用于转基因油菜(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒的制作方法

专利名称：用于转基因油菜(籽)实时pcr检测的引物序列和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因的扩增与检测。
背景技术：
随着转基因产品不断商品化，其安全性问题一直被世人关注，并不断发生争议。为了保障人类的身体健康，消除消费者顾虑，有利于国际贸易和商品流通，以欧盟为代表的很多国家，在经历了短暂的争议后，对此类特殊产品都制定出安全管理条例，以便严格管理。欧洲、日本等多国还制定了相应的限量法规。我国农业部也于今年出台了转基因产品的管理办法。然而，要使消费者了解或接受转基因产品，各项法规能得以实施，除了给以相关信息及增加透明度外，关键问题是能够有相应的科学检测方法来分析与鉴别传统产品与转基因产品。尤其面对国内外贸易中对转基因产品的限量要求，更应有相应的、准确地定量方法对转基因产品，尤其是转基因食品进行定性、定量检测。在目前国内外常用的转基因产品的检测方法中，主要是以核酸为基础的PCR检测方法。PCR方法又分为定性PCR和定量PCR方法。定性PCR，即聚合酶链式反应PCR已广泛应用于基于核酸的各个研究和临床诊断等领域，该方法使用两段(约17～20多个核苷酸)寡核苷酸作为反应的引物，这两段寡核苷酸引物的序列应不发生互补作用。但它们可和称为模板的待测DNA两条链上在一定的位点分别发生互补。反应液包括含有镁离子的反应缓冲液、4种单核苷酸dNTP、模板DNA及引物。在DNA聚合酶催化下，通过温度的变化，DNA变性及退火，而合成两个互补位点之间的DNA片断。这样的反应反复进行，使第一个循环产生的DNA片断得以扩增。经25～30个循环，扩增倍数达106。用该方法检测转基因产品整个过程繁杂，操作步骤多，而且需要PCR后处理，如琼脂糖凝胶电脉和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或银染检测，不仅需要多种仪器，而且费时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。

发明内容
本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列和试剂盒，用于转基因产品定量检测的引物也可以对转基因产品进行定性检测，灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性，使检测方法操作简单、省时省力、结果可靠。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，用于检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因的上游引物序列是5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’，该引物的最小序列是5’-cca tca tact-3’；下游引物序列是5’-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3’，该引物的最小序列是5’-aag gca a-3’。
用于检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因的上游引物序列是5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’，该引物的最小序列是5’-aat ttt ctc-3’；下游引物序列是5’-gcc ttt tct tat cga cca tgt act c-3’，该引物的最小序列是5’-at cga cca-3’。
用于检测油菜(籽)内源基因(FatA)的上游引物序列是5’-ggt ctc tcagca agt ggg tga t-3’，该引物的最小序列是5’-gca agt g-3’；下游引物序列是5’-tcg tcc cga act tca tct gta a-3’，该引物的最小序列是5’-ga act tc-3’。
按上述引物序列制成的用于转基因油菜(籽)及其加工产品实时PCR检测的SYBR？Green荧光体系。
SYBRGreen染料能选择性结合双链DNA，并且由此而发出荧光，PCR扩增产物随着扩增循环次数的增加的同时，荧光信号随之也增强，因此，通过实时追踪荧光信号的强度就能精确计算出由单链寡核甘酸引物扩增的双链产物的数量，对于靶基因鉴定或少量反应时，SYBRGreen染料是一种理想的化学试剂。更重要的是SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，通过分析目的产物的熔解曲线，使用SYBRGreen染料可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差的缺点。SYBRGreen荧光体系不仅简单实用，而且其特异性随着所采用PCR引物的精心设计和筛选而得以保证，完全可以和荧光探针PCR媲美，具有较高的实用价值。
按上述引物序列制成的用于转基因油菜(籽)及其加工产品实时PCR检测的试剂盒。
本发明的有益效果是本发明通过检测作物本身所具有的内源参照基因(Endogenous Reference Gene)，如油菜(籽)FatA内源基因，一方面可以测定检查模板DNA的质量，另一方面可以测定样品中转基因作物和非转基因作物的总DNA模板量；通过检测转基因作物中转入的外源基因，如RT73品系外源结构基因、MS8品系外源结构基因，一方面可以测定是否有转基因成分存在，另一方面可以测定样品中转基因作物的DNA模板量，通过建立转基因作物标准参照样品的内源参照基因与外源基因Ct值之差(ΔCt)与转基因成分百分含量的标准曲线，可以计算出样品及其加工产品中转基因成分的百分含量。用于转基因产品定量检测的引物也可以对转基因产品进行定性检测，具有灵敏度高、避免交叉污染造成假阳性的优点。本发明实时PCR技术采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性。该技术巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增的缺点，更重要的是SYBRGreen染料在PCR反应中所要求的极端温度下同样十分稳定，通过分析目的产物的熔解曲线，使用SYBRGreen染料可有效区别特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体，以弥补其特异性差，检测技术快速和敏感，使得本方法具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。


图1为本发明SYBRGreen实时PCR检测原理示意图。
图2转基因产品和非转基因产品SYBRGreen实时PCR检测溶解曲线图。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但不限于实施例。
实施例1用于转基因油菜(籽)RT73品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因RT73品系的外源结构基因。
引物5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’、5’-gct tat acg aag gca agaaaa gga-3’。
试剂盒应用该引物序列采用常规制法制成的用于检测转基因油菜(籽)RT73品系的外源结构基因的试剂盒。
实施例2用于转基因油菜(籽)MS8品系的SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因(转基因成分)。
检测基因MS8品系外源结构基因。
引物5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’、5’-gcc ttt tct tat cga cca tgtact c-3’。
试剂盒应用该引物序列制成的用于检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因的试剂盒。
实施例3用于油菜(籽)SYBRGreen实时PCR检测的引物序列和试剂盒，按常规引物制备合成方法制造，检测转基因油菜(籽)内源基因。
检测基因FatA基因。
引物5’-ggt ctc tca gca agt ggg tga t-3’、5’-tcg tcc cga act tca tct gta a-3’。
试剂盒应用该引物序列制成的用于检测油菜(籽)内源FatA基因的试剂盒。
检测用主要仪器实时PCR仪、超净工作台、消毒灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机，Mini个人离心机、低温冰箱，冷藏冷冻冰箱、纯水器、双蒸水器、旋涡震荡器、微量进样器(0.5μL，2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL)等。
检测用主要试剂10×PCR缓冲液、MgCl2、dNTP(dATP、dUTP、dCTP、dGTP)、UNG酶(Uracil N-glycosylase)、Taq酶、SYBRGreen、引物(按引物序列制成试剂盒)等。
SYBRGreen实时PCR检验所用引物序列如实施例1～3所述。
SYBRGreen实时PCR反应体系
SYBRGreen实时PCR的反应参数为
上机运行按预先设定的样品摆放顺序将PCR反应管依次摆放，上机前注意检查各反应管是否盖紧，以免物质泄漏污染仪器，开始运行进行实时PCR反应。具体设置方法因仪器而异，应参照仪器使用说明书。
结果分析与计算定性分析基线的设置实时PCR反应结束并分析后，应设置无效基线范围。无论采用任何荧光通道基线范围选择在3-20个循环；阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值＝40为准。
结果判断待测样品外源基因检测Ct值≥40，内参照基因检测Ct值23-30者，表明未检出×××基因；待测样品外源基因检测Ct值28-34，内参照基因检测Ct值23-30者。表明检出×××基因。
定量分析用EXCEL或其它方法计算数据，可以创建以DNA浓度(x)对应循环数Ct值(Y)的标准曲线。对于样品DNA的浓度，可以根据回归方程logX＝Y-b/m计算(b为交叉点值，m为斜率)。ΔCt值＝外源基因Ct值-内源基因Ct值。将ΔCt值代入方程，即可得出样品中某一外源基因的相对含量。
如图2所示，外源基因出现PCR扩增，表明该样品检测出了外源转基因成分，即为转基因产品。未出现外源基因PCR扩增，表明该样品未检测出外源转基因成分。
权利要求
1.用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是用于检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因的上游引物的最大序列是5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’，最小序列是5’-cca tca tact-3’；下游引物的最大序列是5’-gct tat acg aag gca aga aaa gga-3’，最小序列是5’-aaggca a-3’。
2.根据权利要求1所述的用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是用于检测转基因油菜(籽)RT73品系外源结构基因的上游引物序列是5’-cca tat tga cca tca tact ca ttg ct-3’，下游引物序列是5’-gcttat acg aag gca aga aaa gga-3’。
3.用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是用于检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因的上游引物的最大序列是5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’，最小序列是5’-aat ttt ctc-3’；下游引物的最大序列是5’-gcc ttt tct tat cga cca tgt act c-3’，最小序列是5’-at cgacca-3’。
4.根据权利要求3所述的用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是用于检测转基因油菜(籽)MS8品系外源结构基因的上游引物序列是5’-gac ctt tgc aat ttt ctc ttc agt act-3’，下游引物序列是5’-gccttt tct tat cga cca tgt act c-3’。
5.用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是用于检测油菜(籽)内源基因(FatA)的上游引物的最大序列是5’-ggt ctc tcagca agt ggg tga t-3’，最小序列是5’-gca agt g-3’；下游引物的最大序列是5’-tcg tcc cga act tca tct gta a-3’，最小序列是5’-ga act tc-3’。
6.根据权利要求5所述的用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列，其特征是用于检测油菜(籽)内源基因(FatA)的上游引物序列是5’-ggt ctc tca gca agt ggg tga t-3’，下游引物序列是5’-tcg tcc cga acttca tct gta a-3’。1002 2001.7
7.根据权利要求1-6任一所述的用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列制成的用于转基因油菜(籽)SYBRGreen实时PCR检测的SYBRGreen荧光体系。
8.根据权利要求1-6任一所述的用于转基因油菜(籽)实时PCR检测的引物序列制成的用于转基因油菜(籽)SYBRGreen实时PCR检测的试剂盒。
全文摘要
用于转基因油菜(籽)SYBR
文档编号C12Q1/68GK1699600SQ200510046408
公开日2005年11月23日 申请日期2005年5月9日 优先权日2005年5月9日
发明者曹际娟, 刘善斌, 赵昕 申请人:曹际娟, 刘善斌, 赵昕