专利名称：一种铁离子固定化亲和色谱整体柱的制备方法
技术领域：
本发明涉及用于在线或离线磷酸化肽段选择性富集分离的固定化亲和色谱整体 柱，具体地说是一种铁离子固定化亲和色谱整体柱的制备。
背景技术：
蛋白质磷酸化是最普遍的翻译后修饰之一，在生命过程中扮演着信号传导、代谢 调节、细胞功能调控等重要作用。然而，磷酸化蛋白/肽段通常含量较低，在质谱分析中常 受到大量非磷酸化蛋白/肽段的干扰。因此，发展针对磷酸化肽段的选择性富集技术对于 深入开展磷酸化蛋白质组研究至关重要。基于固载金属离子与磷酸根间的特异相互作用的固定化金属亲和色谱是目 前最常用的磷酸化富集技术之一(Chaga G S. J. Biochem. Biophys. Methods. 2001,49, 313-334)。次氨基三乙酸是一种具有四齿结构的螯合化合物，其与金属离子的结合能力要 大于三齿配体亚氨基二乙酸。因此，目前以次氨基三乙酸为配体，以硅胶、树脂或琼脂糖 为基质材料的固定化金属亲和色谱材料已成功用于磷酸化肽段的选择性富集(Dunn J D； Watson J T ；Bruening M L. Anal. Chem. 2006，78，1574-1580)。然而尽管硅胶具有较好的机 械性能，但耐酸碱性能差；树脂和琼脂糖适用的PH范围较宽，但机械强度差。近年来，有机聚合物整体材料因具有制备简单、结构容易控制、易实现化学修饰、 传质效率高及耐酸碱等优点受到广泛关注(Vizioli N M，RusellM L ；Carbajal M L ； Carducci C N ；Grasselli M. Electrophoresis，2005，26，2942-2948)。然而现有的有机 聚合物整体材料的功能基团一般为传统的环氧基，其表面官能团活性低，需经过高温以及 强酸碱处理以进行化学修饰(Duan J C ；Sun L L ；Liang Z ；Zhang J ；Wang H ；Zhang L H ； Zhang W B ；ZhangY K. J. Chromatogr. A, 2006，1106，165-174)。这不仅会影响材料的结构以 及基质与管壁的键合，而且操作步骤繁琐、反应时间长、制备的材料重现性较差。在磷酸化 蛋白组学研究中，磷酸化肽段富集的重现性是获得可靠分析结果的必需条件。因此，发展具 有高活性官能团的固定化金属离子亲和色谱整体柱对于实现磷酸化肽段分离鉴定具有重 要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种铁离子固定化亲和色谱整体柱的制备方法，以期解决 金属离子固定化亲和色谱整体柱制备过程中化学修饰时间长，操作过程繁琐，固定化金属 离子亲和色谱整体柱制备重现性差，所得亲和色谱整体柱性能不稳定等缺点。该铁离子固 定化亲和色谱整体柱主要用于在线或离线选择性富集磷酸肽。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为根据样品预处理量的不同选用不同管径的熔融毛细管柱。以N-丙烯酰氧基琥珀 酰亚胺为功能单体，乙叉二甲基丙烯酸乙酯为交联剂，环己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰 胺的混合物为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂聚合而得的多孔整体柱基质。整体柱基质继而通过表面修饰反应，使其表面键合上含羧基的功能团，以用于后续的铁离子固定。最后通 入含铁离子的溶液，实现铁离子的固定化。具体为1)将N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺、乙叉二甲基丙烯酸乙酯、环己醇、十二醇、N，N-二 甲基甲酰胺、偶氮二异丁腈混合均勻后，于室温下通氮气以除去溶解其中的氧气；随后将该 反应液通入处理后的熔融石英毛细管中，并立即用硅橡胶封闭毛细管两端，置于52-58°C水 浴中反应14-1 完成基质聚合反应。3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于功能单体、交联剂和致孔剂三者之间的质量比例范围为 2 · 3 · 5 2 · 2 · 2 · 9 · 4 · 9 ；致孔剂中环己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰胺三者之间的质量比例范围为 76 9 15-72 8 20 ；引发剂的用量为功能单体、交联剂和致孔剂三者总质量的0. 5-1. 0%。2)表面修饰反应过程在填充了基质材料的毛细管中通入0. 02-0. 2mol/L的N， N- 二羧基甲基-L-赖氨酸溶液，溶液的pH值为8-10. 0，在室温下反应0. 5-2h,进行基质表 面的化学修饰；整体柱基质通过表面修饰反应，使其表面键合上含羧基的功能团，以用于后 续的铁离子固定。在整体柱基质通过表面修饰反应后，用甲酸体积分数为0. 05-0. 2%的溶液冲洗基 质材料至流出液为酸性。3)铁离子的固定化过程在填充了基质材料的毛细管中通入0. 05-0. 2mol/L的 三价可溶性铁盐溶液，实现铁离子的固定化；在室温下，使溶液缓慢流过色谱柱，反应时间 0.5-2h。可溶性铁盐为三氯化铁、硝酸铁、硫酸铁或其他可溶于水的三价铁盐中的一种或 多种；制备好的铁离子固定化亲和色谱整体柱用甲酸体积分数为0. 05-0. 2%的溶液冲 洗，去除游离的铁离子。制备得到的铁离子固定化亲和色谱整体柱可用于在线或离线的磷酸化肽段选择 性富集分离，使用后的铁离子固定化亲和色谱整体柱可通过重复铁离子的固定化过程实现 再生。本发明的优点为(1)本方法制备方法简便，步骤少；( 制备的整体柱基质微观 结构均一；C3)制备的整体柱对磷酸化肽段具有较好的选择性和较高的富集容量；(4)制备 的整体柱对生物大分子具有较快的传质速率。
图1是铁离子固定化亲和色谱整体柱基质的扫描电镜图(a，X 350 ；b, X 2000)。
具体实施例方式按照如下步骤制备一种铁离子固定化亲和色谱整体柱。取熔融石英毛细管，按以下步骤进行预处理依次用100倍柱体积的0. lmol/L盐酸溶液、去离子水、0. lmol/L氢氧化钠溶液、去离子水和甲醇冲洗后，置于120°C加热炉中， 用氮气吹干；然后将含3-(三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯体积分数为50%的丙酮溶 液充满整个毛细管，两端用硅橡胶封口后于室温反应Mh ；最后再用10倍柱体积的丙酮冲 洗，并于室温下用氮气吹扫池。毛细管两端封口后待用。配制基质反应溶液，其中各组分的最终质量浓度分别为N-丙烯酰氧基琥珀酰亚 胺为16%，乙叉二甲基丙烯酸乙酯为对％，致孔剂为60% (致孔剂为环己醇、十二醇和N， N- 二甲基甲酰胺按照质量比76、9、15混合而得的混合物)，；最后再添加引发剂偶氮二异丁 腈，其质量为上述基质反应溶液总质量的1%。以上各组分在室温下混合均勻后通氮气5min以除去溶解其中的氧气。将该反应 液通入处理后的熔融石英毛细管中，并立即用硅橡胶封闭毛细管两端，置于55°C水浴中反 应16h，完成基质聚合反应。随后取出毛细管通入0. lmol/L的N，N-二羧基甲基-L-赖氨 酸溶液，该溶液的PH值为10.0，在室温下反应lh，进行基质表面化学修饰反应。最后用甲 酸体积分数为0. 的溶液冲洗基质材料至流出液为酸性后，通入0. lmol/L的三氯化铁溶 液，实现铁离子的固定化。制备好的铁离子固定化亲和色谱整体柱用甲酸体积分数为0. 1 % 的溶液冲洗，去除游离的铁离子后保存于4°C甲酸体积分数为0. 的溶液中。应用例1以本发明的铁离子固定化亲和色谱整体柱为在线或离线磷酸化肽段捕集柱，以含 甲酸体积分数为0. 的水溶液为上样缓冲溶液，可在30min内实现对蛋白样品中磷酸化 肽段的选择性捕集。本发明的优点为制备方法简便，所得基质材料微观结构均一。与其他金属离子固 定化亲和色谱整体柱制备方法相比，本方法所得铁离子固定化亲和色谱整体柱制备重现性 好，整体柱性能稳定，对磷酸化肽段有很好的特异性富集能力。
权利要求
1.一种铁离子固定化亲和色谱整体柱的制备方法，其特征在于首先在毛细管中以N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺为功能单体，乙叉二甲基丙烯酸乙酯为 交联剂，环己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰胺的混合物为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂 聚合而得的多孔整体柱基质；整体柱基质继而通过表面修饰反应，使其表面键合上含羧基的功能团，以用于后续的 铁离子固定；最后通入含铁离子的溶液，实现铁离子的固定化，完成铁离子固定化亲和色谱 整体柱的制备。
2.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于功能单体、交联剂和致孔剂三者之间的质量比例范围为2 3 5-2.2 2.9 4.9;致孔剂中环己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰胺三者之间的质量比例范围为 76 9 15-72 8 20 ；聚合反应过程为，将反应液通入处理后的熔融石英毛细管中，并立即用硅橡胶封闭毛 细管两端，置于52-58°C水浴中反应14-1他，完成基质聚合反应。
3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于引发剂的用量为功能单体、交联剂和致孔剂三者总质量的0. 5-1. 0%。
4.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述表面修饰反应过程为，在填充了基质材料的毛细管中通入0. 02-0. 2mol/L的N， N- 二羧基甲基-L-赖氨酸溶液，溶液的pH值为8-10. 0，在室温下反应0. 5-2h,进行基质表 面的化学修饰；整体柱基质通过表面修饰反应，使其表面键合上含羧基的功能团，以用于后 续的铁离子固定。
5.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于在整体柱基质通过表面修饰反应后，用甲酸体积分数为0. 05-0. 2%的溶液冲洗基质材 料至流出液为酸性。
6.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述铁离子的固定化过程为，在填 充了基质材料的毛细管中通入0. 05-0. 2mol/L的三价可溶性铁盐溶液，实现铁离子的固定 化；在室温下，使溶液缓慢流过色谱柱，反应时间0. 5-池。
7.按照权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于制备好的铁离子固定化亲和色 谱整体柱用甲酸体积分数为0. 05-0. 2%的溶液冲洗，去除游离的铁离子。
8.按照权利要求6所述的制备方法，其特征在于可溶性铁盐为三氯化铁、硝酸铁、硫 酸铁或其他可溶于水的三价铁盐中的一种或多种。
9.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备得到的铁离子固定化亲和色谱 整体柱可用于在线或离线的磷酸化肽段选择性富集分离，使用后的铁离子固定化亲和色谱 整体柱可通过重复权利要求6的铁离子的固定化过程实现再生。
全文摘要
本发明涉及一种固定化亲和色谱整体柱的制备方法，首先在毛细管中以N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺为功能单体，乙叉二甲基丙烯酸乙酯为交联剂，环己醇、十二醇和N，N-二甲基甲酰胺的混合物为致孔剂，偶氮二异丁腈为引发剂聚合而得的多孔整体柱基质；整体柱基质继而通过表面修饰反应，使其表面键合上含羧基的功能团，以用于后续的铁离子固定；最后通入含铁离子的溶液，实现铁离子的固定化，完成铁离子固定化亲和色谱整体柱的制备。本发明的优点为制备方法简便，所得基质材料微观结构均一。与其他金属离子固定化亲和色谱整体柱制备方法相比，本方法所得铁离子固定化亲和色谱整体柱制备重现性好，整体柱性能稳定，对磷酸化肽段有很好的特异性富集能力。
文档编号C07K1/22GK102108095SQ20091024884
公开日2011年6月29日 申请日期2009年12月28日 优先权日2009年12月28日
发明者张丽华, 张丽媛, 张玉奎, 梁振, 王晖 申请人:中国科学院大连化学物理研究所