一种提高利福霉素sv发酵合成效率的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种提高利福霉素SV发酵合成效率的方法。本发明属于生物制药发酵工程领域，特别是涉及一种通过调控微生物碳氮代谢流向、增强利福霉素SV前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成，促进前体均匀性供给，提高利福霉素SV合成效率的方法。
【背景技术】
[0002]做为结核病治疗的大宗抗生素原料药，提高利福霉素发酵合成效率一直备受生产企业和研究单位关注。目前，国内外对提高利福霉素发酵效价的研究较多，包括:生产菌种的分子生物学信息特征、发酵培养基优化等方面，如对比文献1:在1L罐水平添加豆油和丙氨酸可提高利福霉素SV效价12.3% (食品与发酵工业，商纯良，2011，37 (5):56-60);对比文献2:在50吨大罐水平添加豆油和乙二酸可使利福霉素SV发酵十亿提高5.4% (发明专利ZL201210176175.9);对比文献3:添加丙氨酸、豆油和磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇可使利福霉素SV效价平均提高17.0% (发明专利申请号201210176177.8)。但是，对比文献I只涉及豆油和丙氨酸存在交互作用，在确定的优化浓度下，利福霉素SV效价提高12.3%,并对生产菌种的糖酵解途径碳代谢、有机酸合成效率以及效价合成的影响进行了初步的分析，并没有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率对利福霉素SV的氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成的影响；对比文献2涉及豆油和乙二酸的双重作用调节三羧酸循环中的关键步骤一琥珀酸脱氢酶催化的反应的活性，通过促进利福霉素SV前体一甲基丙二酰CoA的合成代谢效率来提高利福霉素SV的合成效率，也没有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率对利福霉素SV的氮环前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成的影响；对比文献3中并没有提到磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇起到的作用，应用该方法带来的增产效果也无法断定是磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇的作用结果，对比现有技术(对比文献I)仅知道:豆油和丙氨酸具有调节利福霉素SV发酵的作用，即关于磷霉素钠/磷霉素氨丁三醇调节利福霉素SV发酵的
【发明内容】
没有充分的证明、公开不充分，而且该文献也没有涉及芳香族氨基酸(色氨酸)合成效率对利福霉素SV的氮环(前体3-氨基-5-羟基苯甲酸)合成的影响。
[0003]芳香族氨基酸(酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸)生物合成的限速酶之一是5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶(底物是磷酸烯醇式丙酮酸和3-磷酸-莽草酸)，而色氨酸会显著抑制利福霉素SV的核心氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成效率。因此，通过抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶的活性，可以降低芳香族氨基酸在发酵中后期的合成与积累，特别是降低色氨酸对利福霉素SV前体3-氨基-5-羟基苯甲酸合成的抑制作用。与5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶的底物(如磷酸烯醇式丙酮酸)分子结构相似的小分子可能具有对该酶的抑制功能。
[0004]磷霉素钠是临床使用的抗生素，主要通过抑制敏感致病菌细胞壁的合成来治疗呼吸道感染、皮肤软组织感染、肠道感染等的治疗，成人静脉滴注剂量为:一日4?12g。磷霉素分子结构与磷酸烯醇式丙酮酸分子结构类似，但是，没有关于磷霉素钠作为代谢调控因子作用于地中海拟无枝酸菌的新功能的报道，即:通过抑制5-烯醇丙酮酰莽草酸合成酶活性来降低芳香族氨基酸合成效率、提高利福霉素SV氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸前体合成效率、促进利福霉素SV发酵产量的新功能的报道。
[0005]利福霉素SV分子氮环的氮原子来源于谷氨酰胺(Gin)，在谷氨酰胺合成酶(GS)催化下，将谷氨酸(Glu)转化为谷氨酰胺。另外，谷氨酰胺在谷氨酸合成酶(G0GAT)催化下还可以转化为谷氨酸。发酵过程中胞外谷氨酸浓度越高反映出消耗的谷氨酰胺越多，即没有用于氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合成而是流入Glu旁路代谢的Gin也就越多，而这对于AHBA前体合成和利福霉素SV合成是不利的。因此，提高发酵过程中的Gin有效供给、减少由Gin向Glu的代谢流可能会有效提高利福霉素SV的合成效率。G0GAT的催化产物是Glu，该酶活性存在受到其产物抑制的反馈作用。因此，Glu作为代谢调控因子，在适当的发酵周期添加到发酵液可能会对AHBA的合成产生积极作用。
[0006]通常谷氨酸钠是作为鲜味剂在食品行业被广泛使用，没有关于谷氨酸钠作为代谢调控因子作用于地中海拟无枝酸菌的新功能的报道，即:通过作用于G0GAT的催化反应减少Gin的旁路消耗，促进Gin流向氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸的合成途径、促进利福霉素SV发酵产量的新功能的报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种提高利福霉素SV发酵合成效率的新方法，其实质性是不将磷霉素钠作为常规意义上的抗生素来抑制细菌细胞壁的合成以及不将谷氨酸钠是作为鲜味剂来使用，而是将磷霉素钠和谷氨酸钠作为代谢调控因子来促进利福霉素SV氮环前体3-氨基-5-羟基苯甲酸前体合成效率、促进利福霉素SV的发酵产量。
[0008]将终浓度为5_20mg/L的磷霉素钠和终浓度为3-lOg/L的谷氨酸钠无菌补入发酵培养40-60h的地中海拟无枝酸菌的发酵培养物中，培养结束时利福霉素SV效价平均提高13.
[0009]所述发明具有材料易购、操作步骤简单、可控性高、适用于工业发酵生产的特点。
[0010]本发明提出的一种提高利福霉素SV发酵合成效率的方法，包括以下步骤:
[0011](1)培养基的制备
[0012]①种子培养基
[0013]葡萄糖1.5%，黄豆饼粉1.0%，蛋白胨1.0%，硝酸钾0.05%，碳酸钙0.2%，可溶性淀粉1.5%，pH 7.0。经0.1MPa蒸气灭菌30min备用；
[0014]②发酵培养基
[0015]葡萄糖6-10%，鱼粉 0.3-0.55%，黄豆饼粉 0.5-0.65%，蛋白胨 0.4-0.7%，硝酸钾0.6-0.8% ,碳酸I丐0.5% ,磷酸二氢钾0.02%，pH自然。经0.1MPa蒸气灭菌20min备用;
[0016](2)菌种活化
[0017]取保藏的地中海拟无枝酸菌(A.mediterranei)菌种接入种子培养基，在摇床上培养48h，培养条件为28°C、220r/min ；
[0018](3)菌种扩大培养与合瓶种子细胞的收集
[0019]将上述菌种接到发酵摇瓶培养基中，装液量为50-100mL/250mL三角瓶，接种量为3% -5%，于27°C -28°CU50-200r/min振荡培养46_50h，后无菌操作将摇瓶种子培养基合瓶；
[0020](4) 二级种子培养与三级发酵
[0021]将合瓶种子火焰保护接入二级种子罐，培养温度28°C，转速为160-200r/min，空气流量控制为0.8vvm，罐压控制为0.03-0.04MPa，培养48h后移种至三级发酵罐；
[0022](5)三级发酵罐控制
[0023]培养温度28 °C，转速 0-48h 为 200r/min，48_72h 为 220r/min，72_96h 为 230r/min，96h 至放耀为 240r/min。空气流量控制:0_48h 为 0.4vvm，48_72h 为 0.6vvm，72_96h为 0.8vvm, 96h 至放罐为 lvvm0 罐压控制:0_48h 为 0.02MPa，48_72h 为 0.03MPa，72_96h 为0.04MPa，96h 至放罐为 0.05MPa ；
[0024](6)三级发酵培养周期为40_60h时，无菌补入终浓度为5_20mg/L的磷霉素钠和3-10g/L的谷氨酸钠，其它控制工艺不变。
[0025]有益效果
[0026]按技术方案进行操作，只添加了两种代谢调控物质，发酵中后期促进了谷氨酰胺的积累、抑制了色氨酸的生成，更有效促进了利福霉素SV前体(3-氨基-5-羟基苯甲酸，AHBA)的