一种重组人表皮生长因子原液制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种重组人表皮生长因子原液制备方法。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子化EG巧是人体重要的多肤，它具有多种生物学功能，例如可与表皮 细胞上特异的受体结合，将信息传递入细胞，改变细胞内的酸碱度和游离巧度，从而促进糖 酵解和蛋白质合成W及增加某些专一性基因转录，促进DNA复制和细胞分裂。表皮生长因 子是由Cohen等人在上世纪60年代从小鼠颂下腺发现的一种生长调节蛋白，由53个氨基 酸组成，研究证实它具有广泛的刺激细胞增殖的作用。1975年，Starkey、Cohen等人从人 尿中提取了人表皮生长因子化umanEpidermalGrowthFacto;r，hEGF)，与鼠表皮生长因子 具有高度一致的结构，并具有一致的生物学活性。表皮生长因子广泛存在于人体各种组织 中，可刺激多种细胞增殖，主要是上皮细胞和内皮细胞的增殖，运是通过结合细胞膜上的表 皮生长因子受体巧GFR)而起作用的。EGF通过与细胞受体的膜外部分结合，激活其酪氨酸 激酶活性，诱导蛋白憐酸化，启动DNA合成，激活RNA、蛋白质合成，促进细胞增生、移行。因 此，hEGF可促进表皮细胞、神经细胞和器官组织上皮细胞生长；可促进新生胎儿齿、骨与各 器官的生长；可促进肝细胞再生；可促进胃肠道黏膜细胞生长和保护胃肠道黏膜受损。
[0003] 表皮生长因子广泛存在于人体内各种组织，含量极微，对于维持人体各种组织器 官（如角结膜、皮肤、各种黏膜、腺体等）的正常生理功能具有重要作用。随着年龄的增长， 体内表皮生长因子水平逐渐下降，表现为相关组织器官的衰老和退化，特别是上皮组织的 衰老，因此，及时向人体补充表皮生长因子，可维护人体正常功能并延缓衰老，运是表皮生 长因子在美容保健行业的应用基础。另外，在肌体受损等的情况下，内源性表皮生长因子不 能满足组织修复的大量需要，及时向受损部位补充表皮生长因子，可促进受损肌体组织的 修复，在临床上应用非常广泛，如用于创伤、炎症、手术、化学烧伤及干眼症等各种原因引起 的角膜上皮缺损修复，烧伤、创伤、外科手术、炎症、溃瘍等各种皮肤和黏膜缺损的修复。
[0004] 重组人表皮生长因子（riiEG巧是通过基因工程技术将大肠杆菌或酵母分泌表达 而来的，其制品纯度可达98%。重组人表皮生长因子属于分子量超过500道的大分子多肤 类药物。目前，对表皮生长因子和重组表皮生长因子已有研究，例如中国专利97115284. 5， 公开了表皮生长因子工程菌及使用该菌制备表皮生长因子的方法，研究人员通过表皮生长 因子可W得到重组人表皮生长因子（或者称为重组人表皮生长因子原液）。科技在不断进 步，对于表皮生长因子和重组表皮生长因子的研究也在不断的进行当中。
【发明内容】
阳〇化]本发明的目的是提供一种重组人表皮生长因子原液制备方法，包括W下步骤：
[0006] 1)培养基的准备：由W下重量比例成分制成：
[0007] 甘油； 日.0-7.0%、 酵母碱基（YNB) 3. 0-3.日％、 微量金属离子；1.8-2.2%、 物案 0。5-1.0%、 促进剂 0. 5-1.0%、 水 余量；
[0008] 所述微量金属离子为Ξ氯化铁、氯化巧、钢酸钢、氯化锋、硫酸铜、棚酸、硫酸侣中 的一种；
[0009] 用憐酸盐缓冲液调抑为5. 5-6. 5;
[0010] 所述促进剂采用W下方法制备：
[0011] ①原料处理：将积雪草洗净、干制、粉碎；
[0012] ②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa， 保压时间维持在150-200S ;
[0013] ③蒸馈处理：将步骤②得到的物料放入蒸馈器，在蒸馈器底部，加热燃烧或通入蒸 汽，当炙热的蒸气充满在蒸馈器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离 器，收集精油；
[0014] ④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度 30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
[0015] 2)发酵、表达：应用化摇瓶及2化原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，W10%培 养基接种后，添加诱导剂，30°C培养，控制抑7. 0,氧饱和度10-50%，揽拌150-17化pm，罐压 0. 01378-0. 03445MPa，流加甘油至每L湿菌达100-300g后流加甲醇保持其浓度为1 %W进 行EGF的诱导表达；
[0016] 3)分离：表达结束，离屯、分离，收集上清既得重组克隆菌株离屯、液；
[0017] 4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离屯、液，加入硫酸锭使浓度成0.5M，上样 于用5倍柱体积量的20mM憐酸缓冲液抑7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱，W20mM憐 酸缓冲液抑7. 0, 0. 5M硫酸胺将进样峰洗至基线，W20mM憐酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品 峰W20mMTris-肥1pH7.6缓冲液稀释10倍后上样于Q-se地aroseHi曲Performance柱， WA液（20mMTris-肥 1 抑7.6)至B液（20mMTris-肥 1pH7. 6,0. 5MNaCl)梯度洗脱方法 收集EGF峰，最后用分子筛Superdex30柱纯化重组hEGF蛋白，纯度可达98 %W上。
[0018] 进一步优选的，步骤1)所述培养基的准备按照W下步骤：
[0019] 培养基由W下重量比例成分制成：
[0020] :油； 6。0%、 酵母碱基（Y腑） 3.44%、 微量金属离子； 2.0%、 化物索 1.0%、 促进剂 0.8%、 水 余量；
[0021] 所述微量金属离子为Ξ氯化铁、氯化巧、钢酸钢、氯化锋、硫酸铜、棚酸、硫酸侣中 的一种；
[0022] 用憐酸盐缓冲液调抑为6.0;
[0023] 所述促进剂采用W下方法制备：
[0024] ①原料处理：将积雪草洗净、干制、粉碎； 阳0巧]②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，爆破压力3.0-3.5Mpa， 保压时间维持在150-200S ;
[00%] ③蒸馈处理：将步骤②得到的物料放入蒸馈器，在蒸馈器底部，加热燃烧或通入蒸 汽，当炙热的蒸气充满在蒸馈器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离 器，收集精油；
[0027] ④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度 30-40m/s，时间3-5min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到。
[0028] 本发明所述用水符合制药行业标准。
[0029] 本发明所述积雪草的使用量，优选粉碎后的体积相当于蒸汽爆破罐体积的 1/4-1/3〇
[0030] 本发明所述用水符合制药行业标准，所述遗传工程菌株参照现有技术，优选遗传 工程菌株GS115-3EGF。 阳03U 步骤。所述诱导剂为甲醇，用量1.2-1.8% (w/w)。
[0032] 步骤4)所述疏水柱优选化en}dse地arose6FastFlow(hi曲sub)柱。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0034] 1、本发明使用的植物原料成分经过了蒸汽爆破、蒸馈、高剪切均质机处理，得到纳 米乳状的植物油性成分，和培养基中其他配方的相容性好。
[0035] 2、现有技术中常用的工程菌的诱导方式有溫控或者是化学物质，比如甲醇、IPTG 等等。本发明通过在培养基中添加植物原料成分作为促进剂，和现有技术相比，表达产量会 提高 24-33%。
【具体实施方式】
[0036] 下面W实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于运些实施例。 阳〇37] 实施例1:
[0038] 一种重组人表皮生长因子原液制备方法，包括W下步骤：
[0039] 1)培养基的准备：由W下重量比例成分制成：
[0040] 甘油； 5.0%、 酵母碱基（YNB) B. 5%、 微量金属离子： 1.8%、 生物素 0.5%、 促进剂 1.0%、 水 余量；
[0041] 所述微量金属离子为Ξ氯化铁； 阳0创用憐酸盐缓冲液调抑为5. 5 ;
[0043] 所述促进剂采用W下方法制备：
[0044] ①原料处理：将积雪草洗净、干制、粉碎；
[0045] ②蒸汽爆破处理：将步骤①得到的物料放入蒸汽爆破罐，体积相当于蒸汽爆破罐 体积的1/3,爆破压力3.OMpa，保压时间维持在200s;
[0046] ③蒸馈处理：将步骤②得到的物料放入蒸馈器，在蒸馈器底部，加热燃烧或通入蒸 汽，当炙热的蒸气充满在蒸馈器里，水蒸气通过冷凝管，被引入冷凝器内，再通过油水分离 器，收集精油；
[0047] ④高剪切均质机处理：将步骤③得到的精油通过高剪切均质机处理，线速度30m/ S，时间3min，制成纳米乳，并用微孔滤膜过滤除菌得到；
[0048] 2)发酵、表达：应用化摇瓶及2化原位灭菌发酵罐培养遗传工程菌株，W10%培 养基接种后，添加诱导剂1. 2%，30°C培养，控制抑7. 0,氧饱和度50 %，揽拌15化pm，罐压 0. 01378MPa，流加甘油至每L湿菌达lOOg后流加甲醇保持其浓度为1%W进行EGF的诱导 表达；
[0049] 3)分离：表达结束，离屯、分离，既得重组克隆菌株离屯、液；
[0050] 4)纯化：将步骤3)得到的重组克隆菌株离屯、液，加入硫酸锭使浓度成0. 5M，上样 于用5倍柱体积量的20mM憐酸缓冲液抑7. 0,0. 5M硫酸胺溶液平衡过的疏水柱（Phenyl se地arose6FastFlow(hi曲sub)柱），W20mM憐酸缓冲液抑7. 0,0. 5M硫酸胺将进样峰 洗至基线，W20mM憐酸缓冲液洗脱出EGF峰，该样品峰W20mMTris-肥1pH7.6缓冲液稀 释 10 倍后上样于Q-se地aroseHi曲Performance柱，WA液（20mMTris-肥 1 抑7.6)至 B液（20mMT