一种动物软骨源的未变性ii型胶原及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种动物软骨源的未变性II型胶原的制备方法，属生物医用材料制备领域。
【背景技术】
[0002]II型胶原是构成软骨基质的主要成分之一，其与I型胶原相似，是纤维形成胶原，由三条相同的αΙ(ΙΙ)链组成三股螺旋结构域，其分子不含色氨酸残基，酪氨酸残基含量也较少，因此其分子的抗原性较低，尤其是酶法制得的II型胶原，在除去了分子链的端肽后，其免疫原性更低。软骨中II型胶原分子之间通过共价键搭桥交联，形成稳定的三维网状结构，II型胶原富含的羟赖氨酸又与多糖共价键结合，更加稳定了 II型胶原的天然空间结构，这有利于保护软骨的结构及软骨的生物活性，并维持天然软骨的力学性能和机械稳定性。同时，天然II型胶原的空间结构决定了其在水中溶解度很低，不利于II型胶原的分离提纯。因此在提取过程中很好地维持胶原的三股螺旋结构，不致因过度处理而使胶原进一步分解而丧失所具备的生理活性，显得尤为重要。迄今为止，II型胶原的提取制备方法主要为酸法、碱法、酶法、结合法、中性盐法以及热水抽提法等六种，每种方法所制得的II型胶原的分子结构与性能存在显著区别，其中，碱法、热水抽提法所得II型胶原分子量低、分布较宽，不具备生物活性；酸法、中性盐法所得II型胶原因未有效地除去其分子端肽，可能会使II型胶原具有一定的免疫原性，影响其生物学应用，且所得胶原提取率过低，不易工业化生产；酶法制取的II型胶原能完整保留其分子结构，提取率也相对较高，最适合大规模生产。然而酶法在制备II型胶原过程中胶原的纯度与产率之间存在矛盾，如果产率高，纯度就会达不到要求，因此兼顾高产率与高纯度的II型胶原提取制备工艺至关重要。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是针对现有技术的不足而提供的一种动物软骨源的未变性II型胶原的制备方法，其特点是该方法制备的未变性的II胶原产率、纯度高，生物活性高，结构稳定易于保存，有利于软骨细胞的黏附、生长、增殖，可用于医用生物材料的制备。
[0004]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
(1)动物软骨的前处理:取新鲜可溯源的动物软骨100?200份，用剪刀手工清除残留骨头、肌肉，接着在不锈钢转鼓中用生理盐水反复清洗3?5次，沥水30?60min ;将动物软骨放入-40?-80°C的速冻冰箱中反复冻融5?10次，接着将其浸泡在1000?10000体积份的脱脂剂中，伴随间歇性功率为50?100W超声波，每作用30?60min停10_30min，反复作用3?5次，中途换液2?5次，用0.05M Tris，1M NaCl，pH为7.5的Tris-NaCl缓冲溶液清洗3?5次，再将其浸泡在2?3.5M NaCl，20?40mM EDTA的高渗溶液中，37°C下搅拌10?20h，沥水30?60min ;将动物软骨继续浸泡在pH2.0?2.5，1000?5000体积份的醋酸溶液2?10h，纱布过滤回收醋酸溶液，去离子水清洗3?5次，用0.1?1M，1000?5000体积份的NaOH溶液软化处理10_24h，去离子水清洗3?5次，冷冻干燥，得到纯化的动物软骨；将动物软骨采用低温超微粉碎机粉碎，干燥器中保存待用；
(2)未变性II型胶原的提取:将100?200份动物软骨粉浸泡在1000?2000体积份含有4M盐酸胍的0.05M Tris, 1M NaCl，pH为7.5的Tris-NaCl缓冲溶液中，室温下搅拌10?36h，接着10000?20000rpm离心10?30min，回收上清液，用去离子水反复清洗沉淀物，将沉淀物浸泡在PH2.0?2.5，3000?10000体积份的醋酸溶液，在恒温4?10°C下缓慢搅拌3?10h，接着加入1?4份复合酶，4?10°C下转动24?72h，得到酶溶动物软骨
II型胶原溶液；
(3)未变性II型胶原的纯化:向上述所得到的动物软骨II型胶原溶液中加入最终浓度为0.9mol/L的氣化纳粉末，4?10°C下揽摔10?16h，10000?20000rpm离心10?30min，弃上层清液，将沉淀物再次溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，用5?10M NaOH溶液调节pH值为6.5?7.5，加入最终浓度为4mol/L的氯化钠粉末，4?10°C下搅拌10?16h，接着10000?20000rpm离心10?30min，弃上层清液，将沉淀物再次溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，再用5?10M NaOH溶液调节pH值为6.5?7.5，加入最终浓度为4mol/L的氯化钠粉末，4?10°C下搅拌10?16h，再次以10000?20000rpm离心10?30min，取下层沉淀物，如此反复盐析3?5次；将盐析后得到的沉淀再溶于0.1?0.5mol/L醋酸溶液，以浓度为0.1?0.5M的乙酸溶液为透析液透析处理2-3天，冻干，得到海绵状未变性的动物软骨II型胶原；所制得的动物软骨II型胶原，其关键性能达到以下指标要求:
外观:白色海绵状，无肉眼可见之杂质和变色；
色氨酸分析:应不含有色氨酸；
重金属含量:彡10 μ g/g(m/m)；
轻脯氨酸含量:应不小于总蛋白含量的8.5%(m/m)；
脂质体:彡l%(m/m)；
灰分:< 2% (m/m)；
杂蛋白含量:彡l%(m/m);
细胞毒性:细胞毒性反应不大于1级；
无菌试验:无菌；
致敏试验:无迟发性超敏反应；
皮内反应试验:原发性刺激指数ΡΙΚ0.4。
[0005]在上述的制备方法中，步骤(1)中低温超微粉碎机，北京中科浩宇科技发展有限公司生产；步骤(1)中超声时间视所用超声波功率的不同而不同；步骤(1)中复合酶中胃蛋白酶的活力单位为3000单位/克，木瓜蛋白酶活力单位为800万单位/克，葡聚糖酶的活力单位为50单位/克；制备过程均在4?10°C下完成。
[0006]本专利技术通过反复冻融、超声脱脂、高渗液脱细胞、酸-碱交替软化等工艺对动物软骨进行前处理，可有效除去软骨的非胶原成分，进一步松散了动物软骨中的胶原纤维，增加了动物软骨的胶原纤维间空隙，极有利于提取过程中生物酶的充分渗透和作用，能有效提高胶原的纯度和产率；复合酶各组分的协同作用，可最大限度地除去胶原的端肽，降低其的免疫原性。
[0007]未变性II型胶原有以下用途:
1.用作生物医学材料的原料，如可用作制备药物控释载体、止血材料、硬脑膜修复材料、组织工程支架、组织引导材料、整形美容材料等的原料；
2.用作化妆品材料的原料，如护肤霜、润发剂等的原料；
3.用作食品工业材料的原料，如保健材料、饮料等的原料；
4.其他，如用作细胞培养用、生物反应器单体膜等。
[0008]本技术与现有技术相比，具有如下优点:
(1)本发明在动物软骨纯化过程中使用了超声波，充分发挥了超声波的空化效应、机械效应、热效应等作用，破坏了软骨中细胞的细胞膜，有利于对软骨的进一步脱脂和去细胞处理；
(2)本发明采用复合酶提取II型胶原，复合酶组份间的协同作用极有利于对动物软骨中的非胶原成分、杂细胞及胶原端肽进行清除，能有效地提高胶原的产率和纯度；
(3)本发明所述的II型胶原制备工艺，先将动物软骨通过反复冻融、超声脱脂、高渗液脱细胞、酸-碱交替软化等工艺进行了纯化处理，充分除去了软骨中的非胶原成分，松散了软骨中的胶原纤维，能有效地提高胶原的产率和纯度；
(4)本发明所制备的II型胶原的取材丰富，成本低廉，技术先进可靠，产量大，适合批量生产。
【具体实施方式】
[0009]下面通过实施对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，而不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出非本质的改进和调整。
[0010]实施例1
(1)动物软骨的前处理:取新鲜可溯源的动物软骨100份，用剪刀手工清除残留骨头、肌肉，接着用生理盐水反复清洗3次，沥水30min ;将动物软骨放入_40°C的速冻冰箱中反复冻融5次，接着在不锈钢转鼓中将其浸泡在1000体积份的脱脂剂中，伴随间歇性功率为50W超声波每作用60min停30min，反复作用5次，中途换液5次，用0.05M Tris，1MNaCl, pH为7.5的Tris-NaCl缓冲溶液清洗3次，再将其浸泡在2M NaCl,20mM EDTA的高渗溶液中，37°C下搅拌10h，沥水30min ;将动物软骨继续浸泡在pH2.0，1000体积份的醋酸溶液2h，纱布过滤回收醋酸溶液，去离子水清洗3次，用0.1M，1000体积份的NaOH溶液软化处理10h，去离子水清洗3次，冷冻干燥，得到纯化的动物软骨；将动物软骨采用低温超微粉碎机粉碎，干燥器中保存待用；
(2)未变性11型胶原的提取:将100份动物软骨粉浸泡在1000体积份含有4M盐酸胍的0.05M Tris, 1M NaCl，pH 为 7.5 的 Tris-NaCl 缓冲溶液中，室温下搅拌 10h，接着 lOOOOrpm离心30min，回收上清液，用去离子水反复清洗沉淀物，将沉淀物浸泡在pH2.0，3000体积份的醋酸溶液，在恒温4°C下缓慢搅拌3h，接着加入1份复合酶，4°C下转动72h，得到酶溶动物软骨II型胶原溶液；
(3)未变性II型胶原的纯化:向上述所得到的动物软骨II型胶原溶液中加入最终浓度为0.9mol/L的氯化钠粉末，4°C下搅拌10h，lOOOOrpm离心30min，弃上层清液，将沉淀物再次溶于0.lmol/L醋酸溶液，用5M NaOH溶液调节pH值为6.5，加入最终浓度为4mol/L的氯化钠粉末，4°C下搅拌10h，接着lOOOOrpm离心30min，弃上层清液，将沉淀物再次溶于0.lmol/L醋酸溶液，再用5M NaOH溶液调节p