嵌合mhc蛋白及其寡聚物的制作方法

专利名称：嵌合mhc蛋白及其寡聚物的制作方法
技术领域：
本发明涉及嵌合MHC蛋白，编码该嵌合MHC蛋白的表达盒，载体，所述嵌合蛋白的寡聚物，通过使用这些寡聚物根据抗原受体的特异性来标记、检测和分离哺乳动物T细胞的方法，以及用于构建所述嵌合蛋白的合适引物。
背景技术：
主要组织相容性复合物(MHC)分子，存在于组织中的细胞表面，在通过与T细胞表面的T细胞受体(TCR)相互作用来将细胞抗原以短的线性肽形式呈递给T细胞的过程中起重要作用。
已经确定，分离的或重组形式的MHC肽分子可用于根据T细胞识别的特异性肽抗原来检测、分离和处理这些T细胞。还知晓，MHC分子和细胞表面上的TCR之间的相互作用基本上是多聚体形式的(multimeric)，单一的MHC分子对特定TCR的亲和性通常很低。
因而，人们已经做出巨大努力来开发多聚体形式的分离或重组的MHC肽分子来使这些分子在上述应用中更加有用。
欧洲专利申请EP812 331描述了一种用于根据抗原受体特异性来标记、检测和分离哺乳动物T细胞的多聚体结合复合物，该复合物具有通式(α-β-P)n，其中(α-β-P)是MHC肽分子，n≥2，α包含MHC I或MHC II类分子的α链，β包含MHC蛋白的β链，而P是基本上同质的(homogeneous)肽抗原。MHC蛋白的多聚化是通过生物素酰化MHC分子的α或β链之一的C末端并将MHC单体偶联到四价链霉抗生物素/抗生物素蛋白上，或者通过提供MHC分子的嵌合蛋白，该MHC分子在其α或β链之一的C末端被修饰来包含被相应抗体识别的表位，并且作为多聚化的单位(entity)。本说明书还教导MHC寡聚物用于根据TCR特异性来检测、标记和分离特定T细胞的用途。
欧洲专利申请EP 665289描述了特定的肽、结合这些肽的MHC分子，和通过交联各个结合了特定肽的MHC分子而获得的寡聚物。通过使用化学交联剂或者通过提供包含被免疫球蛋白例如IgG或IgM识别的表位的MHC嵌合蛋白来实现寡聚化。MHC分子可能包含标记物并且可能被用于根据特异性的受体结合来标记、检测和分离T细胞，并且最终可以被用于治疗人类疾病。
WO93/10220描述了嵌合MHC分子，包含MHC分子的可溶部分，MHC分子可以是被融合到免疫球蛋白的恒定区的MHC I或II类分子。该分子的MHC部分包含互补的α和/或β链，而一条肽被结合到MHC分子的相应的结合沟(groove)中。由于存在二聚体免疫球蛋白支架结构(scaffold)，这些嵌合的MHC-Ig分子自组装成二聚体结构。
在其他研究中，软骨寡聚基质蛋白(COMP)的寡聚化结构域过去已经被用作多聚化多种蛋白的工具。COMP已经被Efimov等描述和表征(参见，例如ProteinsStructure，Function，and Genetics 24259-262(1996))。COMP是血小板反应蛋白家族的五聚糖蛋白。蛋白质自组装来形成五聚体是通过形成五链螺旋束来实现的，该螺旋束包括蛋白质的N末端的64个氨基酸。寡聚化结构域的氨基酸序列已经被Efimov等，FEBS Letters34154-58(1994)描述。
WO 00/44908公开了含有被连接到人软骨寡聚基质蛋白(COMP)的N末端部分的TSP-1、TSP-2、内皮抑素(endostatin)、制管张素、血小板因子4或促乳素的抗血管生成部分的嵌合蛋白，从而可以形成五聚体。该申请主要涉及利用受生成的嵌合蛋白调节的抗血管生成作用。根据这些公开的内容，嵌合蛋白将促进其中含有的TSP结构域的正确折叠，使得它们与基于TSR序列的肽相比，能够更好地模拟天然蛋白质。
US6,218,513公开了含有用于生成所述球蛋白的寡聚物的非天然结合结构域的球蛋白。COMP寡聚化结构域是被公开的结合结构域之一。从寡聚化中获得的优点在于半衰期延长，从而具有更好的抵抗血管内降解的抗性，以及由于相对于单体球蛋白其尺寸增加，可降低寡聚化的球蛋白的溢出。
Holler等，Journal of Immunological Methods 237159-173(2000)描述了基于包含被融合到IgG的恒定区或者COMP的自组装结构域的TNF受体家族成员的寡聚化受体，开发溶解性升高了的FasL和40CDL的抑制剂。一般认为，TNF受体家族的寡聚的可溶性嵌合受体的亲和性升高不是普遍现象。已经发现，此类寡聚体嵌合受体与其配体的亲和性取决于所研究的特定的受体-配体对，并且发现既便是在相关性极强的蛋白之间也存在很大的不同。
上文描述的MHC蛋白多聚化的尝试产生多个不利方面。例如，典型地，化学交联导致了MHC寡聚物的最终结构难以预期，各个复合物之间的结构极其不相同。因此，结合靶点同样可能是不同的，取决于最终的寡聚物的结构。这反过来会阻碍任何使用了该寡聚物的分析系统的精确性和可靠性。最糟糕的情况是，化学交联甚至会阻碍功能性MHC寡聚物的形成。
如在WO 93/10220中所描述，将一条或多条MHC多肽链与免疫球蛋白分子的恒定区融合，生成二聚体MHC分子复合物。虽然二聚体作用使得复合物的亲和性升高，但是需要通过用特定抗体或蛋白A或G进一步多聚化来达到各种应用所需的亲和性，这些应用例如检测抗原特异性T细胞或者成功地活化这些T细胞。但是，这种两阶段多聚化方法实施起来是费时的，并且难以控制终产物的均匀性。
另一方面，通过使用非人类的结合配偶体例如生物素/链霉抗生物素结合配对或者非人类的抗体进行MHC单体多聚化，来将非人类的蛋白质成分导入寡聚物中。在设计为在体内使用例如治疗人类疾病的应用中，需要考虑复合物的潜在毒性和/或抵抗复合物中的非人类的部分的免疫反应。因此，期望避免在寡聚复合物中含有非人类的部分。
此外，制备依赖于生物素-链霉抗生物素相互作用的MHC多聚物包括大量加工步骤，包括数轮的蛋白质纯化，以及引起活性物质大量减少的生物素酰化反应。另外，控制单体MHC亚基的生物素酰化效率和最终多聚产物的质量是困难的。
与MHC单体本身相比，从本领域获得的MHC寡聚物在一定程度上提高了该复合物的亲和性。但是，仍然十分期望进一步提高亲和性而不增加复合物合成的复杂性，并且确保这种合成将获得具有高度均匀性的分子。
本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷和其他不利方面，并提供一种多聚MHC肽复合物，其易于生产，具有均匀的高价MHC肽组分，所述组分可同时结合到T细胞受体上，以及非人类成分最小化的蛋白质序列。
发明概述本发明通过使用至少两种嵌合蛋白克服了现有技术的上述不利方面和缺陷，所述嵌合蛋白包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域。
因此，本发明的第一个方面涉及包含至少两种嵌合蛋白的寡聚MHC复合物，所述嵌合蛋白包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域，其中通过在嵌合蛋白的寡聚化结构域处发生寡聚化而形成所述寡聚MHC复合物，且其中有至少两个所述的第一部分来源于同一种MHC肽链。
优选地，嵌合蛋白的第一部分来源于MHC I或II类的α链的细胞外部分。或者，嵌合蛋白的第一部分可来源于MHC I或II类的β链的细胞外部分。
在本发明的优选实施方案中，包含在嵌合蛋白的第二部分中的寡聚化结构域来源于人软骨寡聚基质蛋白(COMP)的五聚结构域。更加优选地，包含在嵌合蛋白的第二部分中的COMP五聚结构域包含所述蛋白的氨基酸1-128，优选氨基酸20-83，最优选氨基酸20-72，并且优选由所述蛋白的氨基酸1-128，优选氨基酸20-83，最优选氨基酸20-72组成。
优选地，嵌合蛋白还包括MHC肽链(第一部分)与寡聚化结构域(第二部分)之间的一个第一接头。
优选地，寡聚物中的至少一个嵌合蛋白还包括选自第二个接头、标记结构域和纯化结构域的一或多个结构域。
本发明的另一个实施方案涉及上述的寡聚MHC复合物，其还包含与所述嵌合蛋白中的至少两种互补的MHC肽链，以形成功能性MHC结合复合物。
优选地，根据本发明的第一个方面的寡聚MHC复合物包含与由I类复合物的MHCα1和α2结构域或者由II类复合物的MHCα1和β1结构域所形成的沟中的该复合物的MHC部分相结合的肽。优选地，该肽基本上是同质的。
根据本发明的寡聚MHC复合物可包含一个标记物。优选地，该标记物选自光可检测标记物、放射性标记物、酶、表位、植物凝集素或生物素。
在本发明的第二方面，本发明涉及一种嵌合蛋白，其包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域，所述卷曲螺旋蛋白质通过排列至少两条基本上相同模式(version)的、且自其产生所述寡聚化结构域的多肽链而发生寡聚化。优选地，寡聚化结构域来自COMP的五聚化结构域。更加优选地，寡聚化结构域包含并优选地由COMP的氨基酸1-128，优选氨基酸20-83，最优选氨基酸20-72组成。
本发明的第三个方面涉及包含被可操作地连接到编码插入到上述的本发明的寡聚MHC复合物中的嵌合蛋白的核苷酸序列上的启动子序列的重组表达载体。
本发明的第四个方面涉及包含上述重组表达盒的载体。
本发明的第五个方面涉及药用或诊断用组合物，其包含本发明的寡聚MHC复合物。
本发明的第六个方面涉及根据抗原受体特异性来标记或检测哺乳动物T细胞的方法，该方法包括(i)将本发明的寡聚MHC复合物与包含T细胞的悬浮液或生物学样品组合在一起，和(ii)检测所述复合物与T细胞的特异性结合的存在。
本发明的第七个方面涉及根据抗原特异性分离哺乳动物T细胞的方法，该方法包括(i)将上面描述的寡聚MHC复合物与包含T细胞的悬浮液或生物学样品组合在一起，和(ii)将结合到所述复合物的T细胞从未结合的细胞中分离。
在还有一个方面，本发明还涉及可用于构建上面描述的嵌合肽的引物。


图1是本发明的寡聚MHC的I类复合物的示意图。该图显示完全组装的寡聚I类嵌合复合物的多个亚基中的两个。如所示，β2-微球蛋白(β2m)被融合到形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的卷曲寡聚化结构域(OD)上，并且通过第一接头(L1)与该结构域间隔开。在该结构域的C末端提供另一个接头(L2)，接着通过生物素蛋白连接酶BirA连接一个生物素酰化的识别序列(BP)，最后为用于纯化和检测的靶向/纯化结构域(TD)。还显示了被连接到生物素酰化肽(BP)形式的识别序列的赖氨酸残基上的生物素分子(bt)。具有结构域α1、α2和α3的互补的MHC I类α链与β2m以及抗原性肽(P)组装。显示了稳定复合物的MHC部分的二硫键(S-S)。还显示了其他的二硫键，说明了寡聚化结构域来源于COMP的特定情况，该结构域将组装成稳定的五聚体，其中这些二硫键在五聚体中连接每一对COMP结构域。复合物中的各条α链与β链的氨基和羧基末端分别用N和C表示。
图2是本发明的寡聚II类MHC复合物的示意图。该图一般地采用图1的命名，不同的是(β2m)替换为具有结构域α1、α2的II类MHC的α链，α链通过接头(L1)被融合到寡聚化结构域中。在此，α链与其互补的具有结构域β1、β2的II类MHC的β链组装。
图3显示一组包括限制性位点的示意图，说明(a)pETBMC04β2m-COMP表达构建体，以及(b)-(d)pETBMC01-03β2m-COMP中间分子克隆构建体，以及最后的(e)pETA2solHLA-A*0201α链表达构建体，如在后面详细描述。在(a)-(e)中用“*”记号表示终止密码子。
发明详述本发明的寡聚MHC复合物可以克服现有技术的不利方面和缺陷。更特别地，本发明人已经发现上述寡聚MHC复合物对T细胞受体具有比通过例如通过生物素和链霉抗生物素偶联的四聚化MHC复合物获得的寡聚物更高的亲和性。不期望受理论的束缚，一般认为，当三个或更多的MHC分子以所有结合面朝向相同方向被排列在基本上同一个平面上时可实现该亲和性的提高。相反，由于四聚的链霉抗生物素偶联复合物具有一个四面体排列，最好同时仅三个MHC结合结构域可用于与T细胞表面接触。根据本发明的复合物还可以含有效标记，同时最小化所选的标记物与活化MHC结构域之间的相互干扰，该标记物位于形成寡聚物的卷曲螺旋结构域的相对一端。
本发明的保护范围内的“形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质”的意思是包含寡聚化结构域的蛋白质。所述结构域包含两个或多个可能相同或不同的多肽亚基。两个或多个这种寡聚化结构域的亚基相互组装，使得寡聚化结构域中的各个亚基在被组装的状态下呈现基本上为螺旋状的构象，其中寡聚化结构域中的亚基被排列在确定的轴线上，其中寡聚化结构域在所述轴线上具有两个确定的相反末端，并且其中该多肽亚基中的至少两个在所述轴线上具有相同的氨基到羧基的朝向。相应的寡聚化结构域和形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质在本领域是已知的，例如被引用在本文的前言部分中。
寡聚化结构域可以来自任何种类的合适的形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白。优选地，MHC分子被融合到人模式的形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白的寡聚化结构域上，在这种情况下，不期望的免疫反应和/或排斥反应在复合物被施用给人时被最小化。
形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白的例子包括各种类型胶原蛋白，C型植物凝集素的三螺旋结构域，例如甘露糖结合蛋白(MBP)；Clq、肌球蛋白、亮氨酸拉链(如存在于p53的那些亮氨酸拉链)、GCN4、噬菌体P22Mnt阻抑物(repressor)；和血小板反应蛋白(trombospondin)家族蛋白质例如COMP。优选地，寡聚化结构域来源于软骨寡聚体基质蛋白COMP。更加优选地，由于上述原因，MHC分子被融合到人类模式的COMP的寡聚化结构域中。
被包含在本发明的寡聚MHC复合物中的嵌合蛋白的数量(n)通常取决于寡聚化结构域的类型，嵌合蛋白的第二部分来源于和通常可以为两个或多个蛋白，优选地n＝2-10，最优选地n＝3或5。如果被寡聚化的嵌合蛋白的第二部分例如来源COMP的五聚化结构域，嵌合蛋白的数量通常为5个，使得寡聚物为五聚体(n＝5)，而当这些寡聚化结构域来源于胶原蛋白，该数量为三(n＝3)。
本发明的第一个方面还涉及包含嵌合蛋白的寡聚MHC复合物，所述嵌合蛋白包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域。虽然第一部分的MHC肽链优选构成嵌合蛋白的N末端部分，而第二部分的寡聚化结构域位于嵌合蛋白的C末端，两个部分通常可以是任何顺序。但是，优选排列使得MHC部分在任何情况下保持其功能性特征。
如在此所用的术语“嵌合蛋白”是指单一的肽蛋白质，其氨基酸序列至少部分地来源于两种不同的天然蛋白质或者蛋白质链部分，在本发明中为MHC肽和基本上包含至少寡聚化结构域的重要部分的肽。在此以所用的术语“其功能性部分”所表示的肽链的一部分是指仍然具有自其中获得该部分的全长肽的期望的功能性特性。因此，对于MHC，肽链是指，如果需要，当用与其的互补MHC肽链完成(completed)或组装时，能够结合抗原性肽。术语“互补的”MHC肽链，是指天然MHC复合物中的相应的另一肽链。MHC复合物的α链的互补链是β链，反之亦然。
根据第一个实施方案，嵌合蛋白中的MHC肽链是MHC I类或II类的α链的细胞外部分。根据另一个实施方案，MHC肽链是MHC I类或II类的β链的细胞外部分。MHC蛋白质可以来自任何脊椎动物，例如灵长类，特别是人；啮齿类，包括小鼠、大鼠、仓鼠和兔；马、牛、犬、猫；等。特别有意义的是HLA蛋白，以及鼠H-2蛋白。HLA蛋白中包括的是II类亚基HLA-DPα、HLA-DPβ、HLA-DQα、HLA-DQβ、HLA-DRα和HLA-DRβ，以及I类蛋白质HLA-A、HLA-B、HLA-C、和β2-微球蛋白。在鼠H-2亚基中包括的是I类H-2K、H-2D、H-2L和II类I-Aα、I-Aβ、I-Eα和I-Eβ，和β2-微球蛋白。一些典型MHC蛋白的氨基酸序列在EP812 331中被提及。
在优选实施方案中，MHC肽链对应于可溶形式的正常膜结合蛋白。对于I类亚基，可溶形式通过缺失跨膜和细胞质结构域从天然形式获得。对于I类蛋白，可溶形式将包括α链的α1、α2和α3结构域。对于II类蛋白，可溶形式将分别包括α链或β链的α1和α2或β1和β2结构域。
跨膜结构域的包括不超过10个氨基酸，通常包括不超过约5个氨基酸，优选一个氨基酸也不包括。缺失可能扩展到α3结构域中的多达约10个氨基酸。优选α3结构域中没有一个氨基酸将被缺失。缺失应该是这样的，即不妨碍α3结构域折叠为功能性二硫键结合结构的能力。I类β链，β2m，在其天然形式下缺乏跨膜结构域，而不必被截断。一般地，II类亚基不与I类亚基结合使用。
上述缺失同样可被应用于II类亚基。其延伸到α2或β3结构域的多达10个氨基酸，优选地，α2或β3结构域的氨基酸都没有被缺失。缺失应该是这样的，即不妨碍α2或β3结构域折叠为功能性二硫键结合结构的能力。
根据需要，可将少数氨基酸导入多肽的末端，通常不超过25个氨基酸，更加通常不超过20个氨基酸。氨基酸的缺失或插入通常是克隆中要求的结果，例如，作为提供便捷的限制性位点等的结果，以及为了控制分子组装中的潜在空间排列问题。此外，由于类似原因，期望用不同的氨基酸取代一个或多个氨基酸，通常在任何一个结构域中取代不超过约5个氨基酸。
根据本发明，包含在如上描述的嵌合蛋白的第一部分中的MHC肽链优选在其C末端被融合到形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白的寡聚化结构域上。当COMP的五聚化结构域被用作寡聚化结构域时，该结构域包含、更加优选地为由在本发明公开的现有技术部分讨论的所述蛋白质的N末端的氨基酸1-128，优选地20-83，最优选地20-72构成。对于氨基酸编号，参见Efimov等，FEBS Letters 34154-58(1994)。此外，与本发明的嵌合蛋白的MHC部分类似，该结构域可以通过氨基酸取代、缺失或插入来改变，条件是寡聚化结构域的自组装不受损害。
如在图1和2中所示，在嵌合蛋白中，两种肽链MHC和寡聚化结构域的融合可以是直接的或者可以包括连接和间隔MHC肽和寡聚化结构域(OD)的第一接头(L1)。使用接头来连接是优选的。一般地，这种接头将包含不超过30个，优选不超过26个氨基酸。合适的接头在本领域是已知的，包括例如免疫球蛋白铰链区，或者丝氨酸甘氨酸重复序列。
如在图1和2的另外显示，本发明的嵌合蛋白优选在其C末端还可以以任何顺序包括，一个或多个第二接头(L2)、生物素酰化肽(BP)和标记结构域和/或纯化结构域(TD)。在优选实施方案中，本发明的嵌合蛋白以这种顺序包括所用3种上述结构域。一般地，第二接头包含不超过25个，优选不超过20个氨基酸，并且可以是与被描述用于上述第一接头的氨基酸相同的氨基酸。
可选择地包括在本发明的嵌合蛋白中的标记结构域可以是可用于标记蛋白的任何结构域。优选地，标记结构域包括一个标记物。该标记物可以被包括在结构域自身中，例如被抗体识别的表位或者发光可检测的或者放射性标记物。优选地，该标记物选自荧光标记物，例如FITC，藻胆蛋白，例如R-或B-藻红蛋白，异藻青蛋白，Cy3，Cy5，Cy7，发光标记物，放射性标记物例如125I、32p，酶例如辣根过氧化酶，或者碱性磷酸酶，例如碱性虾磷酸酶，表位，植物凝集素或生物素/链霉抗生物素。
如果标记物本身是一种蛋白时，用作标记物的蛋白质的多肽链可以被融合到嵌合蛋白上，优选以其C末端融合到标记蛋白。例如荧光蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)，或藻胆蛋白的亚基可以被用于该嵌合物中。GFP嵌合蛋白技术在本领域是已知的。包含适当的来自藻胆蛋白的结构域的嵌合蛋白被描述在例如WO 01/46395中。
或者，该标记物可以在标记结构域中提供的特定结合位点上被连接。例如，标记结构域可以包括生物素蛋白连接酶BirA的识别位点，使得可以进行位点特异性地生物素酰化标记结构域，从而被链霉抗生物素/生物素识别。BirA的合适识别序列被描述在EP711 303中。类似地，可以连接植物凝集素，或者往本发明的嵌合蛋白的氨基酸序列中导入修饰酶的氨基酸识别序列来进行任何其他位点特异性酶促修饰。其他可能的酶促修饰的类型被描述在Ep812 331中。或者，可以通过结合被适宜地标记的抗体或者抗体片段，例如被标记的F(ab)片段来进行标记。
可选择地被包括在本发明的嵌合蛋白中的纯化结构域可以是辅助本发明的蛋白质纯化的任何结构域，例如通过提供特异的结合特性。合适的序列是本领域技术人员知晓的，并且只要这些序列不干扰嵌合蛋白的功能性MHC和寡聚化结构域，都可以被应用。优选地，纯化结构域是六组氨酸序列。
根据第一个方面，本发明涉及通过上述嵌合蛋白的第二部分中的形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白的寡聚化结构域的自组装而寡聚化形成的寡聚MHC复合物。寡聚化结构域的寡聚化通常自发地发生，并生成稳定的嵌合蛋白的寡聚物。典型地，寡复合物将由多个相同单体亚基组成(至少在其MHC部分，取决于寡聚化结构域)。但是如果需要，在寡聚化之前可以将两种或多种MHC不同的嵌合蛋白混合。从而可以获得异质的(heterogeneous)寡聚物。但是，一般地，各个复合物中的嵌合蛋白中的至少两种将包含来自相同MHCα或β亚基的第一部分。当n＞2时，各个复合物中的寡聚物可含有至少两个这样的嵌合蛋白，即所述嵌合蛋白包含来自同一种MHC分子的一个第一部分。
优选地，使用COMP的寡聚化结构域，导致嵌合蛋白的稳定五聚物的自发组装。
寡聚MHC复合物可还包含互补的MHC肽链来形成如上讨论的功能性MHC结合复合物，并且可还包含与由I类复合物的MHCα1和α2结构域或者由II类复合物的MHCα1和β1结构域所形成的沟中的该复合物的MHC部分相结合的肽。优选该肽基本上是同质的。
对于具有I类MHC蛋白的复合物来说，抗原性肽长约6-14个氨基酸，通常约8-11个氨基酸。对于具有II类MHC蛋白的复合物来说，抗原性肽长约6-35个氨基酸，通常约10-20个氨基酸。该肽可以具有来自大量各种蛋白质的序列。在许多情况下，期望使用作为T细胞表位的肽。来自大量抗原的表位序列在本领域是已知的。
或者，可以通过分离和测序被结合到MHC蛋白上的肽来经验性地确定表位序列，通过从靶向序列中合成一系列假定的抗原性肽，然后分析T细胞对不同肽的反应活性，或者通过制备一系列含有这些肽的MHC-肽复合物并量化T细胞结合。肽的制备，包括合成肽的合成，鉴定序列以及鉴定相应的最小抗原性序列在本领域是已知的。无论如何，被包含在寡聚MHC复合物中的肽优选基本上是同质的，也就是说，优选这些肽的至少80％是相同的，更加优选至少90％和最优选至少95％。
在第二个方面，本发明涉及嵌合蛋白本身，嵌合蛋白可以被寡聚化为本发明的寡聚MHC复合物。嵌合蛋白包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域，所述卷曲螺旋蛋白质通过排列至少两条基本上相同模式的、且自其产生所述寡聚化结构域的多肽链而发生寡聚化。也就是说，被用于本发明的嵌合蛋白中的寡聚化结构域的形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白可以是同型寡聚物或者异型寡聚物。但是，典型地，嵌合蛋白在其寡聚化结构域中包含两个或多个拷贝的基本上相同的肽链部分，当形成寡聚物时，多肽链部分被排列。优选地，寡聚化结构域来源于COMP的五聚化结构域。优选的实施方案如上面对寡聚MHC复合物本身的讨论。
在第三方面，本发明涉及重组表达盒，其包含被可操作地连接到编码MHC肽链或其功能性部分的第一核苷酸序列和编码COMP的寡聚化结构域的第二核苷酸序列上的启动子序列。在第一个实施方案中，第一核苷酸序列编码MHC I类或II类α链的细胞外部分的MHC肽链。在第二个实施方案中，第一核苷酸序列编码MHC I类或II类β链的细胞外部分的MHC肽链。优选地，第二核苷酸序列编码COMP的氨基酸1-128，优选20-83，最优选20-72。优选地COMP序列来源于人COMP。
一般地，本文所用的命名和所描述的DNA重组技术中的实验室操作是本领域熟知和超过使用的那些。标准技术被用于DNA和RNA分离、扩增和克隆。一般地，包括DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性核酸内切酶等的酶促反应根据生产商的说明书来进行，使用由生产商提供的酶缓冲液。这些技术和各种其他技术通常根据本领域所知晓那样操作。如上文所讨论，MHC和形成寡聚物的卷曲螺旋结构域例如COMP结构域的合适核苷酸序列在本领域是已知的。
DNA构建体通常包括表达控制DNA序列，包括天然相关的或者异源的启动子区域，被可操作地连接到蛋白质编码序列上。该表达盒还抗原包括适当的起始和终止密码子、前导序列编码序列等，取决于所选择的宿主。该表达盒可以被插入到适合转化所选择的宿主和/或维持所述宿主中的稳定表达的载体中。
如在此所用的术语“可操作地连接”是指位于一条或多条DNA序列上游的启动子连接，使得该启动子能够调节DNA序列的转录。优选地，在能够转化或转染期望的真核或非真核宿主细胞的载体中，表达控制序列可以是那些真核的或非真核的启动子系统。一旦载体被插入到适当的宿主中，该宿主被维持在适合于高水平表达核苷酸序列，以及嵌合蛋白的收集和纯化的条件下。
可以根据熟知的操作从各种人或其他的细胞中分离来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白的适当寡聚化结构域的MHC-DNA序列和DNA序列，包括COMP的序列。典型地，从适当cDNA文库中扩增期望的序列，该文库从分离自适当细胞系的信使RNA制备。DNA序列的合适来源细胞以及用于表达和分泌的宿主细胞抗原从大量来源获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)或者其他的商业性供应商。
用于转染宿主细胞的核苷酸序列或表达盒抗原根据标准技术被改进来获得具有各种期望特性的嵌合分子。采用本领域技术人员熟知的各种DNA重组技术很容易设计和加工本发明的分子。例如，通过氨基酸插入、取代、缺失等，肽链可以在一级结构水平上区别于天然序列。这些修饰可以被用于大量组合中来制备最终的被修饰蛋白质链。一般地，修饰编码嵌合分子的基因可以很容易地通过各种熟知技术来实现，例如定点诱变。
如上面描述的氨基酸序列变体可以以各种期望的目的而被制备，包括提高目标T细胞的分子亲和性，提高或降低各个CD4或CD8共受体(coreceptor)与I或II类MHC复合物相互作用的分子亲和性，为了便于嵌合分子的纯化和制备或者为了提高体内和离体时复合物的稳定性。但是，变体通常分别地具有与天然MHC分子相同和相似的生物学活性，并且保留相关形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白的相应天然寡聚化结构域的寡聚化特性。
此外，寡聚物的制备是一个简单的过程。对于治疗用途，在哺乳动物细胞培养物中进行制备，例如在CHO、COS或人细胞系中。或者，其他的表达系统可以被用于表达本发明的分子，例如昆虫细胞培养物，包括杆状病毒和果蝇(Drosophila melanogaster)表达系统，或者原核表达系统，例如大肠杆菌(E.coli)。如果表达在原核表达系统中进行，可溶表达，即定向细胞质或外周胞质中，或者不可溶表达，即定向包涵体中都是可能的。
用于E.coli的典型载体是pET载体家族之一，其在可诱导的lac操纵子系统中结合了噬菌体T7 RNA聚合酶的有效表达。根据细胞宿主的类型，可以通过已知方法将含有目标核苷酸片段的载体转化到宿主细胞中。例如，化学感受态细胞或电感受态细胞的转化通常被用于原核细胞，而磷酸钙处理、阳离子脂质体或电穿孔可以被用于其他细胞宿主。被用于转染哺乳动物的其他方法包括使用1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(Polybrene)、原生质体嵌合、微粒轰击(microprojectiles)和微注射。
嵌合蛋白和互补的MHCα或β亚基在相同的细胞中分别被共表达和被组装成寡聚复合物。或者，这两种组分可以被分别地生产，并且存在选择用于形成稳定的寡聚MHC肽复合物的抗原性肽时这两种组分可以在体外组装。在后一种情况下，可以在嵌合蛋白寡聚化之前或者之后混合和结合这两种组分。
在体外结合各种组分的优点在于获得的寡聚MHC-肽复合物具有非常高的肽均匀性，例如，超过95％甚至超过99％。当复合物以完全组装的分子被表达时，将目标肽导入复合物中可以通过用含有目标抗原性肽的培养液培养表达细胞，或者通过在体外表达过程中用目标肽交换被内源性结合肽，这通常通过在打开抗原结合口袋的低pH或者高pH下，用过量肽培养被纯化的复合物来实现(参见例如，WO93/10220)。还可以采用标准操作例如光亲和标记来共价结合抗原性肽(参见例如WO93/10220)。
或者，该肽可以被直接地连接或融合到嵌合蛋白或其互补的α或β链的表达构建体。可以提供在肽部分和嵌合蛋白的N末端或其互补的α或β链之间的合适接头，例如多聚甘氨酸重复序列。在表达构建体中包括作为嵌合肽的肽，使得完整的MHC-肽寡聚复合物被表达和折叠，而不要添加抗原性肽或者进行肽交换。
体外进行亚基和嵌合蛋白的折叠和结合的条件在本领域是已知的。I类MHC肽复合物的组装以及功能性II类复合物的组装被描述在例如EP812 331中。作为可能条件的一个例子，大致克分子数相等的溶解的α和β亚基被混合在含有过量的目标肽的尿素溶液中。在II类MHC分子的情况下，通过稀释或透析到不含尿素的缓冲液中来起始再折叠。在约pH5-5.5下，将肽装载到空的II类异二聚体中，约1-3天以上，接着进行中和、浓缩和缓冲液交换。复合物的寡聚化应与α-β-肽复合物形成同时发生。或者，根据上面描述的方法，五聚化的α或β复合物在两个步骤中获得首先进行寡聚化结构域的寡聚化，接着在存在肽时与互补的α或β亚基再折叠。
本发明的被组装的复合物或者本发明的最初的分离嵌合蛋白及其互补的α或β亚基可以根据本领域的标准方法来纯化，包括硫酸铵沉淀，凝胶电泳，柱层析，包括凝胶过滤层析、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析等。
生成的本发明的肽链或者寡聚MHC复合物可以被用于治疗或者用于开发和实施分析方法、免疫染色等。本发明的寡聚MHC复合物的治疗用途需要鉴定可以用于治疗特定疾病的MHC单倍型(haplotype)和抗原。此外，在将根据本发明的复合物用于治疗用途之前，有必要确定患者的组织类型，但是，这些都是本领域熟知的标准方法。本发明特别适合用于癌治疗症、感染性疾病、自体免疫性疾病和防止移植排斥。基于这种疾病的病理学知识以及在相关动物模型中的研究结果，本领域技术人员能够鉴定和分离与各种这种疾病相关的MHC单倍型和抗原。
因此在第五个方面，本发明涉及包含上述寡聚MHC复合物的药用或诊断用组合物。包含蛋白质的药用组合物可以用于，例如，胃肠外施用，即皮下的、肌肉内的或者静脉内的。此外，大量新的药物呈递方法被开发。同样，本发明的药用组合物适合采用这些新方法施用。
胃肠外施用的组合物将通常包含嵌合蛋白或其五聚物的溶液，被溶解在可接受载体中，优选为水溶液载体。可以使用各种水溶液载体，例如缓冲水溶液，0.4％生理盐水，0.3％甘氨酸等。这些溶液是无菌的，并且通常不含微粒物质。这些组合物可以通过常规的熟知灭菌方法来灭菌。组合物可以含有作为近似生理条件所需的药用可接受的辅助物质，例如pH调节和缓冲剂，毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中的嵌合蛋白的浓度可以极大地变化，即小于约1pg/ml，通常至少约0.1mg/ml，到高达10-100mg/ml，主要根据所选用的特定施用模式根据液体体积、粘性等选择。
用于肌肉内注射的典型药用组合物可以被制备为含有1ml无菌缓冲水和0.1mg寡聚物复合蛋白。用于静脉内灌注的典型组合物可以被制备为含有250ml无菌Ringer溶液和10mg寡聚复合蛋白。用于制备胃肠外施用的组合物的已有方法对于本领域技术人员来说是已知和显然的。
本发明的嵌合蛋白或寡聚MHC复合物可以被冻干来保存，并且使用前在合适的载体中被重新制备。这种技术已经被证实是有效的，并且可以采用常规使用的冻干和重新配制技术。本领域技术人员可以预期，冻干和重新配制会导致不同程度的活性损失，必须调整使用水平来弥补损失。
如上文所述，根据抗原受体的特异性来检测或分离T细胞可以包括任何已知技术。适合的技术包括例如被公开在EP812331中的技术，该专利在此引入作为参考。更加详细的，本发明的寡聚MHC复合物可以被用于标记和检测悬浮液或其他生物学样品中的抗原特异性T细胞，例如组织样本，或者可以被用于分离T细胞，例如被结合或固定在底物上的T细胞，底物包括本领域技术人员知晓的顺磁性的或其他的珠，或者通过流式细胞计数法。
因此，在各种疾病状况下，本发明的复合物可以被用于例如纯化和富集对特定抗原特异的T细胞，并且在扩增和/或在细胞培养中的其他加工后，将这些T细胞重新导入患者自身中。或者，例如在自体免疫紊乱或者其他不期望的T细胞免疫反应的情况下，T细胞可以被选择性地清除。
由于根据本发明的寡聚MHC复合物对特定T细胞受体的亲和性被提高，它们具有改进的药物功效、更长的血清半衰期以及被改进的药物代谢动力学，后者可能是由于分子量变大。
由于包含在本发明的寡聚MHC复合物中的嵌合蛋白和互补的α或β部分可能在非真核系统中被表达，还容易高产量地制备它们，而且作为亚组分被表达，随后在存在同种型抗原性肽群体时，它们能够相互再折叠。
根据前面的描述，本领域技术人员已经了解了这些和其他的优点。如下的实施例是仅用于说明的目的，而不被解释为以任何方式限定本发明。
实施例如下是五聚I类MHC复合物的克隆、表达和纯化的详细实施例，该复合物包含β2m与COMP的嵌合融合。嵌合β2m-COMP蛋白在E.coli的不溶性包涵体中被表达，随后在体外以五聚β2m-COMP被组装。然后，在存在呈递T细胞抗原的适当合成结合肽时，在第二次再折叠反应中，通过结合β2m-COMP五聚体与称作HLA-A*0201的人I类MHCα分子形成五聚I类MHC肽复合物。在该实施例中，使用被充分表征的来自EB病毒BMLF1蛋白GLCTLVAML(氨基酸289-297)的抗原。在流式细胞计数应用中，生成的复合物用荧光单位标记被用作从混合的淋巴细胞群体中检测抗原特异性T细胞的染色剂。
1.β2m-COMP构建体的分子克隆该方案包括顺序将β2m克隆到pET-24c载体中，得到称作pETBMC01的构建体，接着通过将生物素蛋白连接酶BirA的位点特异性生物素酰化的生物素受体序列(BP)插入软骨寡聚体基质蛋白(COMP)的寡聚化结构域中，得到称作pETBMC02的构建体。第三，将多聚甘氨酸接头克隆到β2m和COMP之间，得到称作pETBMC03的构建体，最后，通过定点诱变去除丝氨酸残基，这些丝氨酸残基在多聚甘氨酸接头的前面，得到最后的β2m-COMP/pET-24c构建体，称作pETBMC04(还参见图3)。去除丝氨酸残基以避免β2m分子与I类MHCα链蛋白结合时的空间障碍。
1.1.将β2m克隆到pET-24c载体中β2m来源β2m的细胞外部分包括由74bp-370bp的DNA序列编码的99个氨基酸(相当于成熟蛋白的Ile1-Met99)。β2m的该区域从正常的人淋巴细胞cDNA文库中扩增，采用分别插入NdeI和BamH I限制性位点的引物BMC#1(1μM)和BMC#2(1μM)(Sigma-Genosys，参见附件I的引物序列)通过聚合酶链反应(PCR)扩增。在添加2mM MgSO4和0.2mM各种dNTP的Pfx扩增缓冲液(由生产商提供)中用校正读码DNA聚合酶(Pfx，Invitrogen)(1.25μ)进行扩增，遵循标准的热循环条件。步骤194℃，4min；步骤294℃，1min；步骤355℃，1min；步骤472℃，30sec；步骤5循环到步骤2，34x，步骤672℃10min。
限制性酶消化β2m和pET-24c采用QIAquick PCR纯化试剂盒根据生产商的介绍(Qiagen)从上述混合物中纯化β2m PCR产物。根据生产商的介绍，200ng被纯化的PCR产物和1μg pET-24c载体(Novagen)各自用BamH I(10U)和Nde I(10U)限制性酶(New England Biolabs，NEB)在37℃下消化4h。被消化的片段通过水平凝胶电泳在1％琼脂糖(Bioline)中分离，并根据生产商的介绍(Qiagen)，用QIAEXII凝胶提取试剂盒纯化。
将β2m连接到pET-24c(pETBMC01)凝胶纯化的插入物和载体DNA以1∶3摩尔比(载体∶插入物，50ng∶7.5ng)在T4DNA连接酶缓冲液(提供的)中用T4DNA连接酶(5U；Bioline)在16℃下连接16h。
pETBMC01转化到E.coli宿主菌株XL1-Blue中根据生产商的介绍(Stratagene)，连接混合物和适当的对照随后被转化到XL1-Blue菌株感受态E.coli细胞中。通过将细胞添加到含有30μg/ml卡那霉素的Luria-Bertani(LB)琼脂平板中并在37℃下培养过夜来选择成功的转化体。
PCR筛选转化体从细菌转化平板选择的单一克隆用T7启动子(1μM)和T7终止子(1μgM)引物(Sigma Genosys，参见附件I的引物序列)通过PCR筛选，这些引物与克隆位点侧面的pET载体区域互补。在添加了2mM MgSO4和0.2mM dNTPs的Taq反应缓冲液(被提供的)中用Taq DNA聚合酶(1U，Bioline)进行扩增，采用25个上面描述的热循环反应。成功的转化体生成约500bp的DNA片段，通过1.5％琼脂凝胶电泳来确定。
质粒DNA的制备产生正确大小的PCR产物的细菌转化体被接种到6ml的无菌LB-卡那霉素培养液中，以200rpm摇晃在37℃下培养过夜。采用QIAprepSpin Mini-prep试剂盒，根据生产商的介绍(Qiagen)，从细菌培养物中去除pETBMC01质粒DNA。通过自动DNA测序，进一步确定这些质粒中存在β2m片段。
pETBMC01的示例性图解被显示在图3(b)，特别地说明限制性位点。
1.2.将COMP-BP克隆到pETBMC01中COMP-BP表达盒的合成COMP的寡聚化结构域的序列从Genbank数据库(登录号#1705995)中获得，而编码卷曲螺旋结构域(氨基酸21-85)的区域是基于COMP的自组装试验来选择(Efimov等，FEBS Letters 34154-58(1994))。生物素受体序列′BP′SLNDIFEAQKIEWHE被插入到C末端，而且包括额外的14个氨基酸的接头PQPQPKPQPKPEPET以便在COMP寡聚化结构域和BP之间提供一个物理分隔。
在PCR组装反应中采用重叠互补的寡核苷酸(BMC#3、BMC#4、BMC#5、BMC#6、BMC#7和BMC#8)来合成整个区域。寡核苷酸序列被详细描述在附件I，并通过Sigma-Genosys合成和纯化(′PAGE-纯化′)。在添加了1mM ATP的正向反应缓冲液(被提供的)中，用T4激酶(10U，Gibco)在37℃下磷酸化引物(4.8pmol)1h。通过加热到80℃15min来终止反应，然后冷却到室温，使寡核苷酸退火。用T4DNA连接酶如1.1节将退火的寡核苷酸连接在一起，并将大约10ng用于PCR中来“填充”(fill in)该序列的末端和扩增合成基因。PCR反应基本上如1.1节中所描述，除了BMC#3(15μM)和BMC#8(15μM)被用作正向和反向引物在如下热循环条件中步骤195℃，4min；步骤295℃，1min；步骤370℃，1min；步骤472℃，2min；步骤5循环到步骤2，15x；步骤672℃，10min。如先前描述(1.1节)，凝胶纯化正确大小的PCR产物。
将COMP-BP表达盒插入中pETBMC01来制备pETBMC02如1.1节中所描述，用Hind III(10U)和Xho I(10U)限制性酶(NEB)在37℃下消化200ng被纯化的COMP-BP和1μg pETBMC01载体4h。如1.1节，消化产物被纯化、连接、转化和PCR筛选。筛选为阳性的质粒如1.1节被纯化和测序。
pETBMC02的示意图被显示在图3(c)中，图解限制性位点。在该构建体中，编码COMP-BP的部分位于框外(out-of-frame)。
1.3.将多聚甘氨酸接头克隆到pETBMC02中多聚甘氨酸接头的合成多聚甘氨酸接头通过退火重叠寡核苷酸BMC#9和BMC#10(Sigma-Genosys，’PAGE-纯化′，附件I)来合成。当以正确的读框被编码时，多聚甘氨酸接头包含如下的单字母氨基酸密码子的基序GS(GGGGS)4GGK。前两个残基由BamH I限制性位点编码，而最后一个残基由Hind III限制性位点编码。由于多聚甘氨酸接头的核苷酸序列仅包括剪切BamH I限制性位点的5′突出端以及剪切Hind III核苷酸识别基序的3′突出端，因此不必消化被退火的产物来制备适合后续连接的互补单链突出端。如1.2节所描述，寡核苷酸被磷酸化和退火。
将多聚甘氨酸接头插入pETFBMC02来制备pETBMC03用BamH I(10U)和Hind III(10U)消化pETBMC02。如先前所描述(1.1节)，将退火的多聚甘氨酸接头连接到pETBMC02中，假定96fmole的退火寡核苷酸/μl。转化和PCR筛选反应如1.1节所描述进行，但是，通过限制性酶消化PCR筛选产物来确定Sal I限制性位点的存在与否来证实存在插入的接头。成功的转化体从质粒载体主链上去除Sal I位点，不受Sal I消化影响。pETBMC03的纯化和自动测序如1.1节所描述进行。
pETBMC03的示意图显示在图3(d)中，图解限制性位点。BamH I位点编码多聚甘氨酸序列之前的丝氨酸残基。最后去除丝氨酸残基来产生如3(a)图解的pETBMC04。
1.4.缺失多聚甘氨酸接头之前的丝氨酸残基pETBMC03的定点诱变I类MHC分子的X射线晶体学模型分析表明，β2m的C末端紧邻α链的α3结构域。因此，期望通过去除由BamH I限制性基序编码的丝氨酸残基，生成包含G(GGGGS)4GGK的接头，在多聚甘氨酸接头的起始部分获得最大弹性。获得PCR引物BMC#11和BMC#12(′PAGE-纯化’，附件I)，其使得可以去除BamH I识别基序内的编码丝氨酸的TCC三联体，采用定点诱变试剂盒(′QuickChange′，Stratagene)并严格根据生产商的介绍。通过自动测序(1.1节)来确认该构建体的正确模式，并被命名为pETBMC04。
pETBMC04的示意图被显示在图3(a)中。特别地，该图显示pET24c中的生成的β2m-COMP构建体(pETBMC04)的示意图，图解限制性位点。
2.HLA-A*0201α链构建体的分子克隆2.1.将A*0201α链克隆到pET-11d载体中HLA-A*0201α链(EMBL M84379)的细胞外部分包含由信使RNA序列的碱基73-900编码的276个氨基酸(相当于成熟蛋白的Gly1-Pro276)。A*0201序列分别从正常的人淋巴细胞cDNA文库中通过PCR扩增得到，采用分别插入Nco I和BamH I限制性位点的引物A2S#1和A2S#2。用于将A*0201插入物克隆到Nco I/BamH I消化的pET-11d载体(Novagen)中的方法基本上如在1.1节中描述的用于克隆β2m的方法。
生成的质粒称作pETA2sol，示意图被显示在图3(e)中，图解限制性位点。
3.β2m-COMP和HLA-A*0201α链的表达实施相同的方法来制备β2m-COMP或A*0201α链蛋白。在制备大规模细菌制备物中，质粒DNA被转化到E.coli表达宿主菌株。在细菌细胞中蛋白质以不溶的包涵体被制备，并通过超声波处理来收获。被纯化的包涵体被溶解在变性缓冲液中，在-80℃存储备用。除非特别指出，化学试剂从Sigma购买。
3.1.大规模制备重组蛋白质将pETBMC04和pETA2sol转化到E.coli宿主菌株BL21(DE3)pLysS中被纯化的质粒DNA被转化到BL21(DE3)pLysS E.coli菌株中，该菌株具有起始从pET构建体中表达蛋白质所需的T7 RNA聚合酶的染色体拷贝。在各个反应中采用0.5μg被纯化的质粒DNA，根据生产商的介绍，适当控制来实施转化BL21(DE3)pLysS感受态细胞(Stratagene)。除了含卡那霉素30μg/ml(pETBMC04)或100μg/ml氨苄青霉素(pETA2sol)外，在含有34μg/ml氯霉素的LB-琼脂平板上选择成功的转化体。
E.coli培养物的生长将单一的细菌转化体集落接种到60ml含有用于筛选的适当抗生素的无菌LB培养液中，在温室中(约24℃)直立放置过夜。生成的过夜培养物被添加到6升LB中并在3℃下摇晃(约240rpm)生长，直到对数中期(OD600＝0.3-0.4)。在该阶段通过往各个培养瓶中添加1.0ml 1M IPTG来诱导蛋白质表达。该培养物在37℃下摇晃再放置4h，此后，通过离心来收集细胞，并弃去上清液。
蛋白质的超声波处理和回收在冰上在小的玻璃烧杯中，将细菌细胞沉淀重悬在冰冷的平衡盐溶液中，并进行超声波处理(XL系列超声波仪；Misonix Inc.，美国)，以溶解细胞并释放蛋白质包涵体。一旦细胞被完全溶解，在Beckman超速离心机(J2系列)中以15,000rpm离心10min，包涵体被旋转沉淀在50ml聚碳酸酯Oak Ridge离心管中。然后包涵体在冰冷的Triton洗涤缓冲液(0.5％TritonX-100，50mM Tris，pH 8.0，100mM氯化钠，0.1％叠氮化钠和新添加的2mM二硫苏糖醇[DTT])中洗涤三次，在每次洗涤后使用手持的玻璃匀浆器来重悬沉淀。接着最后在不含去垢剂的洗涤缓冲液中洗涤。
生成的被纯化的蛋白质制备物被溶解在20-50ml的含有50mM MES，pH 6.5，0.1mM EDTA和1mM DTT的8M尿素缓冲液中，上下颠倒旋转在4℃下放置过夜。通过离心来去除不溶的颗粒，使用Bradford蛋白质分析试剂(Bio-Rad Laboratories)和与已知的标准物比较来确定蛋白质产量。通过在15％十二烷基硫酸钠凝胶(SDS-PAGE)上垂直电泳样本来验证表达和纯化的质量。典型的蛋白质产量为25-75mg/L LB培养物。β2m-COMP和A*0201α链蛋白质的大小分别约27(kD)和35kD。尿素溶解的蛋白质被分配在10mg等分试样中和在-80℃下存储用于以后使用。
4.五聚β2m-COMP复合物的形成4.1.β2m-COMP组装成五聚体通过将蛋白质稀释到含有0.2M氯化钠和1mM EDTA的20mMCAPS缓冲液，pH 11.0中，生成1.5mg/ml的最终蛋白浓度，来进行从溶解于尿素的包涵体中组装β2m-COMP。通过添加最终浓度分别为20mM和2mM的氧化型和还原型的谷胱甘肽在室温下氧化该蛋白质。培养过夜，通过在10％双tricine凝胶(Invitrogen)上进行非还原SDS-PAGE来分析二硫键形成。
蛋白质混合物随后通过缓冲液交换到20mM Tris，pH 8.0，50mM氯化钠(′S200缓冲液′)中，采用Centricon Plus-20超速离心离心机(截留(cut-off)10kD分子量，Milllipore)根据生产商的介绍，离心到最终体积为4.5ml，在用BirA(Affinity，Denver，Colorado)的酶促生物素酰化的制备中。加入0.5ml的10x BirA反应缓冲液(被提供的)，重组BirA酶的最终浓度为10μM，添加了10mM ATP，pH 7.0。选择蛋白酶抑制剂来用于保护蛋白质0.2mM PMSF，2Hg/ml抑酶肽和2μg/ml亮抑酶肽。在室温下反应4h。
4.2.生物素酰化的β2m-COMP五聚体的纯化通过大小排阻层析(SEC)在Superdex 200HR 26/60柱(AmershamBiosciences)上纯化生物素酰化的β2m-COMP，流动相为S200缓冲液。该柱先被校准并根据生产商的介绍使用，收集135kD区域的含有五聚体的级份。采用Bradford分析来确定蛋白质的回收，通过使用HABA试剂(Pierce)根据生产商的介绍来确定生物素酰化效率。
5.再折叠的HLA-A*0201/GLCTLVAML复合物的形成5.1.再折叠HLA-A*0201α链和生物素酰化的β2m-COMP和肽如下制备500ml再折叠缓冲液100mM Tris，pH 8.0，400mM L-精氨酸氢氯化物，2mM EDTA，5mM还原谷胱甘肽和0.5mM氧化谷胱甘肽，溶解在去离子水中，并在4℃下搅拌。将15mg冻干的合成肽GLCTLVAML溶解在0.5ml二甲基亚砜中，添加到再折叠缓冲液中，同时搅拌。随后加入50mg生物素酰化的五聚β2m-COMP和30mgA*0201α链，通过23规格的皮下注射用针头直接注射到剧烈搅拌的缓冲液中，以确保充分分散。然后将再折叠混合物在4℃下轻轻搅拌16h。
5.2.再折叠的五聚HLA-A*0201/GLCTLAML复合物的纯化随后采用MiniKros中空纤维超滤筒(Spectrum Labs，RanchoDominguez，California)将蛋白再折叠混合物从500ml浓缩到20ml，截留30kD的分子量。采用Centricon Plus-20离心离心机(截留30kD分子量)，根据生产商的介绍，进一步将复合物从20ml浓缩到5ml，接着采用一次性PD10脱盐柱(Amersham Biosciences)，根据生产商的介绍，通过缓冲液交换成S200缓冲液。最终体积为7.5ml。被浓缩的蛋白质再折叠混合物首先在Superdex 200HR 26/60凝胶过滤层析柱上通过SEC纯化，如4.2节。收集含有区域在310kD蛋白质复合物的级份。
汇集从SEC收集的级份，并在MonoQ HR5/5柱(AmershamBiosciences)上通过阴离子交换层析进一步纯化，流动15倍柱体积的盐梯度为0-0.5M氯化钠的20mM Tris。收集主峰。通过分析来确定Bradford蛋白质回收。
5.3.纯化复合物的荧光标记由于每个链霉抗生物素能够结合多达4个生物素单位，最终用藻红蛋白(PE)偶联的链霉抗生物素标记是以1∶0.8的链霉抗生物素与生物素酰化五聚复合物来进行，考虑了在4.2节中β2m-COMP的初始生物素酰化效率的测定值。五聚体复合物的总需要量被细化(例如细化为5等份)并被连续滴定为链霉抗生物素-PE。A*0201五聚体-链霉抗生物素复合物的浓度被用添加了0.01％叠氮化物和1％BSA的磷酸缓冲生理盐水(PBS)调节为1mg/ml。生成的荧光试剂被存储在4℃下。
6.抗原特异性T细胞的染色外周血淋巴细胞(PBL)从健康的、A*0201阳性的EBV携带者采血获得，该携带者已经被证明会对GLCTLVAML抗原产生强烈的细胞毒性T细胞反应。通过在聚蔗糖(Amersham Biosciences)中进行密度梯度离心来分离PBL，在PBS溶液中洗涤，并计数。1-2×106个淋巴细胞被分配用于各个染色条件，细胞在1ml洗涤缓冲液(0.1％叠氮化钠，0.1％BSA溶于PBS)中洗涤一次，然后重悬在50μl洗涤缓冲液中。1μg PE-标记的A*0201/GLCTLVAML五聚体被用于染色一个细胞的等分试样，与抗CD8抗体(Dako)结合，来鉴定细胞毒性T细胞群体。悬浮液在冰上在黑暗中温育至少30min，此后细胞在洗涤缓冲液中洗涤两次，并在黑暗中在固定溶液(1％胎牛血清，2.5％甲醛溶于PBS)存储。此后，根据本领域熟知的标准方法，在Becton-Dickinson FACScanTM流式细胞计数仪分析样本，采用CellQuest软件。
附件I用于合成DNA构建体的引物的表格引物名称Seq ID No.方向序列(5′-3′)GCA TCA CCA TAT GAT CCA GCG TAC TCCBMC#11正向AAA GAT TCA GGCTA CAA GGA TCC C ATG TCT CGA TCC CACBMC#22反向TTA ACT ATTAA AGC TTC AGG GCC AGA GCC CGT TGGBMC#33正向GCT CAG ACC TGG GCC CGC AGA TGC TTCGGG AAC TGC AGG AAA CCA ACG CGG CGGAA CGT GAT CTC CCT GAC CTG CTG CCGBMC#44反向CAG CAG CTC CCG CAC GTC CTG CAG CGCCGC GTT GGT TTC CTG CAG TTC CCG AAGCTG CAG GAC GTC CGG GAG CTG CTG CGGBMC#55正向CAG CAG GTC AGG GAG ATC ACG TTC CTGAAA AAC ACG GTG ATG GAG TGT GAC GCGTAC GGC CGC ACG CTG GGT AGG CCG GTGBMC#66反向CGT ACT GAC TGC TGC ATC CCG CAC GCGTCA CAC TCC ATC ACC GTG TTT TTC AG
TGC GGG ATG CAG CAG TCA GTA CGC ACCGGC CTA CCC AGC G TAC GGC CGC CGCBMC#77正向AGC CGC AGC CGA AAC CGC AGC CGA AACCGG AAC CGG AAA CTA GTT TGA ACG ACATCTAC TCG A GT TCG TGC CAT TCG ATT TTCTGA GCC TCG AAG ATG TCG TTC AAA CTABMC#88反向GTT TCC GGT TCC GG TTT CGG CTG CGGTTT CGG CTG CGG CTG CGAT CCG GTG GTG GTG GTT CTG GTG GTGBMC#99正向GTG GTT CTG GTG GTG GTG GTT CTG GTGGTG GTG GTT CTG GTG GTAAGC TTA CCA CCA GAA CCA CCA CCA CCABMC#10 10反向GAA CCA CCA CCA CCA GAA CCA CCA CCACCA GAA CCA CCA CCA CCGBMC#11 11正向GAG ACA TGG GAG GTG GTG GTG GBMC#12 12反向CCA CCA CCA CCT CCC ATG TCT CGCA TCA CCA TGG GTT CTC ACT CTA TGAA2S#1 13正向GGT ATT TC
GCA TAC GGA TCC TTA CGG CTC CCA TCTA2S#2 14反向CAG GGT GAG GT7启动子15正向TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT7终止子16反向GCT AGT TAT TGC TCA GCG G
序列表<110>普罗伊缪因有限公司<120>嵌合MHC蛋白及其寡聚物<130>PIO3<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>38<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Oligonucleotide(Forward)<400>1gcatcaccat atgatccagc gtactccaaa gattcagg38<210>2<211>36<212>DNA<213>Artificial<220>
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<220>
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<223>Oligonucleotide(Reverse)
<400>12ccaccaccac ctcccatgtc tc22<210>13<211>35<212>DNA<213>Artificial<220>
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<223>Oligonucleotide(Reverse)<400>14gcatacggat ccttacggct cccatctcag ggtgagg 37<210>15<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Oligonucleotide(Forward)<400>15taatacgact cactataggg20
<210>16<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>Oligonucleotide(Reverse)<400>16gctagttatt gctcagcgg19
权利要求
1.包含至少两种嵌合蛋白的寡聚MHC复合物，所述嵌合蛋白包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域，其中通过在嵌合蛋白的寡聚化结构域处发生寡聚化而形成所述寡聚MHC复合物，且其中有至少两个所述的第一部分来源于同一种MHC肽链。
2.权利要求1的寡聚MHC复合物，其中所述嵌合蛋白的第一部分来源于MHC I或II类的α链的细胞外部分。
3.前述权利要求中任一项的寡聚MHC复合物，其中所述嵌合蛋白的第一部分来源于MHC I或II类的β链的细胞外部分。
4.前述权利要求中任一项的寡聚MHC复合物，其中至少一种嵌合蛋白的第二部分中所包含的寡聚化结构域来源于人软骨寡聚基质蛋白(COMP)的五聚化结构域。
5.权利要求4的寡聚MHC复合物，其中至少一种嵌合蛋白的第二部分中所包含的COMP的五聚化结构域包含并优选地由COMP的第1-128位、优选地第20-83位、和最优选地第20-72位氨基酸组成。
6.前述权利要求中任一项的寡聚MHC复合物，其中至少一种嵌合蛋白还包含位于所述MHC肽链和寡聚化结构域之间的一个第一接头。
7.前述权利要求中任一项的寡聚MHC复合物，其中至少一种嵌合蛋白还包含选自第二接头、标记结构域和纯化结构域的一或多个结构域。
8.前述权利要求中任一项的寡聚MHC复合物，其还包含与所述嵌合蛋白中的至少两种互补的MHC肽链，以形成功能性MHC结合复合物。
9.权利要求8的寡聚MHC复合物，其还包含与由I类复合物的MHCα1和α2结构域或者由II类复合物的MHCα1和β1结构域所形成的沟中的该复合物的MHC部分相结合的肽。
10.权利要求9的寡聚MHC复合物，其中所述肽基本上是同质的。
11.前述权利要求中任一项的寡聚MHC复合物，其包含一种标记物。
12.权利要求11的寡聚MHC复合物，其中所述标记物选自光可检测标记物、放射性标记物、酶、表位、植物凝集素或生物素。
13.嵌合蛋白，其包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域，所述卷曲螺旋蛋白质通过排列至少两条基本上相同模式的、且自其产生所述寡聚化结构域的多肽链而发生寡聚化。
14.权利要求13的嵌合蛋白，其包含来源于人的软骨寡聚体基质蛋白(COMP)的五聚化结构域的寡聚化结构域。
15.权利要求14的嵌合蛋白，其中所述寡聚化结构域包含并优选地由COMP的第1-128位，优选地第20-83位，和最优选地第20-72位氨基酸组成。
16.重组表达盒，其包含可操作地连接于编码如权利要求13至15中任一项所定义的嵌合蛋白的核苷酸序列的启动子序列。
17.包含权利要求16的重组表达盒的载体。
18.药用或诊断用组合物，其包含权利要求1-12中任一项的寡聚MHC复合物，任选地与一种药用可接受的载体组合。
19.根据抗原受体的特异性来标记和/或检测哺乳动物T细胞的方法，该方法包括(i)将权利要求1-12中任一项的寡聚MHC复合物与包含T细胞的悬浮液或者生物学样品组合在一起，和(ii)检测所述复合物与T细胞的特异性结合的存在。
20.根据抗原受体的特异性来分离哺乳动物T细胞的方法，该方法包括(i)将权利要求1-12中任一项的寡聚MHC复合物与包含T细胞的悬浮液或者生物学样品组合在一起，和(ii)将结合到所述复合物上的T细胞自未结合的细胞中分离。
21.由选自如下一组的DNA序列组成的引物，所述的组由BMC#1(Seq ID No.1)、BMC#2(Seq ID No.2)、BMC#3(Seq ID No.3)、BMC#4(SeqID No.4)、BMC#5(Seq ID No.5)、BMC#6(Seq ID No.6)、BMC#7(Seq IDNo.7)、BMC#8(Seq ID No.8)、BMC#9(Seq ID No.9)、BMC#10(Seq IDNo.10)、BMC#11(Seq ID No.11)、BMC#12(Seq ID No.12)、A2S#1(Seq IDNo.13)和A2S#2(Seq ID No.14)组成。
全文摘要
本发明涉及包含至少两种嵌合蛋白的寡聚MHC复合物，所述嵌合蛋白包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域，其中通过在嵌合蛋白的寡聚化结构域处发生寡聚化而形成所述寡聚MHC复合物，且其中有至少两个所述的第一部分来源于同一种MHC肽链。本发明还涉及一种嵌合蛋白，其包含一个第一部分和一个第二部分，所述第一部分来自一种MHC肽链或其功能性部分，而所述第二部分包含来自形成寡聚物的卷曲螺旋蛋白质的寡聚化结构域。本发明还涉及根据抗原受体的特异性标记和/或检测哺乳动物T细胞的方法，该方法通过将根据权利要求1－12中任一项的寡聚MHC复合物与包含T细胞的悬浮液或生物学样本相结合，并检测所述复合物与T细胞的特异性结合的存在。最后，本发明涉及由DNA序列构成的、用于上述嵌合蛋白的遗传工程化的引物。
文档编号C07K14/435GK1708512SQ03819805
公开日2005年12月14日 申请日期2003年8月14日 优先权日2002年8月21日
发明者尼古拉·弗朗茨·格雷戈尔·施瓦贝, 陈清珠, 凯瑟琳·伊丽莎白·纳珀, 杰里米·威廉·弗里, 彭苏珊, 雷切尔·凯特·斯普纳 申请人:普罗伊缪因有限公司