一种快速检测转基因玉米mon863的方法

专利名称：一种快速检测转基因玉米mon863的方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体 说是一种快速检测转基因玉米M0N863的方法，通过肉眼观察反应管浊度或 观察加入IOOO x SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断扩增 情况。
背景技术：
转基因作物(Genet ically Modif ied Crop s，筒称GMC)，是指人 类利用现代基因工程技术，将某些生物基因转移到农作物中去，改造农作 物的遗传物质，使其在性状(如抗性、产量、熟期)、品质等方面向人类需 要的目标转变，这样得到的农作物叫做"转基因作物"，也称为"基因改 造作物"或"基因改良作物"。
玉米是世界上重要的粮食作物之一，在其生长过程中受到的危害主要 来自病虫害，其次为杂草。据统计，玉米如不喷施杀虫剂可能造成59%的 产量损失。因此，基因工程技术最早应用在玉米上是开发具有抗虫和抗除 草剂特性的玉米品系。经济合作发展组织(organization for economic cooperation and develclpment， 0ECD) 2000年登记的转基因玉米品系共 计18种，主要改良性状为抗病虫害和耐除草剂等。2000年美国栽种的转基 因玉米中72%属抗虫害特性，24%属耐除草剂，4%则兼具抗虫害及耐除 草剂两种特性。
MON 863转基因玉米是美国孟山都公司2003年投放市场的转基因产品， 具有防病虫害能力。2004年4月，欧盟食品安全局确认MON863安全可靠。 2005年8月，欧盟批准将这种转基因玉米用于动物饲料，2006年1月批准其 用于人类食品。
1998年8月以来，国际上就转基因产品对人体健康和生态环境的安全 性问题引发了一场世界性的关于"生物安全"的论战。不同国家和国际组
3织对转基因作物及其产品的生态风险、可能带来的环境问题、转基因产品 作为食品对人体健康问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、 知识产权问题等展开了激烈争论随着大量转基因作物逐步走向市场，转基 因作物和转基因作物加工的食物的安全性问题也开始受到人们的关注。从 本质上讲，转基因作物和常规育成的作物品种没有差别。常规育种一般是 通过有性杂交来实现，而植物基因工程则是用农杆菌、基因枪、电激、微
注射等技术将外源重组DNA导入植物基因组中。尽管从理论上讲，转基因 的遗传特性及表型应该可以更加精确的预测，在应用上更加安全，但对转 基因作物进行安全性评估仍然很有必要。
欧盟最早提出对转基因食品进行标识管理。1999年，要求出口到欧盟 的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最 低限量降低到O. 9%。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做 了不同规定，域值从1-5%不等。
我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》， 于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管 理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目 录，并于2002年3月20日起正式实施。
目前，转基因作物的检测途径主要有两种， 一是检测是否有外源基因 (DNA )，该途径主要基于PCR技术和核酸探针的杂交检测技术能精确、快 速地检测GMC中是否有外来基因(包括目的基因、标记基因和引物)；二是 检测是否有外源蛋白质(基因表达的产物)，主要采用化学分析、凝胶电 泳和酶联免疫的方法，检测工作较为繁杂。其中的PCR检测方法是主要的 检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、 竟争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等。国内外推广使用的是定性PCR 和实时定量PCR检测方法。PCR扩增技术的一般检测程序是提取植物基 因组DNA —PCR扩增—酶切试验—检测目的基因—检测报告。检测仪器设 备主要是PCR仪、电泳仪、冷冻离心机、紫外观察(或成像)仪等。由于 转基因产品检测所需的技术条件较高，仪器设备较为昂贵，且检测成本和费用较高。

发明内容
本发明的目的在于公开一种快速检测转基因玉米MON863的方法及根 据外源基因与内源基因接合处序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼 观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果 判断扩增情况。
本发明的技术方案如下
一种用于检测转基因玉米MON863的特异性引物，其中外引物正向序 列5，-TCAAAGATGGAATGGCCCAG-3，，外引物反向序列 5，-TCTTTGAGTGCCCGTCGTA-3，； 内引物正向序列 5，-CCGGTCGTGCGTGGTATGTTCAAGGTTAACGTACGCGATGC-3，，内引物反向序列 5'-CGCAGGTGCCAGATCCTCAATGGTACACTAGGCTGATCGA-3'。
本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因玉米M0N863的方法，其 特征在于包括如下步骤
(1)将引物混合溶液及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模 板DNA,在63-65 。C进行45-60min，并且在80。C持续2min, 4XM呆存；
其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25yL，其各种成分分别 为10xThermoPo1 Buffer 2.5|iL， 4mol/L甜菜碱6.25pL， 0. 2mol/L MgS04 0.25juL，引物混合液lpL， lOymol/L dNTPs 3. 5pL, 8000U/L 链置换活性DM聚合酶l-2pL，模板DMl-5pL，用灭菌去离子水补齐 到25yL，混匀离心4000-8000rpm, 5-10秒上才几。
(2)扩增反应结束，取体系液3-25yL,采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入焚光染料SYBR Green，通过颜色变化观察有无 扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反 应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
本发明所述的引物混合溶液指的是将上迷4条特异引物分别配成浓度 为100nmol/L的母液，然后取外引物各ljiL，内引物各8pL,加灭菌去 离子水2jiL,充分混合，制得引物混合溶液。
5本发明所述的检测方法，其中所述的链置换活性的DNA聚合酶为 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2juL。
本发明所述的荧光染料SYBR Green加入量为l-2jnL,浓度为1000倍。 本发明所述的检测方法，模板DM指的是从待测样品提取的基因组廳。
为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法 4故以详细的i兌明。
1、 原理
本方法应用一种新型的核酸扩增方法，其原理是采用4条特异引物及 一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63X:-65'C对核酸进行扩增，短时间 扩增效率可达到109-1(T个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易 检测等特点。
2、 引物设计
本研究依据转基因玉米MON863外源基因与内源基因结合处序列设计 了4条引物。引物由上海生物工程公司合成。
表l引物序列表如下:_
_引物名称_序列(5'to3')__
Mon863正向外引物 TCAAAGATGGAATGGCCCAG Mon863反向外引物 TCTTTGAGTGCCCGTCGTA
Mon863正向内引物 CCGGTCGTGCGTGGTATGTTCAAGGTTAACGTACGCGATGC Mon863反向内引物 CGCAGGTGCCAGATCCTCAATGGTACACTAGGCTGATCGA
3、 反应条件
反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、转基因玉米MON863特异性 引物、甜菜碱、MgS0,和反应緩冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依 据引物的效率和模板DM质量变化， 一般为lh或更少。加入模板DM，在 63-65。C进行45-60min，并且在8(TC,持续2min而终止。
这项技术的优点就是不需要热循环，不需要PCR仪等昂贵的仪器，仅 需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度。材料与方法
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物；甜菜碱溶液；MgS04溶液；dNTPs;
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25jiL，其各种成分及终浓度 分另'J为10 x ThermoPol Buffer 2. 5 4mol/L甜菜碱6. 25 uL， 0. 2mol/L MgS04 0. 25 pL,引物混合液lnL， 10 y mol/L dNTPs 3. 5 y L， 8000U/LBst DNA聚合酶大片段l-2pL,模板DNAl-5nL，用灭菌去离子水补齐到25 p L, 混匀离心(4000-8000rpm， 5-10秒)后上机。
(3) 扩增反应过程在63-65匸进行45-60min，并且在80X:持续2min, 4X:保存；
(4) 扩增反应结束，取体系液3-25]uL用不同的检测方法判断扩增与否。 4、扩增结果观察
有三种观察方法，适合不同情况下进行
1) 使用2%琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下 观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图镨 中显示为从点样孔处开始的弥散和阶梯状条带现象。结果见图l。
2) 由于反应形成大量双链DNA产物，所以可直接向扩增管中加入荧光 染料SYBRGreen，通过肉眼观察，无扩增反应的反应管呈橙色，有扩增反 应的反应管将变为绿色。结果见图2。
3) 检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进 行。在反应中，在核酸大量合成时，产生副产物一焦磷酸4美沉淀，可以用 肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。
本发明用于转基因玉米MON863检测的扩增方法，具有以下优点
(1) 操作简便不需要复杂的仪器，只需一恒定温度就能反应。
(2) 高特异性该技术由4条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高 度特异性。
(3) 快速高效整个扩增不到lh即可完成，产量可达到109-l(T个拷贝；
(4) 鉴定简便可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过SYBR Green颜色变化判断扩增与否。


图l为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为Marker、空白对照、 阴性对照、阴性样品、阳性对照和阳性样品。
图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。左为阳性对照，右为阴性对照。
图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阴性对照、阳 性对照、待测样品。
图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左至右为阴性对照、阳性 对照、待测样品1和待测样品2。
图5为扩增产物的电泳分析图语。由左至右DL2000 DNA Marker、阴 性对照、待测样品l、待测样品2、待测样品3、阳性对照。
图6为实施例4，采用本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫 外灯下观察结果，其中1，10%; 2,1%; 3,0.1%; 4,0.01%; 5, 0.001%; 6, 0.0001%; 7,阴性对照；M,DL2000 DNA， Marker。
图7为实施例4，常规定性PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析， 紫外灯下观察结果。其中l，10'/。; 2,1%; 3,0.1%; 4,0.01%; 5, 0.001%; 6， 0.0001%; 7，阴性对照；M，DL2000 DNA， Marker。
具体实施例方式
为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以 详细的说明，在此需加以说明的是本发明所述的引物序列见表l。 实施例l
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；
0. 2mol/L MgS04溶液。
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25niL，其各种成分分别为 10x ThermoPol Buffer 2. 5juL， 4mol/L甜菜碱6. 25 n L， 0. 2mol/L MgS04 0.25yL，混合引物lpL， 10pmol/L dNTPs 3.5jiL， 8000U/L Bst DNA聚合酶大片段ljiL，模板DNAlnL,用灭菌去离子水补齐到25nL，混合均 匀后离心(4000rpm， 5秒)上机。
(3) 扩增反应程序在63C进行60min，并且在80X:，保温2min， 4
x:，保存。
(4) 扩增反应结束，取体系液15yL，直接向扩增管中加入荧光染料 lpL 1000 xSYBR Green，振荡混匀，肉眼》见察结果。无扩增反应的反应 管呈橙黄色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图3，由图可见， 待测样品为阳性样品，含有转基因玉米MON863成份。
实施例2
(1) 试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液；
0. 2mol/L MgS(V溶液。
(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL，其各种成分分别为 10xThermoPo1 Buffer 2. 5pL， 4mol/L甜菜碱6. 25pL， 0. 2mol/L MgS04， 混合引物O. 25yL , 10"mol/L dNTPs 3. 5juL， 8000U/L Bst DNA聚合酶 大片段2mL,模板DNA 2jiL,用灭菌去离子水补齐到25jiL,混合均匀、 离心(8000rpm, IO秒)上机。
(3) 扩增反应程序在65。C进行45min,并且在80TC，保温2min， 4 °C,保存。
(4) 扩增反应结束，取体系液15pL,直接向扩增管中加入焚光染料 2juL 1000 xSYBR Green，震荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的反应 管呈橙黄色，有扩增反应的反应管将变为绿色。结果见图4，由图可以看 出，待测样品l为阳性样品，不含有转基因玉米MON863成分，样品2不含有 转基因玉米MON863成分。
实施例3
(1)试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和 lO倍ThermoPol Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜菜碱溶液； 0. 2mol/L MgS04溶液。
9(2) 扩增反应体系扩增反应的总体积为25yL，其各种成分分别为 10 x ThermoPol Buffer 2. 5 pL， 4mol/L甜菜碱6. 25pL， 0. 2mol/L MgS04, 混合引物O. 25niL , 10ymol/L dNTPs 3. 5nL， 8000U/L Bst DNA聚合酶 大片段2yL，模板DNA 5pL,用灭菌去离子水补齐到25juL，混合均匀、 离心(5000rpm，5秒)上机。
(3) 扩增反应程序在63lC进行60min，并且在8(TC，保温2min， 4 r,保存。
(4) 扩增反应结束，取体系液25 jaL经2。/。琼脂糖凝胶电泳分析，紫外 灯下观察结果。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应的反应管出 现阶梯状条带。结果见图5，三个样品都含有转基因玉米MON863成分。 实施例4
对比实验转基因玉米M0N86 3的定性PCR测定方法与本发明的测定方 法的对比
(1) 本发明方法试剂BioLabs (NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合 酶大片段和10倍ThermoPo1 Buffer溶液；特异性引物混合液；4mol/L甜 菜碱溶液；0. 2mol/L MgS04溶液；DNA模板包括含有转基因玉米M0N863成
份r/" o. i°/。、 o. oi°/。、 o. 001°/。、 o. oooi%、 oy。的样品。
(2) 本发明扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL，其各种成分 分別为10 x ThennoPol Buffer 2. 5 jiL， 4mol/L甜菜碱6. 25 jliL, 0. 2mol/L MgS04 0. 25 yL，混合引物ljnL， 10/imol/L dNTPs 3. 5jiL， 8000U/L Bst DM聚合酶大片段2jiL，模板DNA 5pL,用灭菌去离子水补齐到25卩L， 混合均匀后充分混匀、离心(8000rpm, 5秒)上机。
(3) 本发明扩增反应程序在63。C进行60min,并且在80。C保温2min， 4"C,保存；
(4) 本发明扩增反应结束，取反应产物4pL,经2%琼脂糖凝胶电泳 分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的反应管无明显条带，有扩增反应 的反应管出现阶梯状条带。结果见图6: 1,10%; 2,1%; 3,0.1°/。； 4,0.01%; 5， 0.001%; 6， 0. 0001%; 7，阴性对照；M, DL2000 DNA， Marker。(5 ) PCR方法反应引物采用本发明反应中 一对外引物扩增目标基因。 PCR反应为25 pL体系，IOxPCR buffer (Promega) 2. 5 pL， 10 mM dNTPs (Promega ) 0. 5 |i L，上游和下游引物(10 mM)各O. 5 p L, Taq酶(5 U/ jiL， Promega) 0.5 nL， DNA模板lpL，灭菌去离子水19.5 n L。反应程 序为95 。C预变性5min; 95'C变性30 s， 52匸退火30 s， 72匸延伸30s， 35 个循环；72 。C延伸7min。 PCR产物取IO p L于2。/。琼脂糖凝胶电泳，100 V电 压下40min,通过凝胶成像分析仪观察，结果见图7: 1,10%; 2,1%; 3,0.1%; 4,0.01%; 5， 0.001%; 6， 0. 0001%; 7，阴性对照；M， DL2000 DNA， Marker。 由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的 敏感度，能检测出转基因玉米MON8 6 3含量更低的样品。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在 不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明 的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于 本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限 制。序列表
<110> 天津市农业科学院中心实验室
<120> —种快速检测转基因玉米MON863的方法
<160> 4
<210> 1
<211> 20bp
<212> ■
<213> 人工序列
<權> 1
tcaaagatgg aatggcccag 20
<210> 2 <211> 19bp <212>画 <213>人工序列 <400> 2
tctttgagtg cccgtcgta 19
<210> 3 <211> 41bp <212> DNA <213>人工序列 <權> 3
ccggtcgtgc gtggtatgtt caaggttaac gtacgcgatg c 41
<210> 4 <211> 楊p<212> DNA <213> 人工序列 <400> 4
cgcaggtgcc agatcctcaa tggtacacta ggctgatcga 40
权利要求
1、用于检测转基因玉米MON863的特异性引物，其特征在于包括外引物正向序列5’-TCAAAGATGGAATGGCCCAG-3’，外引物反向序列5’-TCTTTGAGTGCCCGTCGTA-3’；内引物正向序列5’-CCGGTCGTGCGTGGTATGTTCAAGGTTAACGTACGCGATGC-3’，内引物反向序列5’-CGCAGGTGCCAGATCCTCAATGGTACACTAGGCTGATCGA-3’。
2、 一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因玉米MON863 方法，其特征在于包括如下步骤(1)将引物混合溶液及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模 板DNA，在63-65。C进行45-60min,并且在80。C持续2min, 4匸保存；其中的扩增反应体系扩增反应的总体积为25pL,其各种成分分别 为10xThermoPo1 Buffer 2.5yL， 4mol/L甜菜碱6.25jiL, 0. 2mol/L MgS04 0. 25 jnL，引物混合液lpL， 10 p mol/L dNTPs 3.5|nL， 8000U/L链 置换活性DM聚合酶l-2jaL，模板DM1-5mL，用灭菌去离子水补齐到 25juL，混匀、离心4000-8000rpm, 5—IO秒上才几；(2)扩增反应结束，取体系液3-25pL，采用不同方法判断扩增与否， 包括直接向扩增管中加入荧光染料SYBR Green，通过颜色变化观察有无 扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁白色沉淀物的量来观察有无扩增反 应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。
3、 如权利要求2所述的检测方法，其中所述的引物混合溶液指的是 将权利要求1所述的4条特异引物粉末分别配成浓度为100jamol/L的母 液，然后取外引物各lpL，内引物各8iaL，加灭菌去离子水2pL,充分混合，制得引物混合溶液。
4、 如权利要求2所述的检测方法，其中荧光染料SYBR Green浓度为1000倍，加入量为1-2pL。
5、 如权利要求2所述的检测方法，其中所迷的链置换活性的DM聚 合酶为8000U/L Bst DNA聚合酶大片段l-2|iL。
全文摘要
本发明公开了一种转基因玉米MON863的快速检测方法。其原理是采用4条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63℃-65℃对核酸进行扩增，45-60min扩增可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便等优点。
文档编号C12Q1/68GK101519693SQ200910068338
公开日2009年9月2日 申请日期2009年4月2日 优先权日2009年4月2日
发明者兰青阔, 珠 朱, 永 王, 奕 程, 新 赵 申请人:天津市农业科学院中心实验室