一种制备抗病毒药物连翘脂素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物化学领域，具体而言，本发明涉及连一种抗病毒化合物连翅脂素 的制备新方法。
【背景技术】
[0002] 连翅脂素，为连翅巧的糖配基部分，又称作连翅巧元，为木犀科连翅属植物连翅的 主要活性成分，其结构如下式所示，现代药理研究表明，连翅脂素有抗病毒、抗氧化、降低血 月旨、清除自由基、抑菌、抗肿瘤、抗炎等作用。
[0003]
连翅脂素结构式
[0004] 连翅为木犀科（Oleaceae)连翅属（化'3八]11曰）植物连翅（Forsythia suspensaCrhunb.)V址1)的干燥果实，主要分布于我国河南、山西、陕西、山东等地，此外，湖 北、河北、四川、甘肃亦有分布。常用于治疗急性风热感冒、痛肿疮毒、淋己结结核、尿路感染 等症[1]。连翅的主要成分为连翅巧（phill-yrin)，具有抗病毒、抗菌、抗氧化、清除自由 基、抗肿瘤等药理作用巧-5]，同时含有少量连翅脂素（(+)-phillygeninin)。从天然连翅 中提取连翅巧的研究已有大量研究报道，但由于连翅脂素在连翅中含量较低，因此用提取 分离的方法收率较低。
[0005] 在用人肝癌细胞（SMMC-7721)进行体外活性研究中，连翅巧没有活性，连翅脂素 具有活性；在用小鼠黑色素肉瘤细胞B16对连翅脂素和连翅巧抗癌活性研究中，连翅巧没 有效果，而连翅脂素对小鼠黑色素肉瘤细胞B16有较强的抑制活性，甚至强于阳性对照的 长春新碱。可见，连翅巧和连翅脂素在抗病毒、抗肿瘤等方面的药理作用，具有明显差异。研 究表明，连翅巧在体内迅速代谢成连翅脂素后发挥药理作用。因此，连翅脂素有可能是连翅 巧的前体物质。所W研究如何将连翅巧转化为连翅脂素，对连翅资源深度开发具有重要意 义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对连翅脂素提取分离的现有技术中存在的连翅脂素得率低，生 产成本包等技术问题，提供一种连翅脂素的制备方法，本发明方法克服现有技术不足，利用 商品化酶对连翅巧进行酶解反应制备具有抗病毒功能的天然产物连翅脂素，本发明方法操 作工艺过程简单，生产周期短。制备得到的连翅脂素含量高，产率高，显著降低了连翅脂素 的生产成本，适宜批量制备和工业化生产。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种制备连翅脂素的方法，包括对连翅 巧进行酶水解处理。
[0008] 其中，所述酶水解处理过程中的酶选择纤维素酶、蜗牛酶、目-葡萄糖巧酶、苦杏仁 酶或果胶酶，优选为纤维素酶、蜗牛酶、目-葡萄糖巧酶。
[0009] 特别是，所述酶与连翅巧的质量比为1-10 : 1，优选为1-5 : 1。
[0010] 其中，所述酶水解处理是将连翅巧和酶与缓冲溶液混合均匀后，于37~5(TC温度 下，反应12~48小时。
[0011] 特别是，所述酶水解处理的温度优选为40-5(TC;反应时间优选为24-3化。
[0012] 其中，所述缓冲液选择醋酸盐缓冲溶液；缓冲液的抑值为5-6. 5,优选为5. 2-6. 0。
[0013] 特别是，所述醋酸盐缓冲溶液为醋酸-醋酸钢缓冲溶液。
[0014] 特别是，所述醋酸盐缓冲溶液的抑值为5-6. 5,优选为5. 2-6. 0。
[0015] 尤其是，所述醋酸盐缓冲溶液的用量为每Ig连翅巧溶于20-30ml的醋酸盐缓冲溶 液，优选为25ml所述醋酸盐缓冲溶液。
[0016] 特别是，还包括终止酶水解处理步骤，向酶水解处理后的混合物中醇-水溶液。
[0017] 其中，所述醇-水溶液选择甲醇水溶液或己醇水溶液。
[001引特别是，所述甲醇水溶液的质量百分比浓度为20-40%，优选为30%;所述己醇水 溶液的质量百分比浓度为20-40%，优选为30%。
[001引尤其是，所述醇-水溶液的用量为每Ig连翅巧添加10-100血的所述醇-水溶液， 优选为10-20血。
[0020] 特别是，还包括分离纯化处理步骤，首先对酶解终止处理后的混合液进行固液分 离，接着对分离得到的固体依次进行洗涂、溶解、回收溶剂、重结晶处理。
[0021] 其中，所述洗涂采用高纯水、醇-水溶液分别进行洗涂2-3次。
[0022] 特别是，所述洗涂处理用醇-水溶液选择质量百分比浓度为30%的己醇水溶液。
[0023] 其中，所述的溶解处理是将洗涂后的固体溶于石油離。
[0024] 特别是，采用甲醇溶剂进行所述的重结晶处理。
[0025] 本发明公开了一种利用酶对连翅巧进行酶解反应制备具有抗病毒活性的天然药 物连翅脂素的方法，然后W含醇水溶液终止酶解反应，再利用溶剂重结晶对酶解产物进行 分离，得到连翅脂素纯品。
[0026] 所述的制备抗病毒天然药物连翅脂素的方法，对酶解产物的分离纯化是指酶解终 止后，将溶剂减压蒸干，残留物加石油離溶解，过滤，无水硫酸钢干燥，减压蒸干得到连翅脂 素粗品，再用甲醇等有机溶剂重结晶。
[0027] 通过上述制备方法所得连翅脂素在常温下为白色固体，HPLC纯度为99%。连翅脂 素的结构鉴定；ESI-MSm/z371[M-田，分子量为372。
[002引lH-NMR(600MHz, (16-DMS0) δ ;8. 873 (m，2H，0H) ,6. 933-6. 582 (m，6H)，4. 74-4. 778 (d，IH，J = 6. 4Hz)，4. 232-4. 249 (d，IH，J = 6. 8Hz)，4. 007-4. 029 (d，2H，J = 8.細z)，3. 743 (m，7H)，3. 717 (t，2H，J = 8. 4Hz)，2. 83 (t，IH，J = 8. 6Hz)，2. 759-2. 780 (s， IH)；
[0029] 13C-NMR(150MHz，d6-DMS0)δ:49.7 (C-5) ,54.2 (C-1) ,55.9 (0-CH3) ,69.2 (C-4)， 70.8(C-8)，81.6(C-6)，87. 3(C-2)，109. 7(C-2 " )，111.9(C-5 " ),113.8(C-2 ')， 115. 6 (C-5' ),117. 5 (C-6"),117. 9 (C-6' )，131. 6 (C-1" )，132. 8 (C-1')， 145.l(C-4f),145. 5 (C-3< ),147. 9 (C-3" ),148. 8 (C-4")。
[0030]上述光谱数据与文献报道的连翅脂素一致，故鉴定此化合物为连翅脂素 ((+)-phillygeninin)ο
[0031] 本发明方法具有如下优点：
[0032] 1、本发明方法是通过酶解转化的方法，从连翅巧制备具有抗病毒功能的连翅脂 素，显著降低了连翅脂素的生产成本（连翅植物中连翅脂素含量低于1% );
[0033] 2、本发明克服了现有提取分离技术对连翅巧破坏性大、污染严重、杂质较多等缺 占. ;、、、?
[0034] 3、本发明的制备方法的转化率高，适用于工业化大规模生产；
[0035] 4、本发明制备工艺方法简单，连翅脂素得率高，耗能低，环保，操作工艺条件容易 控制，质量可控性强；
[0036] 5、本发明方法采用酶水解处理连翅巧，反应条件温和、无化学试剂残留，不产生二 次污染，减少了对环境的污染，可选择性地水解连翅巧，酶反应效率高，降低生产成本，提高 生产效率。
【具体实施方式】
[0037]W下通过实施例进一步描述本发明，但送些实施例仅是说明本发明，而不应理解 为对本发明范围的任何限制。另外，实施例中的试剂、原料都可W通过商业渠道获得，如有 未尽之处，可W参考有机合成指南、药品监管机构的指引W及相应仪器、试剂的厂商说明书 等。
[0038] 实施例1
[0039] 1、酶水解处理
[0040] 将连翅巧（2g)、纤维素酶（2g)加入到装有50血、Ρ册.2的醋酸-醋酸钢缓冲液的 Η角瓶中，揽拌均匀后，置于恒温水浴锅内加热至37°C，在保持温度为37°C条件下，进行酶 水解反应2地，其中连翅巧与纤维素酶的质量比为1 : 1;
[0041]2、酶水解反应终止处理
[0042] 向酶水解反应后的混合物中加入质量百分比浓度为30%的己醇水溶液，揽拌，使 酶变性及终止酶水解反应，制得含有连翅脂素的混悬液，其中，加入的己醇水溶液的用量为 20血，即每Ig连翅巧添加10血的己醇水溶液；
[0043]3、分离纯化处理
[0044] 对含有连翅脂素的混悬液进行离必处理巧00化pm, lOmin)，弃去上清液，离必沉淀 用依次沉淀10倍量高纯水、10倍量质量百分比浓度为30%己醇水溶液各洗涂3次