专利名称：一种快速检测转基因油菜gt73的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体 说是一种快速检测转基因油菜GT73的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观 察加入1000 x SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增情 况。
背景技术：
近年来，我国生产的油菜籽供不应求，平均每年进口菜籽100万吨以 上，最多的年份达300多万吨，主要进口国为加拿大。加拿大油茱籽已成 为我国菜籽消费的一个重要组成部分。加拿大是世界第二大油菜生产国和 第一大油菜产品出口国，还是世界上第一个大面积商业化种植转基因油菜 的国家，油菜生产主要采用抗除草剂转基因油菜品种，种植面积最大的品 种是孟山都公司培育的抗农达(草甘膦)品种GT73/RT73及其衍生品种， 约占加拿大油菜播种面积的46%,其次是拜耳公司培育的转基因抗草胺膦 杂交油菜MsSRH系统及其衍生组合，约占加拿大油菜面积的31%。另外还 有Pioneer Hi-bred ^司采用诱变育种方法获得的抗咪唑啉酮除草剂品种， 约占15%。加拿大目前抗除草剂品种种植面积达95%以上。该国从事油菜生 产的农户约6万户，采取大面积机械化作业，年产油菜籽500-800万吨。加 拿大的油菜生产主要分布在加拿大西部草原三个省，春播夏收，生产的油 菜籽50%在国内压榨，50%通过沿海口岸出口到美国、日本、中国和墨西哥 等地区。
我国目前还没有转基因油菜产业化种植，但转基因油菜研究十分活 跃，有的已经接近产业化阶段。为了推进转基因油菜的产业化和安全管理 进程，国家转基因油菜的检测和监测体系正在紧锣密鼓的进行。目前，除 美国有少量转基因油菜种植以外，加拿大是唯一 大面积产业化种植转基因 油菜的国家，迄今已有十年的历史，其经验与教训值得我国借鉴。随着大量转基因作物逐步走向市场，转基因作物和转基因作物加工的 食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从本质上讲，转基因作物和常 规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是通过有性杂交来实现，而植
物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微注射等技术将外源重组DNA 导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因的遗传特性及表型应该可以 更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转基因作物进行安全性评估仍 然很有必要。
欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟 的非转基因产品不得含有l。/fl的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做 了不同规定，域值从l-554不等。
我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》， 于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管 理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目 录，并于2002年3月20日起正式实施。
目前，PCR检测方法是主要的转基因作物检测方法，包括定性PCR方法、 复合PCR方法、巢式PCR方法、竟争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。 国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法。PCR扩增技术的一 般检测程序是提取基因组DNA —PCR扩增—酶切试验一检测目的基因— 检测报告。检测仪器设备主要是PCR仪、电泳仪、冷冻离心机、紫外观察 (或凝胶成像)仪等，所需的技术条件较高，仪器设备较为昂贵，且检测 成本和费用较高， 一般检测单位难以达到。
发明内容
本发明的目的在于公开一种快速检测转基因油菜GT73的方法及根据 外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观 察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判 断扩增情况。
本发明的技术方案如下一种用于检测转基因油菜GT73的特异性引物，其中外引物正向序列 5，-GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC-3，， 外引物反向序列 5，-GTGGAATGTTCAATACCTTGA-3，； 内引物正向序列 5，-GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC-3，，内引物反 向序列5'-GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC-3，，环 引物序列5 '-AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG-3，。
每条引物分别配制成浓度为lOOjumol/L的母液，取外引物各ljiL， 内引物各8/iL，灭菌去离子水2jaL,充分混合，为引物混合溶液。
本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因油菜GT73的方法，其特 征在于包括如下步骤
(1)将引物混合溶液及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模 板DNA，在63-65匸进行45-60min，并且在80。C持续2min, 4X:保存；
其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25juL，其各种成分分别 为10xThermoPo1 Buffer 2. 5 p L, 4mol/L甜菜碱6. 25yL， 0. 2mol/L MgS04 0. 25 uL，引物混合液l(jL， 10 ji mol/L dNTPs 3. 5pL, 8000U/LBst DM聚合酶大片段l-2nL,模板DNA l-5]aL,用灭菌去离子水补齐到25 UL，混匀离心(4000-8000rpm， 5-10秒)后上才;u;
(2)扩增反应结束，取体系液3-25juL，采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入荧光染料SYBR Green,通过颜色变化观察有无 扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反 应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
本发明所述的引物混合溶液指的是将上述的5条特异引物粉末分别配 成浓度为100pmol/L的母液，然后取外引物各ljiL,内引物各8nL，加 灭菌去离子水2pL,充分混合，制得引物混合溶液。
本发明所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l-2]nL。
本发明所述的荧光染料SYBR Green加入量为l-2piL,浓度为1000倍。 本发明所述的检测方法，模板DNA指的是从待测样品提取的基因组DNA。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法 寸故以详细的说明。
1、 原理
本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用5条特异引物及 一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63匸-65匸对核酸进行扩增，短时间 扩增效率可达到10'-10"个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易
检测等特点。
2、 引物设计
本研究依据转基因油菜GT73外源基因与内源基因结合处序列设计了 4 条引物。引物由上海生物工程公司合成。
表l引物序列表如下:
引物名称序列(5'to3')
GT73正向外引物GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC
GT73反向外引物GTGGAATGTTCAATACCTTGA
GT73正向内引物GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC
GT73反向内引物GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC
GT73环引物AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG
3、反应条件
反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、转基因油菜GT73特异性引 物、甜菜碱、MgS04和反应緩冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据 引物的效率和模板DM质量变化， 一般为lh或更少。加入模板DNA,在63-65 。C进行45-60min,并且在80匸，持续2min而终止。
这项技术的优点就是不需要热循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，仅 需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度。 材料与方法-.
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物；甜菜碱溶液；MgS04溶液；dNTPs;(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL，其各种成分及终浓度 分另'J为10 x ThermoPol Buffer 2. 5 y L, 4mol/L甜菜碱6. 25 0. 2mol/L MgS040. 25yL，引物混合液ljLiL， lOpmol/L dNTPs 3. 5 juL, 8000U/LBst DNA聚合酶大片段l-2pL，模板DNAl-5nL，用灭菌去离子水补齐到25 p L, 混匀、离心(4000-8000rpm， 5-10秒)后上机；
(3) 扩增反应过程在63-65 'C进行45-60min,并且在80'C持续2min, 4t:保存；
(4) 扩增反应结束，取体系液3-25juL用不同的检测方法判断扩增与否。 4、扩增结果观察
有三种观察方法，适合不同情况下进行
1) 使用2%琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下 观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱 中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。结果见图l。
2) 由于反应形成大量双链DM产物，所以可直接向扩增管中加入荧光 染料SYBR Green,通过肉眼观察，无扩增反应的反应管呈橙色，有扩增反 应的反应管将变为绿色。结果见图2。
3) 检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进 行。在反应中，在核酸大量合成时，产生副产物一焦磷酸镁沉淀，可以用 肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。
本发明用于转基因油菜GT73检测的扩增方法，具有以下优点
(1) 操作筒便不需要复杂的仪器，只需一恒定温度就能反应。
(2) 高特异性该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高 度特异性。
(3) 快速高效整个扩增不到lh即可完成，产量可达到1(T-1(T个拷贝；
(4) 鉴定简便可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过 SYBR Green颜色变化判断扩增与否。
图l为扩增产物的电泳分析图i瞽。自左向右依次为Marker、空白对照、阴性对照、阴性样品、阳性对照和阳性样品。
图2为扩增产物加入SY肌Green结果图。左为阳性对照，右为阴性对照。
图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阴性对照、阳 性对照、待测样品。
图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为阴性对照、阳性 对照、待测4羊品l和待测样品2。
图5为扩增产物的电泳分析图i普。由左至右DL2000 DNA Marker、阴 性对照、待测样品l、待测样品2、待测样品3、待测样品4、阳性对照。
图6为实施例4，采用本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫 外灯下观察结果，其中l，m; 2,5%; 3， 1%; 4， 0， 5%; 5, 0.1%; 6， 0. 05%; 7， 0. 01%; 8， 0. 005%; 9， 0. 001%; 10,阴性对照；M，DL2000 DNA, Marker,
图7为实施例4，常规定性PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫 外灯下观察结果。其中1，10%; 2， 5%; 3,1%; 4,0.5%; 5， 0.1%; 6， 0.05%; 7, 0. 01%; 8, 0. 005%; 9, 0.001%; 10，阴性对照；M，DL2000 DNA， Marker。
具体实施例方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以 详细的说明，在此需加以说明的是本发明所述的引物序列见表l。 实施例l
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DM聚合酶大片段和 10倍ThermoPo1 Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；
0. 2mol/L MgS0濃液。
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25)iL,其各种成分分别为 10 x ThermoPol Buffer 2. 5 nL， 4mol/L甜菜碱6. 25 p L, 0. 2mol/L MgS04 0,25pL，混合引物1juL， 10ymol/L證Ps 3.5pL, 8000U/L Bst DNA聚 合酶大片段ljaL,模板DMlyL，用灭菌去离子水补齐到25juL，混合均 匀后离心(4000rpm, 5秒)上机。
(3) 扩增反应程序在63'C进行60min，并且在80"C保温2min， 4匸，保存。
(4)扩增反应结束，取体系液15nL,直接向扩增管中加入荧光染料 1/iL 1000 xSYBR Green,振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的反应 管呈橙黄色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图3，由图可见， 待测样品为阳性样品，含有转基因油菜G T 7 3成份。 实施例2
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；
0. 2mol/L MgS04溶液。
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL,其各种成分分别为 10 x ThermoPol Buffer 2. 5 pL， 4mol/L甜菜碱6. 25|iL， 0. 2mol/L MgS04， 混合引物O. 25nL , 10pmol/L dNTPs 3. 5jaL， 8000U/L Bst DM聚合酶 大片段2jiL，模板DM2yL，用灭菌去离子水补齐到25nL,混合均匀后 离心(8000rpm, IO秒)上机。
(3) 扩增反应程序在65。C进行45迈in，并且在80lC保温2min, 4匸，保存。
(4) 扩增反应结束，取体系液15pL，直接向扩增管中加入萸光染料 2pL 1000 xSYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的反应 管呈橙黄色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图4，由图可以看 出，待测样品l为阳性样品，不含有转基因油菜GT73成分，样品2不含有转 基因油菜GT73成分。
实施例3
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DM聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；
0. 2mol/L MgS04溶液。
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25yL,其各种成分分别为 10 x Ther迈oPol Buffer 2. 5 y L， 4mol/L甜菜碱6. 25pL， 0. 2mol/L MgS04, 混合引物0.25jaL ， lO^mol/L dNTPs 3.5/iL, 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2yL,模板DM5nL,用灭菌去离子水补齐到25jLiL,混合均匀后 离心(5000rpm， 5秒)上机。
(3) 扩增反应程序在63"C进行60min，并且在80"C保温2min, 4'C，保存。
(4) 扩增反应结束，取体系液3pL经2n/n琼脂糖凝胶电泳分析，紫外 灯下观察结果。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应的反应管出 现阶梯状条带。结果见图5， 4个样品中样品1、 2不含有转基因油菜GT73成 分，样品3、 4含有转基因油菜GT73成分。
实施例4
对比实验
转基因油菜GT73的定性PCR测定方法与本发明的测定方法的对比
(1) 本发明方法试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合 酶大片段和10倍ThermoPo1 Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜 菜碱溶液；0. 2mol/L MgS04溶液；DNA模板包括含有转基因油菜GT73成份 10%、 5%、 1%、 0.5%、 0.1%、 0.05%、 0.01%、 0.005%、 0.001%、 0%的样品。
(2) 本发明扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL，其各种成分 分另寸为10 x ThermoPol Buffer 2. 5 juL, 4mol/L甜菜械6. 25 ji L， 0. 2mol/L MgS04 0.25 yL,混合引物1"L， 10|iimol/L dNTPs 3. 5 n L， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2yL,模板DNA 5|iL,用灭菌去离子水补齐到25juL， 混合均勻后充分混匀、离心(8000rpm， 8秒)上机；
(3) 本发明扩增反应程序在63。C进行60min，并且在80X:保温2min， 4'C，保存；
(4) 本发明扩增反应结束，取反应产物4yL,经2%琼脂糖凝胶电泳 分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应 的反应管出现阶梯状条带。结果见图6:其中1，10%; 2,5%; 3， 1%; 4,0.5%; 5， 0.1%; 6， 0. 05%; 7， 0. 01%; 8， 0. 005%; 9, 0. 001%; 10，阴性对照；M，DL2000 DNA， Marker。
(5 ) PCR方法反应引物采用本发明反应中 一对外引物扩增目标基因。PCR反应为25 n L体系，10xPCR buffer (Promega) 2. 5yL, 10 mM dNTPs (Promega) 0. 5juL,上游和下游引物(10 mM)各O. 5 y L, Taq酶(5U/jn L, Promega) 0. 5jaL， DNA模板lpL，灭菌去离子水19. 5 n L。反应程序为 95 T预变性5min; 95C变性30s, 52'C退火30s， 72T延伸30s， 35个循环； 72'C延伸7 min。 PCR产物取IO n L于2W琼脂糖凝胶电泳，100 V电压下40 min， 通过凝胶成像分析仪观察，结果见图7:其中1，10%; 2,5%; 3,1%; 4,0.5%; 5, 0. 1%; 6， 0. 05%; 7, 0. 01%; 8, 0. 005%; 9, 0. 001%; 10,阴性对照；M,DL2000 丽，Marker。
由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的 敏感度，能检测出转基因油菜GT73含量更低的样品。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在 不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明 的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于 本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限 制。序列表
<110>天津市农业科学院中心实验室
<120> —种快速检测转基因油菜GT73的方法
<160> 4
<210> 1
<211〉 24bp
<212> 腿
<213> 人工序列
<彻> 1
ggUattact ctttcttttt ctcc 24
<210> 2 <211> 21bp <212>舰 <213>人工序列 <400> 2
gtggaatgtt caataccUg a 21
<210> 3 <211> 49bp <212> DNA <213>人工序列 <400> 3
ggaggatgat cttcatgtcc ggttttaUt tgaccatcat actcattgc 49
<210> 4 <211> 48bp
12<212> 飄 <213> 人工序列 <400> 4
gcctUccU ccUttcttg cctttttgtt tctgagtaat tcttcagc 48
<210> 5 <211〉 25bp <212> DNA <213>人工序列 <400〉 5
aagcttgtgt caattgttga cagag 2权利要求
1、用于检测转基因油菜GT73的特异性引物，其特征在于，包括外引物正向序列5’-GGTAATTACTCTTTCTTTTTCTCC-3’，外引物反向序列5’-GTGGAATGTTCAATACCTTGA-3’；内引物正向序列5’-GGAGGATGATCTTCATGTCCGGTTTTATATTGACCATCATACTCATTGC-3’，内引物反向序列5’-GCCTTTCCTTCCTTTTCTTGCCTTTTTGTTTCTGAGTAATTCTTCAGC-3’，环引物序列5‘-AAGCTTGTGTCAATTGTTGACAGAG-3’。
2、 一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因油菜GT73方 法，其特征在于包括如下步骤(1)将引物混合溶液及一种具有链置换活性的DM聚合酶，加入模 板DM，在63-65 C进行45-60min，并且在80X:持续2min, 4t:保存；其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25yL，其各种成分分别 为10xThermoPo1 Buffer 2. 5jnL， 4mol/L甜菜碱6. 25pL, 0. 2mol/L MgS04 0. 25 pL，引物混合液lyL， 10 u mol/L dNTPs 3. 5 n L, 8000U/LBst DM聚合酶大片段l-2nL,模板DMl-5jiL，用灭菌去离子水补齐到25 jiL,混匀，离心4000-8000rpm， 5-10秒后上机；(2)扩增反应结束，取体系液3-25pL，采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入荧光染料SYBR Green，通过颜色变化观察有无 扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反 应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
3、 如权利要求2所述的检测方法，其中所迷的引物混合溶液指的是 将权利要求1所述的5条特异引物粉末分别配成浓度为100ymol/L的母 液，然后取外引物各ljiL,内引物各8uL,加灭菌去离子水2)iL，充分混合，制得引物混合溶液。
4、 如权利要求2所述的检测方法，其中荧光染料SYBR Green浓度为1000倍，加入量为1-2 jiiL。
5、 如权利要求2所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚 合酶为8000U/L Bst DM聚合酶大片段l-2jaL。
全文摘要
本发明公开了一种转基因油菜GT73的快速检测方法。其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增出大量产物。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便等优点。
文档编号C12Q1/68GK101519694SQ200910068339
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月2日 优先权日2009年4月2日
发明者兰青阔, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 赵 申请人:天津市农业科学院中心实验室