肽基-二肽酶IV(DPIV)降解成X-Pro(N-末端)二肽类物质。后来又发现来源于人(3-酪蛋白的阿片活性肽有f51-57、f51-54、f51-55、f41-44等4个氨基酸片断，其中f51-57排列顺序与牛的P-CM-7相似，只是在第4、5位上不同(Tyr-Pro—Phe—Val—Gin—Pro—lie),其阿片活性比牛(3—CM—7低4-5倍。Loukas等1983年报道牛乳a81-酪蛋白的三个水解片断f90-95、f90-96、f91-96同样具有阿片活性，而且均为5受体的选择性配体。同年Ermisch等通过给鼠注射标记的P-CM-5后发现这种阿片肽可以^L轻;^地通过血脑屏障，从而与脑内的阿片受体结合。据Chabance报道，成年人在大量饮用牛奶后，在其胃肠道内能检测到多种酪蛋白水解产生的酪啡肽片断1,我们认为这些阿片肽可以直接作用于消化道中的阿片肽受体以影响胃肠道的运动或者作为胃肠道激素的外源性调节剂，也可能在小肠刷状缘降解成更小的疏水性阿片肽，穿过肠粘膜进入外周血液，再透过血脑屏障与中枢阿片受体结合，从而发挥其镇痛、呼吸抑制、促进睡眠、调节行为、刺激摄食等作用。2003年Perpetuo等用胰蛋白酶水解y-酪蛋白又发现了一种含有8个氨基酸残基的新阿片活性肽Tyr-Pro-Val-Glu-Pro-Phe-Thr-Glu，对应y-酪蛋白的第114-121氨基酸序列。2005年韩飞等利用基因重组毕赤酵母生产出一种短肽，含10个氨基酸残基，序列为Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-Arg-Tyr-Gly，在CM-7的基础上又增加了3个氨基酸，经;险测具有明显的阿片活性。同年，LiangJ等报道从硬虱中分离得到一种阿片肽，序列为Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Lys-Met,但因这种物质与此前从哺乳动物血色素中4是:取的阿片肽hemorphin有;f艮大的序列相似性，而硬虱又是一种以吸食血液为生的动物，所以该肽是硬虱本身产生还是在吸食血液时从宿主获得有待进一步研究。另外，a-乳清蛋白含有一个阿片活性序列(Tyr-Gly-Leu-Phe),为第50-53氨基酸片断，称为a-乳啡肽(oc-Lactorphin)。与此相似，(3-乳球蛋白的第102-105氨基酸片断(Tyr-Leu-Leu-Phe)同样具有阿片活性，称为p-乳啡肽(|3-Lactorphin)。来自于牛血清白蛋白(BSA)的399-404片断(Tyr-Gly-Phe-Gin-Asn-Ala)也是一种阿片肽,称为Serorphin。人们在水解酪蛋白得到阿片活性肽的同时，也发现了一些具有阿片拮抗作用的短肽。Chiba和Yoshikawa都报道从牛乳和人乳k-酪蛋白酶解液中发现其含有类似纳洛酮阿片拮抗作用的短肽，称为酪新素(Casoxins)。目前从k-酪蛋白发现的阿片拮抗肽有CasoxinsA(f35-41,Tyr—Pro-Ser-Tyr-Gly—Leu—Asn)、CasoxinsB(f58-61,Tyr-Pro-Tyr-Tyr)4和CasoxinsC(f25—34,Tyr-Ile-Pro—Ile-Gln-Tyr-Val-Leu-Ser-Arg),其中CasoxinsC的拮抗活性最高。而CasoxinsD则是从人乳a"-酪蛋白中分离得到的又一个阿片拮抗肽，其序列对应于a"-酪蛋白的158-164氨基酸片断Tyr-Va1-Pro-Phe-Pro-Pro-Phe。经研究发现，这些酪新素的C-末端在曱氧基化能显示出更高的活性。另外，人乳铁蛋白经酶解同样可以产生阿片拮抗肽，现已发现的有三种LactorferroxinA(f318-323，Tyr-Leu-Gly-Ser-Gly-Tyr-0CH3)、LactorferroxinB(f536-540,Arg-Tyr-Tyr-Gly—Tyr—0CH2)、LactorferroxinC(f673-679，Lys-Tyr-Leu-Gly-Pro-Gin-Tyr-0CH3)。其中LactorferroxinA选择性结合ju受体，LactorferroxinB、C则对k受体有比举交高的亲和力。同内源性阿片肽类似，外源性阿片肽也具有自己特定的N-末端序列Y-X-F或Y-X-X-F/Y。它们的氨基末端均具有Tyr残基(cc-酪啡肽除外)，而且在第三或四位上还有其他的芳香族氨基酸如Phe、Tyr的出现，这种结构特点对于阿片肽和体内受体位点的特异性结合非常重要。在Loukas报道的三个a-酪啡肽中，f90-95和f90-96片段的第一个氨基酸残基是Arg，同其他酪啡肽不同，但研究发现这也是其本身活性所必需的结构特点。由此可见，研究阿片肽的氨基酸序列，对于进一步探讨其结构、功效有着十分重要的价值。表1列出了目前发现的一些主要外源性阿片肽及其序列。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>
发明内容本发明是为了提供一种oc81-酪蛋白来源的阿片肽及其制备方法。本发明通过下述技术方案实现本发明利用胃蛋白酶酶解o^-酪蛋白，确立了生成最高阿片活性的酶解条件，并对酶解液进行了醇沉粗提和Sephadex层析，从而分离得到了一种具有阿片活性的短肽，该阿片肽命名为AOPP(Alpha-SI-CaseinOpioidPeptide),其氨基酸序列为YFYPELFRQFYQLDA。该ocsi-酪蛋白来源的阿片肽的制备方法如下(1)酶解在底物中加入胃蛋白酶，调节pH值为2.0，在42。C酶解2.5h,其中，底物是浓度为3。/。(w/v)的0Cs,-酪蛋白溶液，胃蛋白酶与ou-酪蛋白的比例为1:30(w/w);(2)在上述酶解液中用浓度为80%的乙醇沉淀杂蛋白，阿片活性物质6基本保留在上清液中，取上清液；之后，选用SephadexG-50层析柱对上述上清液进行分离层析，收集活性峰即第三个峰。层析条件为洗脱速度为0.75ml/min，上样浓度为50mg/ml，洗脱緩沖液采用pH为7.1、浓度为0.05mol/L的三羟甲基絲曱烷盐酸盐(tris-HC1)。(3)将收集液经SephadexG-15层析柱再细分离层析，经4企测第四个峰具有活性，收集第四个峰，冻干即得ocs广酪蛋白来源的阿片肽。层析条件为洗脱速度为0.5ml/min，上样浓度为10mg/ml,洗脱緩沖液采用pH为7.1、浓度为0.05mol/L的tris-HC1。本发明分离得到的阿片肽经Tricine-SDS-PAGE电泳和毛细管电泳检测，是一种单一组分，经过氨基酸组成分析和适合度检验得知，其对应于Alpha-Si-casein的144-158序列YFYPELFRQFYQLDA,分子量为2252.48。在国际权威蛋白及生物活性肽数据库查询得知，这是一种新型的阿片活性肽。利用蛋白分析序列软件ANTHEPROT5.0和TheSwiss-PdbViewer对其性质和结构进行了相应预测，其等电点pl=4.035，二级结构中螺旋占40%,盘绕占27%,转角占20%,折叠占13°/。，第四位PRO处有一个折叠，且结构中有四个电荷集中区域。最后经离体豚鼠回肠实验发现，该肽可以抑制回肠的自主收缩，绘制量效曲线得出它的半数抑制浓度为IC5。=3.177mg/ml,小鼠负重游泳试-险也证明该肽确有明显的抗疲劳作用。图1为本发明阿片肽空间结构示意图。具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明进行详细说明。实施例(1)酶解在底物中加入胃蛋白酶，调节pH值为2.0，在42。C酶解2.5h,其中，底物是浓度为3。/。(w/v)的ccs「酪蛋白溶液，胃蛋白酶与0Csi-酪蛋白的比例为1:30(w/w)。(2)在上述酶解液中用浓度为80%的乙醇沉淀杂蛋白，取上清液；之后，选用SephadexG-50层析柱对上述上清液进行分离层析，收集第三个峰；层析条件为洗脱速度为0.75ml/min，上样浓度为50mg/ml，洗脱緩冲液采用pH为7.1、浓度为0.05mol/L的tris-HCl。(3)将收集液经SephadexG-15层析柱再分离层析，收集第四个峰，冻干即得oc酪蛋白来源的阿片肽。其中，层析条件为洗脱速度为0.5ml/min，上样浓度为10mg/ml，洗脱緩沖液采用pH为7.1、浓度为0.05mol/L的tris-HC1。经氨基酸组成分析及与酪蛋白的氨基酸序列比较获知，该肽是一种新型阿片肽，并才艮据其序列推测其空间结构如图l所示。权利要求1、一种αs1-酪蛋白来源的阿片肽-AOPP，其氨基酸序列为YFYPELFRQFYQLDA。2、一种权利要求1所述的ocs广酪蛋白来源的阿片肽的制备方法，其特征在于，包括下述步骤(1)酶解在底物中加入胃蛋白酶，调节pH值为2.0，在42'C酶解2.5h,其中，底物是浓度为3。/。(w/v)的ou广酪蛋白溶液，胃蛋白酶与ct"-酪蛋白的比例为1:30(w/w);(2)在上述酶解液中用浓度为80%的乙醇沉淀杂蛋白，取上清液；选用SephadexG-50层析柱对上述上清液进行分离层析，收集第三个峰；层析条件为洗脱速度为0.75ml/min，上样浓度为50mg/ml;(3)将收集液经SephadexG-15层析柱再分离层析，收集第四个峰，冻干即得ccu-酪蛋白来源的阿片肽；层析条件为洗脱速度为0.5ml/min，上样浓度为10mg/ml。3、根据权利要求2所述的o^-酪蛋白来源的阿片肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)和步骤(3)中分离层析所使用的洗脱緩冲液采用pH为7.1、浓度为0.05mol/L的三幾曱基氨基曱烷盐酸盐。全文摘要本发明公开了一种α<sub>s1</sub>-酪蛋白来源的阿片肽及其制备方法，其制备方法为在底物中加入胃蛋白酶，调节pH值为2.0，在42℃酶解2.5h，其中，底物是浓度为3％(w/v)的α<sub>s1</sub>-酪蛋白溶液，胃蛋白酶与α<sub>s1</sub>-酪蛋白的比例为1∶30(w/w)；在上述酶解液中用浓度为80％的乙醇沉淀杂蛋白，取上清液；之后，选用SephadexG-50层析柱对上述上清液进行分离层析，收集第三个峰。将收集液经SephadexG-15层析柱再细分离层析，收集第四个峰，冻干即得α<sub>s1</sub>-酪蛋白来源的阿片肽。本发明得到的阿片活性肽，其对应于Alpha-S1-casein的144-158序列YFYPELFRQFYQLDA，分子量为2252.48。该肽可以抑制回肠的自主收缩，有明显的镇痛和抗疲劳作用。文档编号C12P21/06GK101525376SQ200910068509公开日2009年9月9日申请日期2009年4月17日优先权日2009年4月17日发明者庞广昌,张建辉,胡志和,陈庆森申请人:天津商业大学