专利名称：一种非洲猪瘟病毒vp73基因的原核表达蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鉴定非洲猪瘟病 毒抗体的VP73基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。
背景技术：
非洲猪癌(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病。其临床症状主要特征包括高热、 病程短、高死亡率、内脏器官广泛性出血以及呼吸系统和神经系统功能改变等。由于该病高 传染性、高死亡率，给养猪业造成了巨大的经济损失，且野生宿主不可能被根除，因此对该 病的防控面临着巨大挑战。ASF尽管在我国从未发生，但随着国际间交往和进出口贸易的日益频繁，ASF跨边 境传播的风险越来越大，如不引起足够重视，一旦发生该病将导致灾难性后果。由于ASF保 护性免疫反应的复杂性，目前尚无理想的疫苗用于主动或被动免疫，防治上主要采用严格 的诊断和检疫措施，因此建立快速、无感染性的诊断方法对我国十分必要。
发明内容
本发明提供的非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法目的在于通 过大肠杆菌表达系统表达VP73蛋白，为建立ASFV的ELISA检测方法提供检测抗原。提供 一种无散毒危险、稳定性好、灵敏度高的原核表达检测抗原及其制备方法。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。非洲猪瘟病毒VP73基因片段含有1188个碱基，编码396个氨基酸残基，在用原核 表达载体PET3M进行表达时，VP73基因片段与融合表达载体上的硫氧还蛋白(Trx)得到 融合表达，融合蛋白Trx_VP73的分子量约为65KD。VP73基因片段的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列为1ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC1MASGGAFCLIANDGKADKI I61TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT21LAQDLLNSRISNIKNVNKSY121GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC41GKPDPEPTLSQIEETHLVHF181AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT61NAHFKPYVPVGFEYNKVRPH241ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT81TGTPTLGNKLTFGIPQYGDF301TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT
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381FIPGRPSRRNIRFKPff 本发明提供的非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法，其步骤如
1.人工合成VP73基因序列；
2.将VP73基因定向克隆至pET3h原核表达载体；
3.VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；
将重组表达载体pET3h-VP73转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)，进行表达。
4.VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括
(1)将E. coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以接种量，转接至新鲜 配制的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液体培养基200ml，37°C，250rpm振荡培养。
(2)待其 OD600 达至Ij 0. 8-1. 0，加入 IPTG 至终浓度 0. 2mmol/L,转移至 30°C，250rpm振荡培养4h，12000rpm, 4°C，3min离心收集菌体。(3)将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞 (360W, 30 %，5min重复5次)，4°C，12000rpm离心15min,弃上清，得包涵体沉淀。(4)将包涵体沉淀分别用含 2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea 的 PBS 洗 涤，离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0. 6mol/L NaCl,0. 05mol/L NaH2PO4, IOmM 咪唑，8mol/L Urea, pH 8. 0)。(5)包涵体溶解后，4°C，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预 先平衡)树脂结合1. 5h，用4体积分别含40，60，80，120，150, 200, 250mmol/L咪唑的漂洗、 洗脱缓冲液(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/LNaH2PO4,8mol/LUrea, pH 8. 0)漂洗、洗脱蛋白，收集 漂洗液和洗脱液，12% SDS-PAGE电泳检测和Western blot鉴定。5、表达产物的flfestern-blot鉴定(I)SDS-PAGE 将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V， 40min后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。(2)转膜采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。(3)封闭电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4°C摇床缓慢摇动过 夜。(4)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(5) 一抗孵育将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用BSA倍比稀释(1 3000), 摇床摇动Ih。(6)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(7) 二抗孵育将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用BSA倍比稀释(1 5000)，摇 床摇动Ih。(8)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(9)显色30mll XAP反应缓冲液buffer，BCIP.NBT各一管混勻，室温暗处缓慢摇
动显色。采用本发明的方法生产的产品可用于鉴别非洲猪瘟病毒抗体的间接-ELISA。本发明的优点体现在1、由于该检测抗原是非洲猪瘟VP73基因片段原核表达蛋白，并非全病毒，因此应 用该抗原进行检测时绝无散毒危险。2、作为ELISA检测的抗原检测非洲猪瘟病毒抗体，其检测灵敏度高，特异性强，与 猪瘟、猪细小、猪圆环、猪蓝耳、猪流感和猪伪狂犬等病毒血清无交叉反应。。
图ITrx蛋白和Trx_VP73融合蛋白的SDS-PAGE蛋白质电泳图谱图2Trx蛋白和Trx_VP73融合蛋白的Western blot鉴定图谱下面结合附图对本发明做进一步说明。图1为SDS-PAGE蛋白质电泳图谱，其中泳道1为泳道纯化的Trx蛋白；2为蛋白 质分子量标准，从上至下依次为94. OkDa, 66. 2kDa, 45. OkDa, 35. OkDa, 28. 5kDa, 20. OkDa, 14. 4kDa ；泳道3为融合蛋白Trx_VP73。
图2为Trx蛋白和I~rX-VP73融合蛋白的Wfestern blot鉴定图谱，其中泳道1为 纯化的Trx蛋白；2为蛋白质分子量标准，从上至下依次为100kDa，62kDa，40kDa，30kDa， 24kDa, 14KDa ；泳道 3 为融合蛋白 χ_νΡ73。
具体实施例方式本发明提供的一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白及其制备方法的具体 实施方式如下1.人工合成VP73基因序列；2.将VP73基因定向克隆至pET3h原核表达载体；3. VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；将重组表达载体pET3h_VP73转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE3)，进行表达。4. VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括(1)将E. coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以接种量，转接至新鲜 配制的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液体培养基200ml，37°C，250rpm振荡培养。(2)待其 OD6tltl 达到 0. 8-1. 0，加入 IPTG 至终浓度 0. 2mmol/L,转移至 30°C，250rpm 振荡培养4h，12000rpm, 4°C，3min离心收集菌体。(3)将得到的菌体重悬于100ml PBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞 (360W, 30 %，5min重复5次)，4°C，12000rpm离心15min,弃上清，得包涵体沉淀。(4)将包涵体沉淀分别用含 2mol/L Urea、4mol/L Urea、6mol/L Urea 的 PBS洗涤， 离心，去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/LNaH2PO4, IOmM 咪唑，8mol/L Urea, pH 8. 0)。(5)包涵体溶解后，4°C，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind(结合缓冲液预 先平衡)树脂结合1. 5h，用4体积分别含40，60，80，120，150, 200, 250mmol/L咪唑的漂洗、 洗脱缓冲液(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/L NaH2PO4,8mol/L Urea, pH 8.0)漂洗、洗脱蛋白，收 集漂洗液和洗脱液，12% SDS-PAGE电泳检测和非洲猪瘟阳性血清Western blot鉴定。5、表达产物的flfestern-blot鉴定(I)SDS-PAGE 将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V， 40min后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。(2)转膜采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。(3)封闭电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4°C摇床缓慢摇动过 夜。(4)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(5) 一抗孵育将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用BSA倍比稀释(1 3000), 摇床摇动Ih。(6)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(7) 二抗孵育将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用BSA倍比稀释(1 5000)，摇 床摇动Ih。(8)洗膜TTBS 洗膜 4 次，每次 lOmin。(9)显色30mll XAP反应缓冲液buffer，BCIP.NBT各一管混勻，室温暗处缓慢摇动显色。序列表<110>中国农业科学院饲料研究所<120> 一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白技其制备方法<160>1<210>1<211>1188<212>DNA<213> 非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)<400>1
0108]atggcatccggaggagctttttgtttgattgctaacgatggaaaggccgacaagattatc600109]ttggcccaagacttgttgaactctagaatttctaacattaaaaatgtcaacaaatcctat1200110]ggtaaaccagacccagaaccaactttgtcccaaatcgaagaaacacatttggttcatttc1800111]aatgctcattttaagccttatgttccagttggattcgaatacaataaggttagacctcat2400112]accggtaccccaaccttgggaaacaaattgacctttggtattccacagtacggagacttt3000113]ttccatgatatggtcggacaccatatcttgggtgcatgtcattcttcctggcaggatgct3600114]cctattcagggtaccgcccagatgggtgcccatggtcagttgcaaacctttcctagaaac4200115]ggatatgactgggacaaccaaacacctttggagggtgccgtttacaccttggttgatcca4800116]ttcggaagacctattgttccaggaacaaagaatgcttacagaaacttggtttactactgc5400117]gaatacccaggagaaagattgtatgaaaacgttagattcgatgttaatggaaattccttg6000118]gacgaatattcctctgatgtcacaaccttggtcagaaaattttgcatcccaggagataaa6600119]atgactggatataagcacttggtcggtcaggaggtttctgtcgagggaacttccggacct7200120]ttgttgtgcaacattcatgatttgcacaagcctcaccaatctaaacctattttgaccgat7800121]gaaaatgatacccagagaacctgctctcataccaaccctaaattcttgtcccaacatttt8400122]ccagagaactctcacaatatccaaacagcaggtaaacaagatattactcctattaccgac9000123]gcaacctatttggacatcagaagaaatgttcattactcttgtaatggacctcaaacccct9600124]aaatactatcagccacctttggctttgtggattaagttgagattttggttcaacgagaac10200125]gtcaacttggctattccatctgtttccattccattcggtg agagattcatcaccatcaaa10800126]ttggcatctcaaaaggatttggtcaatgaatttcctggattgttcatcag acagtctaga11400127]ttcatccctggaagaccatccagaagaaatatcagattca aaccatgg1188
权利要求
1.一种非洲猪瘟病毒VP73基因的原核表达蛋白，其特征是该重组表达蛋白为硫氧还 蛋白与非洲猪瘟病毒VP73基因编码的融合蛋白，其中非洲猪瘟病毒VP73基因的核苷酸序 列为1 ATGGCATCCGGAGGAGCTTTTTGTTTGATTGCTAACGATGGAAAGGCCGACAAGATTATC 61 TTGGCCCAAGACTTGTTGAACTCTAGAATTTCTAACATTAAAAATGTCAACAAATCCTAT 121 GGTAAACCAGACCCAGAACCAACTTTGTCCCAAATCGAAGAAACACATTTGGTTCATTTC 181 AATGCTCATTTTAAGCCTTATGTTCCAGTTGGATTCGAATACAATAAGGTTAGACCTCAT 241 ACCGGTACCCCAACCTTGGGAAACAAATTGACCTTTGGTATTCCACAGTACGGAGACTTT 301 TTCCATGATATGGTCGGACACCATATCTTGGGTGCATGTCATTCTTCCTGGCAGGATGCT 361 CCTATTCAGGGTACCGCCCAGATGGGTGCCCATGGTCAGTTGCAAACCTTTCCTAGAAAC 421 GGATATGACTGGGACAACCAAACACCTTTGGAGGGTGCCGTTTACACCTTGGTTGATCCA 481 TTCGGAAGACCTATTGTTCCAGGAACAAAGAATGCTTACAGAAACTTGGTTTACTACTGC 541 GAATACCCAGGAGAAAGATTGTATGAAAACGTTAGATTCGATGTTAATGGAAATTCCTTG 601 GACGAATATTCCTCTGATGTCACAACCTTGGTCAGAAAATTTTGCATCCCAGGAGATAAA 661 ATGACTGGATATAAGCACTTGGTCGGTCAGGAGGTTTCTGTCGAGGGAACTTCCGGACCT 721 TTGTTGTGCAACATTCATGATTTGCACAAGCCTCACCAATCTAAACCTATTTTGACCGAT 781 GAAAATGATACCCAGAGAACCTGCTCTCATACCAACCCTAAATTCTTGTCCCAACATTTT 841 CCAGAGAACTCTCACAATATCCAAACAGCAGGTAAACAAGATATTACTCCTATTACCGAC 901 GCAACCTATTTGGACATCAGAAGAAATGTTCATTACTCTTGTAATGGACCTCAAACCCCT 961 AAATACTATCAGCCACCTTTGGCTTTGTGGATTAAGTTGAGATTTTGGTTCAACGAGAAC 1021 GTCAACTTGGCTATTCCATCTGTTTCCATTCCATTCGGTGAGAGATTCATCACCATCAAA 1081 TTGGCATCTCAAAAGGATTTGGTCAATGAATTTCCTGGATTGTTCATCAGACAGTCTAGA 1141 TTCATCCCTGGAAGACCATCCAGAAGAAATATCAGATTCAAACCATGG
2.一种制备权利要求1所述的硫氧还蛋白与非洲猪瘟病毒VP73基因编码的融合蛋白 的方法，其特征是(1)人工合成VP73基因序列；(2)将VP73基因定向克隆至pET3h原核表达载体；(3)VP73基因在大肠杆菌的诱导表达；将重组表达载体pET3h-VP73转化大肠杆菌E. coliBL21 (DE3) 7809，进行表达。(4)VP73基因表达蛋白的亲和层析纯化，主要包括a.将E.coli BL21/pET32aVP73转化子的过夜培养物，以1 %接种量，转接至新鲜配制 的含有Amp (100 μ g/ml)的TB液体培养基200ml，37°C，250rpm振荡培养。b.待其OD600达到0.8-1. 0，加入IPTG至终浓度0. 2mmol/L,转移至30°C，250rpm振荡 培养4h, 12000rpm, 4°C，3min离心收集菌体。c.将得到的菌体重悬于100mlPBS中，冰上放置30min，超声裂解破碎细胞(360W， 30 %，5min重复5次)，4°C，12000rpm离心15min,弃上清，得包涵体沉淀。d.将包涵体沉淀分别用含2mol/LUrea,4mol/L Urea,6mol/L toea的PBS洗涤，离心， 去上清。然后将包涵体溶解于40ml结合缓冲液中(0. 6mol/LNaCl，0. 05mol/LNaH2P04，10mM 咪唑，8mol/L Urea, pH8. 0)。e.包涵体溶解后，4°C，12000rpm离心15min，取上清，与His-Bind (结合缓冲液预先平 衡)树脂结合1. 5h，用4体积分别含40，60，80，120，150, 200, 250mmol/L咪唑的漂洗、洗脱 缓冲液(0. 6mol/LNaCl,0. 05mol/LNaH2PO4,8mol/L Urea, ρΗ8· 0)漂洗、洗脱蛋白，收集漂洗 液和洗脱液。12% SDS-PAGE电泳检测后，收集目的蛋白即为纯化蛋白。 (5)表达产物的flfestern-blot鉴定，主要包括a.SDS-PAGE 将制备好的蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内，电压80V，40min 后调为180V直到电泳结束(整个过程在冰上进行)。b.转膜采用半干转膜仪10V，40min转至PVDF膜上。c.封闭电转后的膜，靠近胶面的膜面朝上，加入封闭液，4°C摇床缓慢摇动过夜。d.洗膜TTBS洗膜4次，每次lOmin。e.一抗孵育将非洲猪瘟病毒的标准阳性血清用BSA倍比稀释(1 3000)，摇床 摇动Ih。f.洗膜=TTBS洗膜4次，每次IOmin0g.二抗孵育将碱性磷酸酶标记兔抗猪二抗用BSA倍比稀释(1 5000)，摇床摇 动Ih0h.洗膜=TTBS洗膜4次，每次IOmin0i.显色30mllXAP反应缓冲液buffer，BCIP、NBT各一管混勻，室温暗处缓慢摇动显色。结果，纯化后的Trx_VP73融合蛋白与非洲猪瘟病毒阳性血清有特异性反应条带。
全文摘要
本发明涉及的是一种基因工程制品的制备方法，具体地说是一种鉴定非洲猪瘟病毒抗体的VP73基因序列原核表达蛋白抗原及其制备方法。根据GenBank中非洲猪瘟病毒(ASFV)VP73基因序列，人工合成的VP73基因全长序列，构建了重组表达载体pET32a-VP73，测序验证后转化原核表达受体菌E.coli BL21(DE3)，IPTG诱导表达，重组融合蛋白分子量约65KD。经镍柱亲和层析纯化的蛋白能与ASFV阳性血清发生特异性的免疫印迹反应并且与猪瘟、猪细小、猪圆环、猪蓝耳、猪流感和猪伪狂犬等病毒血清无交叉反应。实验表明，表达的蛋白具有检测灵敏度高，特异性强，应用该抗原进行检测时绝无散毒危险，可作为鉴定非洲猪瘟病毒抗体的ELISA方法的检测抗原。
文档编号C07K19/00GK102101889SQ20091025059
公开日2011年6月22日 申请日期2009年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者李秋霞, 杨雅麟, 滕达, 王建华, 田子罡 申请人:中国农业科学院饲料研究所