分泌肽缺失型CD107a:本发明中的分泌肽缺失型CD107a是成熟的CD107a(Seq ID NO.10)，即通过基因编辑去掉了野生型CD107a(Seq ID NO. :8)的分泌肽(信号肽)氨基酸序 列一MAAPGSARRPLLLLLLLLLLGLMHCASAA，通过基因合成与IL-12连接成全新的融合蛋白。 [0024]应理解，在本发明中，所述的CD107a可以是来自哺乳动物(人或非人哺乳动物），也 可以来自其他真核物种。优选地，⑶l〇7a是来自人的野生型⑶107a。
[0025] IL-12是一种非常重要的免疫刺激因子。IL-12是由共价键链接的异质性二聚体细 胞因子，由P35和p40亚基组成，在体内由激活的免疫细胞分泌。
[0026]应理解，在本发明中，所述的IL-12可以来自人或非人哺乳动物，可以是全长的、成 熟形式的IL-12,或其活性片段。此外，所述的IL-12(或IL-12蛋白元件)可以是单个亚基或 多个亚基。例如，在本发明中，所述的第一蛋白元件可包括IL-12蛋白的一个或多个（如两 个)亚基。
[0027] 在另一优选例中，所述的第一蛋白元件包括连接在一起的IL-12蛋白P40和P35亚 基。
[0028]在另一优选例中，所述的P40和P35亚基的连接方式没有特别限制，包括"头-头"、 "头-尾"、"尾-头，，、"尾-尾，，相连，其中"头，，指多肽的N端，"尾，，指多肽的C端。
[0029]此外，在P40和P35亚基之间可以存在或不存在接头（linker)。较佳地，所述的接头 为柔性的4-20个氨基酸的接头，更佳地，所述的接头为GGGGGGS(G6S)(SEQ ID N0. :14)。
[0030] 肽接头:本发明的双功能融合蛋白可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可 能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白 在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋 白的稳定性的影响。
[0031] 连接肽的长度一般为0-15个氨基酸，较佳地1-15个氨基酸。
[0032] 优选的连接肽例子包括(但并不限于）：SEQ ID NO. :11-14所示的连接片断。
[0033] 信号肽和前导肽:本发明中融合蛋白还可含有其他元件，代表性的元件包括(但并 不限于）：信号肽、前导肽等。
[0034] 在本发明的一个实例中，融合蛋白含有信号肽。代表性的例子包括(但并不限于）： 人源的IL-12 P40亚基的信号肽。
[0035]双功能融合蛋白及其制备:如本文所用，除非另外说明，所述的融合蛋白是一种分 离的蛋白，与其它蛋白、多肽或分子无联系，是重组宿主细胞所表达的，或经分离或纯化的 产物。
[0036]在本发明中，"重组双功能融合蛋白"、"本发明蛋白"、"本发明融合蛋白"、"双功能 融合蛋白"、"IL-12-缺失分泌肽CD107a融合蛋白"、"IL-12/无分泌肽CD107a融合蛋白"可互 换使用，指具有式la所述结构，或者Ila所述结构，即含有包括IL-12蛋白元件，缺失分泌肽 CD107a的蛋白元件和连接肽元件的融合蛋白。一个代表性的例子是IL12-缺失分泌肽 CD107a。本发明蛋白可以是单体或由单体形成的多聚体(如二聚体）。此外，应理解，所述术 语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物。
[0037] 一种优选的融合蛋白的序列如SEQ ID N0. :4所示，其中第1-328位为IL-12的P40 亚基;第329-335位为G6S连接肽;第336-532位为IL-12的P35亚基;第533-537位为SGSG连接 肽(SEQ ID NO.: 12);第537-924位为无信号肽CD107a氨基酸序列。
[0038]如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原 始环境即是天然环境）。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的， 但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。 [0039]如本文所用，"分离的重组融合蛋白"是指重组融合蛋白基本上不含天然与其相关 的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化重 组融合蛋白。基本上纯的蛋白在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
[0040] 本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人 工合成的DNAANA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
[0041] 本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋 白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然 发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所 知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或 插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。
[0042] 如本文所用，术语"引物"指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起 点进行合成与模板互补的DNA链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以 是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物"大致上" (或"基本上"）与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分 互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互 补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有 足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合 物，从而进行扩增。
[0043]根据本发明提供的氨基酸序列，本技术领域人员可方便地用各种已知方法制得本 发明的融合蛋白。这些方法例如但不限于:重组DNA法，人工合成等。
[0044] 本发明融合蛋白的元件(如IL12或无信号肽CD107a)的核苷酸全长序列或其片段 通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有 关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人 员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要 进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0045] -旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
[0046] 此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0047]应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物 可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法 如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
[0048]本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编 码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。
[0049] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组 蛋白。一般来说有以下步骤：
[0050] (1).用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体），或用含有该多核苷酸的 重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0051] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0052] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0053]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的 转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组 技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达 载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0054]此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
[0055] 包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适 当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
[0056] 宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞;或是低等真核细胞，如酵母细胞;或是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有:大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞;真菌细胞如 酵母;植物细胞;果蝇S2或Sf9的昆虫细胞;CH0、C0S、或293细胞的动物细胞等。
[0057] -种特别优选的细胞为人和非人哺乳动物的细胞，尤其是免疫细胞，包括T细胞、 NK细胞。
[0058]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原 核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaC12法处理，所 用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl 2。如果需要，转化也可用电穿孔的方 法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如 显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
[0059] 获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用 的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下 进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法（如温度转换或化学诱导） 诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
[0060] 在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果 需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是 本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀 剂处理(盐析方法）、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤）、吸附层析、离 子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
[0061] 经修饰的免疫细胞:本发明还提供一种表达本发明所述融合蛋白的免疫细胞(简 称为"本发明免疫细胞"），所述免疫细胞在细胞表面携带所述的融合蛋白。
[0062] 在本发明中，至少一部分或全部所述的融