专利名称：柱切换-液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法
技术领域：
本发明涉及柱切换技术应用和手性药物对映体领域，尤其涉及柱切换-液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法。
背景技术：
从上世纪几起震惊世界的药害事件起，人们逐渐认识到手性药物对映体之间立体构型上的微小不同，导致其在人体内的药理活性、代谢过程及毒性等方面均存在显著差异。随着科学技术的不断发展，对手性药物单一对映体进行更加深入的体内研究，为评价手性药物各对映体之间的生物学活性，阐明手性对映体之间的作用差异及开发单一对映体新药均具有十分重大的意义。手性药物各对映体的物理化学性质相似，仅旋光性不同，分析测定难度大，目前主要利用现代色谱技术(如高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱、高速逆流色谱法、模拟移动床色谱法等)实现对各对映体的拆分测定；但单一对映体的体内浓度测定方法则以高效液相色谱法、液相色谱_串联质谱法为主。生物体液中基质成分复杂，单一对映体的浓度低，其分析测定均存在样品前处理步骤复杂繁琐、样品损耗大、方法回收率及准确度低、耗费时间、耗费溶剂等一系列问题，因此建立一种生物体液中快速、灵敏、准确的单一对映体分析测定方法是十分有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、方便、灵敏的柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法。为解决上述问题，本发明所述的柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品在5 30°C的温度下用无水乙醇溶解，制成浓度为 4mg/mL 5mg/mL的标准溶液；该标准溶液在5 30°C的温度下用空白血浆稀释，制成浓度为0. 5mg/mL 1. 5mg/mL的血浆样品；(2)将所述血浆样品置ImL 5mL具塞离心试管中，以1000 8000r/min的转速离心3 lOmin，精密吸取上清液置于一离心试管中作进样备用；(3)制备限进填料柱将粒径为5μπι的硅胶外表面键合亲水性的聚乙烯醇，其内表面键合非极性的己胺，形成内径为4. 6mm、长度为45mm的内表面反相限进填料柱；(4)制备手性固定相将粒径为5 μ m的硅胶表面涂覆有3，5- 二甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性AE. Lichrom CE 4色谱柱构成手性固定相I ；将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色谱柱构成手性固定相II ；(5)将所述手性固定相I和所述手性固定相II分别与所述限进填料柱相连，并将所述限进填料柱作为预处理柱、所述手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料-手性固定相高效液相色谱系统中；所述预处理柱与所述分析柱之间通过聚醚醚酮(PEEK)树脂管连接，该聚醚醚酮(PEEK)树脂管上设有切换阀；所述分析柱外接紫外检测器；(6)将所述步骤(2)所得的血浆样品上清液注入到所述柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇或水-甲醇为预处理柱流动相， 以硼酸盐缓冲液_异丙醇_无水乙醇为分析柱流动相，在紫外检测波长为230 350nm、预处理流动相流速为0. 5mL/min 2. OmL/min、分析流动相流速为0. 5mL/min 2. OmL/min、 温度为15 40°C的条件下进行分离，得到不同出峰时间不同单一对映体的色谱图。所述步骤(1)中的手性药物消旋体标准品是指盐酸普萘洛尔消旋体标准品。所述步骤(5)中的切换阀的切换时间为Imin 5min。所述步骤(6)中预处理柱流动相中的硼酸盐缓冲液与甲醇或水与甲醇的体积比为30 98 2 70。所述步骤(6)中分析柱流动相中的硼酸盐缓冲液与异丙醇、乙醇的体积比为10 70 10 40 20 50。所述硼酸盐缓冲液是指将0. 05mol/L的硼砂溶液与0. 2mol/L的硼酸溶液按照 1 8 2 9的体积比配制的pH值为7. O 9. 5的溶液。本发明与现有技术相比具有以下优点1、限进填料是一个新的色谱填料家族，它们的分离机制主要是通过对填料外表面进行适当的亲水性修饰，使得生物样品溶液中的大分子不能进入填料的内孔中去，生物大分子在近乎死体积的情况下被洗脱除去，而该类填料的内孔表面仍为反相萃取剂性质，被分析物则通过疏水作用和静电作用被保留。柱切换技术是通过改变切换阀的位置，实现进样器、不同色谱柱、检测器之间的变换连接，从而实现被分析物与其它干扰成分的分离，达到纯化与富集的目的，进而完成对被分析物的浓度测定。本发明建立了新的柱切换限进填料-手性固定相液相色谱模式，该模式利用柱切换技术，实现生物体液中手性药物单一对映体浓度的快速、在线检测。该模式可实现复杂样品的直接进样分析，实现被分析物与生物体液中其它无效成分的在线分离，减少了传统的离线生物样品制备方法中繁琐的步骤，避免了被分析物由于前处理所造成的损失，缩短了分析时间，提高了自动化程度，实现了快速、方便、灵敏的手性药物对映体浓度的在线检测。 实验证明该模式在生物体液中手性药物单一对映体的分析检测中具有巨大的优越性。2、本发明利用PEEK管连接切换阀的接口，形成切换阀在不同位置时，限进填料柱、手性固定相、检测器流路之间的改变，通过改变切换阀的位置，从而实现生物体液中手性药物单一对映体浓度的快速、在线测定。3、本发明具有特异性高、重现性好、灵敏度高、分析速度快，操作简单等特点，并可适用于手性药物单一对映体的药代动力学研究。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明实施例1空白血浆的色谱图。图2为本发明实施例lR(+)-、S(-)_普萘洛尔对映体的色谱图。图3为本发明实施例2空白血浆的色谱图。
图4为本发明实施例2R(+)_、S(-)_普萘洛尔对映体的色谱图。图5为本发明实施例3R(+)_、S(-)_普萘洛尔对映体的色谱图。图6为本发明实施例4R(+)_、S(-)_普萘洛尔对映体的色谱图。
具体实施例方式实施例1柱切换-液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品——盐酸普萘洛尔消旋体标准品在20°C的温度下用无水乙醇溶解，制成浓度为5mg/mL的标准溶液；该标准溶液在20°C的温度下用空白血浆 (参见图1)稀释，制成浓度为0. 5mg/mL的血浆样品。(2)将血浆样品置1. 5mL具塞离心试管中，以4000r/min的转速离心5min，精密吸
取上清液置于一离心试管中作进样备用。(3)制备限进填料柱将粒径为5μπι的硅胶外表面键合亲水性的聚乙烯醇，其内表面键合非极性的己胺，形成内径为4. 6mm、长度为45mm的内表面反相限进填料柱。(4)制备手性固定相将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性AE. Lichrom CE 4色谱柱构成手性固定相I ；将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色谱柱构成手性固定相II。(5)将手性固定相I和手性固定相II分别与限进填料柱相连，并将限进填料柱作为预处理柱、手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中；预处理柱与分析柱之间通过聚醚醚酮(PEEK)树脂管连接，该聚醚醚酮(PEEK)树脂管上设有切换阀；分析柱外接紫外检测器。切换阀的切换时间为Imin 5min。利用PEEK管连接切换阀，实现分析流路的改变，通过改变切换阀的位置，实现预处理柱的除去血浆中的干扰物质及血浆中盐酸普萘洛尔对映体浓度的测定。(6)将步骤(2)所得的血浆样品上清液注入到柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇为预处理柱流动相，以硼酸盐缓冲液-异丙醇-无水乙醇为分析柱流动相，在紫外检测波长为293nm、预处理流动相流速为LOmL/ min、分析流动相流速为0. SmL/min、温度为25°C的条件下进行分离，得到R(+)_普萘洛尔对映体的出峰时间在16. 5 18. 9min范围内、S (-)-普萘洛尔对映体的出峰时间在19. 0 22. 2min范围内色谱图(参见图2)。其中预处理柱流动相中的硼酸盐缓冲液与甲醇的体积比(mL/mL)为95 5。分析柱流动相中的硼酸盐缓冲液与异丙醇、乙醇的体积比(mL/mL)为 40 30 30。硼酸盐缓冲液是指将0. 05mol/L的硼砂溶液与0. 2mol/L的硼酸溶液按照1 9 的体积比(mL/mL)配制的pH值为8. 5的溶液。实施例2柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品——盐酸普萘洛尔消旋体标准品在30°C的温度下用无水乙醇溶解，制成浓度为4mg/mL的标准溶液；该标准溶液在30°C的温度下用空白血浆(参见图3)稀释，制成浓度为1. 5mg/mL的血浆样品。(2)将血浆样品置2. OmL具塞离心试管中，以2000r/min的转速离心3min，精密吸
取上清液置于一离心试管中作进样备用。(3)制备限进填料柱将粒径为5μπι的硅胶外表面键合亲水性的聚乙烯醇，其内表面键合非极性的己胺，形成内径为4. 6mm、长度为45mm的内表面反相限进填料柱。(4)制备手性固定相将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性AE. Lichrom CE 4色谱柱构成手性固定相I ；将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色谱柱构成手性固定相II。(5)将手性固定相I和手性固定相II分别与限进填料柱相连，并将限进填料柱作为预处理柱、手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中；预处理柱与分析柱之间通过聚醚醚酮(PEEK)树脂管连接，该聚醚醚酮(PEEK)树脂管上设有切换阀；分析柱外接紫外检测器。切换阀的切换时间为Imin 5min。利用PEEK管连接切换阀，实现分析流路的改变，通过改变切换阀的位置，实现预处理柱的除去血浆中的干扰物质及血浆中盐酸普萘洛尔对映体浓度的测定。(6)将步骤(2)所得的血浆样品上清液注入到柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇为预处理柱流动相，以硼酸盐缓冲液-异丙醇-无水乙醇为分析柱流动相，在紫外检测波长为230nm、预处理流动相流速为1. 2mL/ min、分析流动相流速为1. OmL/min、温度为30°C的条件下进行分离，得到R(+)_普萘洛尔对映体的出峰时间在25. O 28. 2min范围内、S (-)-普萘洛尔对映体的出峰时间在28. 2 31. 3min范围内色谱图(参见图4)。其中预处理柱流动相中的硼酸盐缓冲液与甲醇或水与甲醇的体积比为90 10。分析柱流动相中的硼酸盐缓冲液与异丙醇、乙醇的体积比为50 20 30。硼酸盐缓冲液是指将0. 05mol/L的硼砂溶液与0. 2mol/L的硼酸溶液按照8 2 的体积比配制的PH值为9. O的溶液。实施例3柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品——盐酸普萘洛尔消旋体标准品在5°C的温度下用无水乙醇溶解，制成浓度为4. 5mg/mL的标准溶液；该标准溶液在5°C的温度下用空白血浆稀释，制成浓度为1. Omg/mL的血浆样品。(2)将血浆样品置ImL具塞离心试管中，以lOOOr/min的转速离心lOmin，精密吸
取上清液置于一离心试管中作进样备用。(3)制备限进填料柱将粒径为5μπι的硅胶外表面键合亲水性的聚乙烯醇，其内表面键合非极性的己胺，形成内径为4. 6mm、长度为45mm的内表面反相限进填料柱。(4)制备手性固定相将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性AE. Lichrom CE 4色谱柱构成手性固定相I ；将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色谱柱构成手性固定相II。(5)将手性固定相I和手性固定相II分别与限进填料柱相连，并将限进填料柱作为预处理柱、手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中；预处理柱与分析柱之间通过聚醚醚酮(PEEK)树脂管连接，该聚醚醚酮(PEEK)树脂管上设有切换阀；分析柱外接紫外检测器。切换阀的切换时间为Imin 5min。利用PEEK管连接切换阀，实现分析流路的改变，通过改变切换阀的位置，实现预处理柱的除去血浆中的干扰物质及血浆中盐酸普萘洛尔对映体浓度的测定。(6)将步骤(2)所得的血浆样品上清液注入到柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇或水-甲醇为预处理柱流动相，以硼酸盐缓冲液_异丙醇_无水乙醇为分析柱流动相，在紫外检测波长为350nm、预处理流动相流速为0. 5mL/min、分析流动相流速为0. 5mL/min、温度为15°C的条件下进行分离，得到R(+) _普萘洛尔对映体的出峰时间在33. 7 37. 4min范围内、S (-)-普萘洛尔对映体的出峰时间在 37. 4 42. Imin范围内色谱图(参见图5)。其中预处理柱流动相中的水与甲醇的体积比为98 2。分析柱流动相中的硼酸盐缓冲液与异丙醇、乙醇的体积比为70 10 20。硼酸盐缓冲液是指将0. 05mol/L的硼砂溶液与0. 2mol/L的硼酸溶液按照5 5 的体积比配制的PH值为7. 0的溶液。实施例4柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品——盐酸普萘洛尔消旋体标准品在25°C的温度下用无水乙醇溶解，制成浓度为5mg/mL的标准溶液；该标准溶液在25°C的温度下用空白血浆稀释，制成浓度为0. 5mg/mL的血浆样品。(2)将血浆样品置5mL具塞离心试管中，以8000r/min的转速离心4min，精密吸取
上清液置于一离心试管中作进样备用。(3)制备限进填料柱将粒径为5μπι的硅胶外表面键合亲水性的聚乙烯醇，其内表面键合非极性的己胺，形成内径为4. 6mm、长度为45mm的内表面反相限进填料柱。(4)制备手性固定相将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有3，5-二甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性AE. Lichrom CE 4色谱柱构成手性固定相I ；将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色谱柱构成手性固定相II。(5)将手性固定相I和手性固定相II分别与限进填料柱相连，并将限进填料柱作为预处理柱、手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中；预处理柱与分析柱之间通过聚醚醚酮(PEEK)树脂管连接，该聚醚醚酮(PEEK)树脂管上设有切换阀；分析柱外接紫外检测器。切换阀的切换时间为Imin 5min。利用PEEK管连接切换阀，实现分析流路的改变，通过改变切换阀的位置，实现预处理柱的除去血浆中的干扰物质及血浆中盐酸普萘洛尔对映体浓度的测定。(6)将步骤(2)所得的血浆样品上清液注入到柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇或水-甲醇为预处理柱流动相，以硼酸盐缓冲液_异丙醇_无水乙醇为分析柱流动相，在紫外检测波长为300nm、预处理流动相流速为2. OmL/min、分析流动相流速为2. OmL/min、温度为40°C的条件下进行分离，得到R(+) _普萘洛尔对映体的出峰时间在15. 5 17. 3min范围内、S (-)-普萘洛尔对映体的出峰时间在17. 3 20. 8min范围内色谱图(参见图6)。其中预处理柱流动相中的硼酸盐缓冲液与甲醇或水与甲醇的体积比为30 70。分析柱流动相中的硼酸盐缓冲液与异丙醇、乙醇的体积比为10 40 50。所述硼酸盐缓冲液是指将0. 05mol/L的硼砂溶液与0. 2mol/L的硼酸溶液按照 7 3的体积比配制的pH值为9. 5的溶液。
权利要求
1.柱切换-液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品在5 30°C的温度下用无水乙醇溶解，制成浓度为4mg/ mL 5mg/mL的标准溶液；该标准溶液在5 30°C的温度下用空白血浆稀释，制成浓度为 0. 5mg/mL 1. 5mg/mL的血浆样品；(2)将所述血浆样品置ImL 5mL具塞离心试管中，以1000 8000r/min的转速离心 3 lOmin，精密吸取上清液置于一离心试管中作进样备用；(3)制备限进填料柱将粒径为5μπι的硅胶外表面键合亲水性的聚乙烯醇，其内表面键合非极性的己胺，形成内径为4. 6mm、长度为45mm的内表面反相限进填料柱；(4)制备手性固定相将粒径为5μ m的硅胶表面涂覆有3，5- 二甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性AE. Lichrom CE 4色谱柱构成手性固定相I ；将粒径为5μπι的硅胶表面涂覆有4-甲基氨基苯甲酸酯的内径为4. 6mm、长度为250mm的手性 AE. Lichrom CE 7色谱柱构成手性固定相II ；(5)将所述手性固定相I和所述手性固定相II分别与所述限进填料柱相连，并将所述限进填料柱作为预处理柱、所述手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料_手性固定相高效液相色谱系统中；所述预处理柱与所述分析柱之间通过聚醚醚酮树脂管连接，该聚醚醚酮树脂管上设有切换阀；所述分析柱外接紫外检测器；(6)将所述步骤(2)所得的血浆样品上清液注入到所述柱切换限进填料-手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇或水-甲醇为预处理柱流动相，以硼酸盐缓冲液_异丙醇_无水乙醇为分析柱流动相，在紫外检测波长为230 350nm、预处理流动相流速为0. 5mL/min 2. OmL/min、分析流动相流速为0. 5mL/min 2. OmL/min、温度为15 40°C的条件下进行分离，得到不同出峰时间不同单一对映体的色谱图。
2.如权利要求1所述的柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，其特征在于所述步骤(1)中的手性药物消旋体标准品是指盐酸普萘洛尔消旋体标准品。
3.如权利要求1所述的柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，其特征在于所述步骤(5)中的切换阀的切换时间为Imin 5min。
4.如权利要求1所述的柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，其特征在于所述步骤(6)中预处理柱流动相中的硼酸盐缓冲液与甲醇或水与甲醇的体积比为30 98 2 70。
5.如权利要求1所述的柱切换_液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法， 其特征在于所述步骤(6)中分析柱流动相中的硼酸盐缓冲液与异丙醇、乙醇的体积比为 10 70 10 40 20 50。
6.如权利要求4或5所述的柱切换-液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，其特征在于所述硼酸盐缓冲液是指将0. 05mol/L的硼砂溶液与0. 2mol/L的硼酸溶液按照1 8 2 9的体积比配制的pH值为7. O 9. 5的溶液。
全文摘要
本发明涉及一种柱切换-液相色谱分析生物体液中手性药物对映体的方法，该方法包括以下步骤(1)将手性药物消旋体标准品制成一定浓度的标准溶液；将该标准溶液稀释成一定浓度的血浆样品；(2)将血浆样品离心，取上清液作进样备用；(3)制备限进填料柱；(4)制备手性固定相；(5)将限进填料柱作为预处理柱、手性固定相作为分析柱放入柱切换限进填料-手性固定相高效液相色谱系统中；(6)将血浆样品上清液注入到柱切换限进填料-手性固定相高效液相色谱系统中的进样器，以硼酸盐缓冲液-甲醇或水-甲醇为预处理柱流动相，以硼酸盐缓冲液-异丙醇-无水乙醇进行分离，得到不同出峰时间不同单一对映体的色谱图。本发明具有快速、方便、灵敏的特点。
文档编号G01N30/88GK102323368SQ20111021857
公开日2012年1月18日 申请日期2011年7月29日 优先权日2011年7月29日
发明者张娟红, 武晓玉, 王荣, 谢华, 贾正平 申请人:贾正平