合成，从而提高效价合成效率，培养结束时利福霉素SV效价平均提高13.3%。这是与对比文献最明显的不同，超出了对利福霉素SV促进效果的预期，产生了预料不到的技术效果。
【附图说明】
[0027]图1是磷霉素钠和谷氨酸钠对利福霉素合成(〇，对照组；.:添加组)和pH变化(□，对照组；■，添加组)的影响图，数据为平均值土标准偏差。
[0028]由图1可知:发酵过程中添加组(按技术方案进行操作，以下同)的效价要比对照组(不添加组，以下同)高，从84h到放罐，添加组效价为3121U/mL?5231U/mL，比对照提高了 5.2%?13.7%。从pH来看，实验组和对照都在合理范围内，在84h?112h之间，实验组要稍微高于对照组。
[0029]图2是磷霉素钠和谷氨酸钠对AHBA (〇，对照组；.:添加组)、色氨酸(口，对照组；■，添加组)和酪氨酸(☆，对照组；★，添加组)合成的影响图，数据为平均值土标准偏差。
[0030]由图2可知:发酵前期添加组和对照组AHBA和色氨酸浓度没有太大变化，但是到了发酵中后期，特别是在84h，添加组AHBA浓度达到0.153g/L，是对照的1.16倍，而色氨酸浓度为0.0609g/L，只有对照的85.3%，这说明在发酵培养基中添加了的磷霉素和谷氨酸钠后，促进了菌体代谢过程中AHBA的合成，同时抑制了色氨酸的生成。而到了发酵后期，色氨酸浓度有所回升，稍高于对照，而色氨酸对利福霉素的合成产生抑制作用，这也可能是效价到后期合成速率减缓的原因。从酪氨酸来看，酪氨酸的趋势相同于对照组，且差异很小。这说明磷霉素和谷氨酸钠的添加只对芳环氨基酸中的色氨酸起到抑制作用，对酪氨酸的影响很小。
[0031]图3是磷霉素钠和谷氨酸钠对α -酮戊二酸(〇，对照组；籲:添加组)和甘油(□，对照组；■，添加组)合成的影响图，平均值土标准偏差。
[0032]由图3可知:从72h开始，添加组α -酮戊二酸的浓度就明显低于对照组，特别是在112h其浓度为0.092g/L只有对照组的41.1% ;从甘油来看，添加组要高于对照组，120h时实验组甘油浓度为1.44g/L，是对照组的1.79倍。
[0033]图4是磷霉素钠和谷氨酸钠对乙酸(O，对照组；.:添加组和谷氨酰胺(口，对照组；■，添加组)合成的影响图，平均值土标准偏差。
[0034]由图4可知:当添加磷霉素钠和谷氨酸钠以后，乙酸合成减少，而谷氨酰胺积累。从48h到放罐，添加组的酸浓度一直低于对照组，谷氨酰胺浓度为0.27g/L?0.55g/L，却是对照的1.02?1.73倍。说明谷氨酸钠经菌体代谢，促进了谷氨酰胺的积累，而Gln又是AHBA的氨基供体，从而提高效价合成效率。
【具体实施方式】
[0035]实施例1
[0036]1、培养基的制备
[0037](I)种子培养基
[0038]葡萄糖1.5g,黄豆饼粉1.0g,蛋白胨1.0g,硝酸钾0.05g,碳酸I丐0.2g,可溶性淀粉1.5g,定容至10mL, pH 7.0。经0.1MPa高压蒸气灭菌30min备用；
[0039](2)发酵培养基
[0040]葡萄糖6-10g,鱼粉0.3-0.55g,黄豆饼粉0.5-0.65g,蛋白胨0.4-0.7g硝酸钾0.6-0.8g,碳酸I丐0.5g,磷酸二氢钾0.02g,定容至lOOmL，pH自然。经0.1MPa高压蒸气灭菌30min备用；
[0041]2、菌种活化
[0042]取保藏的地中海拟无枝酸菌(A.mediterranei)菌种接入种子培养基，在摇床上培养48h，培养条件为28°C、220r/min ；
[0043]3、菌种扩大培养与合瓶细胞的收集
[0044]将上述菌种接到发酵摇瓶培养基中，装液量为50mL/250mL三角瓶，接种量为5%，于27°C、150r/min振荡培养46h，然后无菌操作将摇瓶种子培养基合瓶；
[0045]4、二级种子培养和三级发酵
[0046]将合瓶种子火焰保护接入二级种子罐，培养温度28°C，转速为160r/min，空气流量控制为0.8vvm，罐压控制为0.03MPa，48h无菌操作补入三级发酵罐；
[0047]5、三级发酵罐控制
[0048]培养温度28 °C，转速 0-48h 为 200r/min，48_72h 为 220r/min，72_96h 为 230r/min，96h 至放耀为 240r/min。空气流量控制:0_48h 为 0.4vvm，48_72h 为 0.6vvm，72_96h为 0.8vvm, 96h 至放罐为 Ivvm0 罐压控制:0_48h 为 0.02MPa，48_72h 为 0.03MPa，72_96h 为0.04MPa，96h 至放罐为 0.05MPa。
[0049]6、调控因子的补加
[0050]按补入大罐后终浓度为3g/L的谷氨酸钠进行称料，投料于补料罐中，蒸汽灭菌。灭菌条件为117°C、15分钟，后降温至28°C ;终浓度为5mg/L的磷霉素钠进行称料，溶于无菌水后经0.22 μ m过滤，后经火焰保护也接入补料罐；培养周期为40h时，无菌操作将补料罐中的磷霉素钠和谷氨酸钠溶液补入三级发酵大罐。
[0051]实施例2
[0052]1、培养基的制备:同实施例1。
[0053]2、菌种活化:同实施例1。
[0054]3、菌种扩大培养与合瓶细胞的收集:同实施例1。
[0055]4、二级种子培养和三级发酵:同实施例1。
[0056]5、三级发酵罐控制:同实施例1。
[0057]6调控因子补加
[0058]按补入大罐后终浓度为6g/L的谷氨酸钠进行称料，投料于补料罐中，蒸汽灭菌。灭菌条件为117°C、15分钟，后降温至28°C ;终浓度为15mg/L的磷霉素钠进行称料，溶于无菌水后经0.22 μ m过滤，后经火焰保护也接入补料罐；培养周期为50h时，无菌操作将补料罐中的磷霉素钠和谷氨酸钠溶液补入三级发酵大罐。
[0059]实施例3
[0060]1、培养基的制备:同实施例1。
[0061]2、菌种活化:同实施例1。
[0062]3、菌种扩大培养与合瓶细胞的收集:同实施例1。
[0063]4、二级种子培养和三级发酵:同实施例1。
[0064]5、三级发酵罐控制:同实施例1。
[0065]6、调控因子补加
[0066]按补入大罐后终浓度为9g/L的谷氨酸钠进行称料，投料于补料罐中，蒸汽灭菌。灭菌条件为117°C、15分钟，后降温至28°C ;终浓度为20mg/L的磷霉素钠进行称料，溶于无菌水后经0.22 μ m过滤，后经火焰保护也接入补料罐；培养周期为60h时，无菌操作将补料罐中的磷霉素钠和谷氨酸钠溶液补入三级发酵大罐。
【主权项】
1.一种提高利福霉素SV发酵合成效率的方法，其特征在于:地中海拟无枝酸菌进行三级发酵培养，当三级发酵培养周期在40-60 h时无菌补入终浓度为5-20 mg/L的磷霉素钠、终浓度为3-10 g/L的谷氨酸钠。
【专利摘要】本发明公开了一种提高利福霉素SV发酵合成效率的方法。将终浓度为5-20mg/L的磷霉素钠和3-10g/L的谷氨酸钠无菌补入发酵培养地中海拟无枝酸菌周期在40-60h的三级发酵培养物内，培养结束时利福霉素SV效价平均提高13.3%。该新方法具有操作简单、利福霉素SV增产效果稳定等特点。
【IPC分类】C12P17/18
【公开号】CN105331654
【申请号】CN201510669929
【发明人】王志, 陈雄, 李冬生
【申请人】湖北工业大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年10月13日