,用来检测基因修饰的TCR表达水平。具体流程如下，首先细胞经过 FACS染色液(PBS containing 2 %FBS)洗涤两次，然后加入0 · 2ml (106/ml)于流式细胞管 中，于4°C孵育30分钟，然后洗涤两次。死细胞通过样本上机前加入20μ1 PI(15μg/ml propidium iodide) (Sigma-Aldrich, Saint Louis，M0)以及细胞亚群的划分来实现分离的 目的。流式数据通过FlowJoS. 1.1进行上机后处理分析。
[0092] 荷瘤鼠模型的建立，本实验所涉及的方法如下：选择雌性pmel小鼠（6-8周，每组7 只小鼠）进行颅内肿瘤接种（ICKB16F10-MART-1肿瘤细胞通过含有0.02%EDTA的0.25%胰 酶消化，并用含有血清的培养液洗涤一次来终止胰酶的反应，然后用PBS洗涤两次。肿瘤细 胞最终以1:1的体积与methylcellulose in zinc option medium混合，5000个细胞稀释在 5μ1 液体中上样到 250-μ 1 syringe (Ham i lton, Reno, NV)，选用 25-gauge 针头。应用 Quitessential Stereotaxic Injector System(Stoelting Co.Wood Dale，IL)注身才到小 鼠的右侧脑caudate核中。接种肿瘤细胞5天后，小鼠接受全身5Gy的射线照射。第2天，小鼠 皮下接受0.5-1X 106DC疫苗，或者通过尾静脉IV回输IX 107经过序贯转导anti-MART-1TCR、IL-12/野生型CD107a或IL-12/无信号肽CD107a慢病毒基因修饰的T细胞。鼠的T细胞 取自小鼠的脾脏细胞，利用1 〇ug/ml的刀豆蛋白（Con A)在IL-2 (51U/m 1)存在的条件下活 化;第2天，用慢病毒载体转导T细胞，然后继续培养6天，收集细胞，通过小鼠尾静脉注射T细 胞。DC组小鼠的DC细胞取自小鼠的骨髓细胞，经过体外诱导分化成熟8天，通过腹腔接种。然 后每天记录小鼠的死亡情况，记录生长曲线并通过Prism绘图软件制图。星号表示该实验组 与其它组比较，P〈〇. 001。
[0093] 实施例1融合基因的构建
[0094]融合基因由Invitrogen公司合成，融合基因的长度及序列通过1%的琼脂糖电泳 及测序证实。
[0095] 构建获得的IL-12/CD107a融合基因系列的结构如SEQ ID N0. :1、3所示，所编码的 融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2,4所示。
[0096]实施例2慢病毒表达载体的构建
[0097]采用通用方法中"慢病毒载体的构建及T细胞的基因修饰"所述的方法:体外低代 DMEM(含10%的FBS)培养基培养的人源化293T细胞经计数后，传到15CM的培养皿中，培养皿 的底部经过poly-D-Lysine处理，每个培养皿中铺20X 106细胞，第二天，每个转染培养皿中 加入由DNA混合液和Lipofectamine的混合液:混合液的组成如下，取2ml Optimum I并加入 pLenti_MSCV(22 · 5ug)，pMD2 · G(7 · 5ug)，gag/pol (15ug)，pRev( 10ug)，混勾；同时取2ml Optimum I并加入Lipofectamine 160ul(Invitrogen)，混勾。把两种混悬液混合，放置室温 孵育5分钟，然后均匀地滴加到培养皿中。48-72小时后，收获含有基因工程载体的上清， 2000g离心去除细胞碎片，收集上清，并用0.45uM的滤膜过滤去除可能的污染，分装并存放 于负80冰箱。根据不同的需要，收集的病毒上清可以进行50000g超速离心，得到更高浓度的 病毒载体。
[0098] 获得的慢病毒表达载体分别命名为LV-hscIL-12/CD107a、LV-hSCIL-12/无信号肽 CD107a、LV-hscIL-12〇
[0099]实施例3表达IL-12/无信号肽⑶107a融合蛋白的T细胞的制备 [0100] 方法如下:CD3/⑶28磁珠或抗-⑶3抗体激活PBMC，第2天，利用慢病毒基因修饰T细 胞，简要的方法如下:PBS缓冲液洗涤T细胞3次，按病毒滴度与T细胞的比例3:1加入适量的 慢病毒，2000Xg离心2h，6h后，加入100IU/ml IL-2继续培养;于第5天进行第2次转导，或联 合共转导。根据细胞生长情况进行分瓶，二周后，根据T细胞所修饰的基因通过流式细胞仪 进行检查。
[0101]实施例4IL-12/CD107a系列慢病毒基因修饰的人抗肿瘤T细胞实现IL-12瞬时膜表 达
[0102] 在本实施例中，构建了持续性分泌LVV-hscIL-12、hscIL-12/CD107和hscIL-12/无 分泌肽IL-12的慢病毒载体(结构如图2.所示），其中IL-12基因与⑶107a基因通过氨基酸肽 段SGSG链接，所述慢病毒为第三代慢病毒载体，启动子为MSCV。该载体的5 '及3 ' LTR( long terminal repeat)被改造成SIN-LTR(self-inactivating-LTR)，以降低慢病毒重组的机 率，增强安全性能。
[0103] 为了明确IL_12/CD107a融合蛋白系列在抗肿瘤T细胞的表达情况，依次对T细胞转 导了抗肿瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋白系列，抗肿瘤T细胞体外培养14天后与肿瘤细胞 526、938共培养。
[0104] 结果观察到了 IL-12/⑶107a系列的肿瘤抗原反应性的瞬时膜表达的表型，同时也 进一步证实了IL-12/⑶107a可以通过⑶107a的抗原反应性的膜迀移从而实现IL-12膜表达 的理论推测。其中无信号肽⑶107a显示出高表达水平，可能与IL-12/⑶107a在胞浆内的加 工过程而导致的部分分泌片切割有关。
[0105]实施例5慢病毒载体IL-12/CD107a系列转导的T细胞与肿瘤共培养可以增强IFNy 的表达
[0106] 在本发明中，为了降低IL-12释放诱导产生的系统性细胞毒性，构建了瞬时膜表达 的IL-12/CD107a融合蛋白载体系列。
[0107] 如图3所示，对人的（物种）的T细胞依次转导抗肿瘤TCR及IL-12/CD107a系列融合 蛋白14天后，与肿瘤细胞526及938共培养，24小时后，上清中IFN γ及IL-12表达水平通过 ELISA试剂盒检测。
[0108] 结果显示，持续性IL-12分泌组、IL-12/CD107a系列组较TCR基因修饰T细胞组比 较，可以显著增强抗肿瘤T细胞与肿瘤的反应性，表现为显著增强IFNy分泌的水平，P〈 0.001。
[0109] 同图2中IL-12/CD107a膜表面可以检测到一致，IL-12/CD107a不能从细胞膜上切 害J，因此混合培养的细胞上清中不能检到IL-12的分泌。IL-12的表达只能在持续分泌IL-12 的组中检测到。其它组同持续性分泌IL-12组比较，可以检测到分泌的IL-12的水平显著升 高，Ρ〈0·001。
[0110] 因此，这证实了 IL-12/⑶107a系列可以诱导瞬时的IL-12膜表达，并且表达仅限于 T细胞膜表面，不能分泌到培养的上清中，最大程度地降低了IL-12的分泌而导致的系统性 细胞毒性。
[0111] 实施例6慢病毒载体IL-12/无信号肽CD107a转导的T细胞可以有效避免持续性分 泌IL-12造成的体外T细胞扩增的毒副作用
[0112] 在解决了肿瘤抗原反应性的IL-12膜瞬时表达的技术上和理论上的可行性及增强 抗肿瘤反应性的问题后，本实施例进一步观察转导该IL-12/CD107a融合蛋白系列对T细胞 体外扩增的影响。
[0113] 如图4所示，对T细胞依次转导抗肿瘤TCR及IL-12/CD107a融合蛋白系列14天后，各 组细胞与对照转导组(T-cell)的扩增倍数比较，数据分析采用设定T-cell组的扩增倍数为 100%，其它各组的值系与T-cell组的比值。
[0114]结果表明，转导持续分泌IL-12组较其它各组的扩增倍数显著降低，p〈0.001。其 中，转导hscIL-12/无信号肽融合蛋白组同TCR组比较扩增倍数相同，未见显著差异。但是， 转导hscIL-12/无信号肽⑶107a融合蛋白组的扩增倍数显著高于转导了 hscIL-12/CD107a 融合蛋白组。推测可能的原因是由于CD107a的信号肽在IL-12/CD107a融合蛋白在胞浆内加 工过程中导致的分泌肽部分切割，从而导致IL-12从融合蛋白上的断裂，进而分泌而导致的 系统性细胞毒性。
[0115]实施例7慢病毒载体hscIL-12/CD107a系列转导鼠 T细胞介导的细胞回输治疗显著 延长荷瘤小鼠的生存
[0116] 在清楚了 IL_12/CD107a的肿瘤抗原反应性膜瞬时表达、肿瘤抗原反应的增效性及 体外扩增的基础上，在本实施例中，进一步采用了临床前荷瘤小鼠模型，观测体内抑瘤效 应。方法如下：
[0117] 选择雌性pmel小鼠（每组7只小鼠）通过B16F10细胞植入颅内（5000细胞/只）（IC)5 天，细胞回输前1天小鼠接受5Gy全身放疗。pme 1小鼠是转基因小鼠，其T细胞通过转基因修 饰稳定表达抗肿瘤TCR，可以识别B16F10细胞上的肿瘤抗原gplOO。（Overwi jk，Tsung et al.1998)鼠的T细胞取自小鼠的脾脏细胞，通过lOug/ml的刀豆蛋白（Con A)在IL-2(5IU/ ml)存在的条件下活化;第2天，用慢病毒载体转导T细胞，然后继续培养6天，收集细胞，通过 小鼠尾静脉注射（IV) 5X 106个T细胞。DC组小鼠的DC细胞取自骨髓细胞，经过体外诱导分化 成熟8天，通过腹腔接种IX 106细胞。如图5所示，DC和T细胞的各组说明见右边标识。星号 (*)表示转导IL-12该实验组与其它组比较，p〈0.001;星号（**)表示转导IL-12/无信号肽 ⑶107a组的生存期显著优于IL-12/⑶107a组。其中持续分泌IL-12组表现为显著的系统性 细胞毒性，小鼠于细胞回输后4-7天全部死亡。
[0118] 讨论
[0119] CD107a是一种表达于溶酶体上的跨膜蛋白，它的N-端位于溶酶体腔囊一侧， (Eskelinen 2006)C-端是一小段肽段，朝向胞楽;一侧，当抗肿瘤T细胞在识别肿瘤抗原时， 溶酶体与T细胞膜融合而发生T细胞或NK细胞的脱颗粒效应，即T细胞或NK细胞释放效应分 子颗粒酶(Granzyme B)及穿孔素