中，于微量振荡器室温振荡40min， 然后室温静置lh ;
[0127] (6)噬菌体洗脱、中和
[0128] 无菌的1XPBST洗涤10次，后PBS洗涤10次，尽量甩干孔内的残留液体，然后加 入10mM的HC1洗脱液200 μ 1/孔，于微量振荡器室温振荡洗脱30min ;将洗脱液小心吸出 (吸出的时候可以用移液枪小心吹打，以增加洗脱量），加入到新的无菌的50ml离心管中， 然后加入200 μ 1的0. 1M Tris-HCl混匀中和；
[0129] (7)噬菌体抗体库侵染宿主菌
[0130] 将洗脱中和后的噬菌体加入到5ml 0D600 = 4. 0-6. 0的新鲜的TG1菌液中，37°C 静置40min ;
[0131] (8)洗脱计数
[0132] 取适量侵染液用2XTY培养基稀释，以10倍梯度稀释（10 ^10 12)，取10μ 1的 各稀释度的细胞液于LB-氨苄平板上涂布，37°C孵箱内孵育过夜，寻找平板上菌落数量在 100~200之间的平板计算洗脱下来的噬菌体的数目；剩余的洗脱中和液加入5ml新鲜的 2XTY培养基，37°C再摇荡培养30min ;
[0133] (9)辅助噬菌体M13K07侵染
[0134] 加5μ 1的M13K07噬菌体（约1012个）于上侵染液中，37°C静置侵染lh，然后 于4800rpm室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的2XTY培养基中，加 Amp至 100 μ g/ml，Kan 至 50 μ g/ml，葡萄糖加至 0· 1 %，然后于 30°C，200rpm 振荡培养 16_20h ;
[0135] (10)噬菌体的纯化
[0136] 过夜菌转移至50ml无菌离心管中，4800rpm，4°C离心20min，弃沉淀，上清液转移 到新的50ml离心管中，加入1/5体积比的40% PEG 4000&2. 5M NaCl溶液，强烈振荡后冰浴 20min ;然后再于4800rpm，4°C离心20min，弃上清，用无菌的1 X PBS缓冲液将沉淀重悬后用 0. 22 μ Μ滤膜过滤除菌，并测其滴度，即为筛选第一轮的抗体库。
[0137] 第二、三、四、五、六、七轮的富集步骤同第一轮。采用两种抗原即Cd-DTPA-BSA和 Cd-DTPA-OVA交替进行抗体库的筛选，即第二轮筛选时包被的是抗原Cd-DTPA-OVA，后面的 几轮依次交替。
[0138] 2、Cd-纳米抗体库富集度及其特异性检测
[0139] 对多克隆抗体库进行初步验证，以确定库中是否存在特异性针对重金属的抗体。 因为重金属离子本身的分子量太小，针对其的抗体也较少。因此先测定Cd-DTPA抗体库第 一至七轮抗体库富集度。并且，即使通过抗原交替的方式筛选得到的抗体库中也会存在有 很多非特异的抗体，如针对载体蛋白BSA/0VA的，针对无金属偶联物DTPA-BSA/DTPA-OVA或 是针对螯合剂DTPA的抗体，所以需对其先进行特异性检测。Cd-DTPA VHH库富集度及特异 性的ELISA检测步骤如下：
[0140] ⑴抗原包被：浓度均为2. 5 μ g/ml，抗原包括Cd-DTPA-BSA和Cd-DTPA-〇VA，阴性 对照组包括BSA和0VA包被组及单纯的包被液组，100 μ 1/孔，4°C包被12h ;
[0141] (2) IX PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5 %的脱脂奶粉封闭，200 μ 1/孔， 37°C封闭 1. 5h ;
[0142] (3) IX PBST洗涤5遍，扣干孔内液体，每孔中分别加入不同轮次的VHH噬菌体1011 个，用5%的脱脂奶粉稀释，100μ 1/孔，37°C静置lh ;
[0143] (4) 1XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复一次上面的 洗涤过程，扣干孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释， 100μ 1/孔，37°C，lh ;
[0144] (5) 1 X PBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复一次上面的洗 涤过程，扣干孔内液体，加入显色底物液A+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时 间根据阴性对照组定；
[0145] (6)终止，2M 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0146] (7)酶标仪读取0D450值，并分析结果。
[0147] 通过对比完全抗原Cd-DTPA-BSA/OVA和载体蛋白BSA/0VA组（图5和图6)。由图 5可见，每一轮筛选都能有效提高抗体富集程度。由图5和图6可见，交替筛选抗体库后，不 仅具有很好的Cd-DTPA富集度而且也有很好的特异性，这为之后的单克隆抗体挑选打下很 好的基础。
[0148] 实施例3、单克隆抗体阳性克隆筛选
[0149] 1、单克隆初步筛选--阳性筛选
[0150] 通过间接性ELISA验证：酶标板分别包被Cd-DTPA-BSA和DTPA-BSA，挑选仅对 Cd-DTPA-BSA呈阳性而对DTPA-BSA呈阴性的克隆，视为阳性克隆，然后对它们进行下一步 的验证。
[0151 ] 同步进行两组实验，分别以Cd-DTPA-BSA和DTPA-BSA为抗原进行检测。具体过程 如下：
[0152] (1)抗原包被：完全抗原Cd-DTPA-BSA和无金属抗原DTPA-BSA包被，浓度均为 2· 5μ g/ml，100y 1/孔，4°C包被 12h ;
[0153] (2) 1XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200 μ 1/孔， 37°C封闭 1. 5h ;
[0154] (3) 1XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将每个单克隆上清分别加入对应的孔内， 100μ 1/孔，37°C静置 lh ;
[0155] (4) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣 干孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5 %的脱脂奶粉以1:3000稀释，100 μ 1/孔， 37〇C,lh ；
[0156] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物液A+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0157] (6)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0158] (7)酶标仪读取0D450值，并进行数据分析。
[0159] 第四轮单克隆ELISA验证结果如图7 ;第六轮单克隆ELISA验证结果如图8。
[0160] 经过阳性克隆初筛，挑选其中阳性较好的克隆，第四轮：2、4、6、7、9、11、14、16、17、 18、19及20号克隆；第五轮：舍弃3、4及11号后的所有克隆；第六轮：1、2、4、5、6、9、11、15、 16、17、18、19及20号克隆；第七轮：2、3、4、5、6和10号克隆，对这些克隆进行进一步的验证 (Cd-DTPA/DTPA)〇
[0161] 2、Cd_阳性克隆特异性初步检测
[0162] 经过初步筛选，对视为阳性的克隆进行初步特异性验证，初步确定其特异性：因为 通过完全抗原包被筛选得到的抗体对螯合剂会有很大的依赖性，也就是说螯合剂本身可能 对抗体就有一定的抑制作用（也可视为假阳性），抗体库中也存在很多的针对螯合剂的抗 体，所以为了排除螯合剂对抗体的影响及螯合剂抗体，首先要对阳性克隆进行初步特异性 排除。包被完全抗原，然后用DTPA为竞争剂进行间接竞争性ELISA，挑选DTPA对其无影响 的克隆进行下一步的验证。
[0163] Cd-单克隆噬菌体VHH-螯合物竞争性ELISA示意图如图9。进行螯合剂DTPA抗 体的排除实验，具体步骤如下：
[0164] (1)抗原包被：完全抗原Cd-DTPA-BSA，浓度为2. 5μ g/ml，100y 1/孔，4°C包被 12h ；
[0165] (2) 1XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，然后加入5%的脱脂奶粉封闭，200 μ 1/孔， 37°C封闭 1. 5h ;
[0166] (3)封闭的同时，准备好竞争剂，共两组：Cd-DTPA和DTPA取配好的原DTPA (10mg/ ml)溶液用0. 1M PH7. 4的HEPES缓冲液稀释至终浓度为ImM，其中一半的DTPA溶液加入 一定量的Cd2+使其终浓度为10ug/L制备成Cd-DTPA，然后分别与初筛为阳性的克隆上清以 1:1的比例混合，充分混匀后，37°C反应45min ;
[0167] (4) 1 XPBST洗涤5遍，扣干孔内液体，将上混合液分别加入对应的孔内，100 μ 1/ 孔，37°C静置lh ;
[0168] (5) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入HRP-Anti-M13K07兔抗，用5%的脱脂奶粉以1:3000稀释，100μ 1/孔，37°C 静置lh ;
[0169] (6) 1 XPBST洗涤3遍，加满洗涤液于微量振荡器上振荡4min，重复洗涤如上，扣干 孔内液体，加入显色底物A液+B液（两者体积比1:1)显色，100 μ 1/孔，显色时间根据阴性 对照组定；
[0170] (7)终止，2Μ 的 H2S04, 50 μ 1/ 孔；
[0171] (8)酶标仪读取吸光值，并进行数据分析。
[0172] 第四轮阳性单克隆特异性初检测结果如图10 ;第六轮阳性单克隆特异性初检测 结果如图11。
[0173] 第四至七轮阳性单克隆抗体特异性初步检测结果，可以看出，只有很少的单克隆 抗体显示出很小的竞争性作用。分析原因：可能是抗体的亲和力不够，达不到10 μ g/L的检 测限；也可能是实验组重金属离子Cd2+与螯合剂的螯合不成功；另外，当然仍需进一步的优 化实验。
[0174] 由上结果可以看出，随着富集轮次的增加，抗体库中针对螯合剂DTPA的抗体比 例逐渐增多，而且阳性克隆率也逐渐的降低。所以，并不是筛选的轮次越高越好，虽然在 筛选过程中轮次越高抗体的亲和力可能越高，但却不一定是适合所有实验的。正如本发 明人针对小分子抗体的筛选实验，就必须要保证抗体库一定的多样性，因为本身完全抗原 和单独的金属离子或金属螯合物是由区别的。尽管如此，本发明人可以看出，第四轮的 18(VHH4-18)、19号（VHH4-19)克隆及第六轮的15号（VHH6-15)克隆显示出了较为理想的 竞争作用的，所以挑选这几个克隆重新扩增纯化再进行进一步的验证实验。
[0175] 3、Cd-单克隆抗体（VHH)-螯合物竞争ELISA
[0176] 通过对单克隆VHH 4-18,4-19及6-15的扩增、纯化，获得对应的噬菌体抗体即纳 米抗体，分别与螯合物进行竞争性ELISA (VHH孵育浓度均为5 X 10、也/孔，100 μ 1/孔）， 观察这几个抗体的特异性及亲和力。以上所得的阳性克隆4-18,4-19及6-15,取其所对应 的原菌液以1:100的比例重新接种扩增、纯化，后用于进一步的特异性验证。
[0177] (1)阳性克隆原菌液重新1:100接种于10ml新鲜的于2 X ΤΥ培养基+Amp (100 μ g/ ml)，37°C摇至 0D600 = 0· 4-0. 6 ;
[0178] (2)辅助噬菌体M13K07侵染：菌液中加入5 μ 1的M13K07噬菌体（约1012个）， 37°C静置侵染lh ;
[0179] (3)侵染液于4800rpm，室温离心10min，弃上清，沉淀重悬于50ml新鲜的 2ΧΤΥ+Απιρ(100μ g/ml)+Kan(50y g/ml)+IPTG(lmM)，3(TC，200rpm 振荡培养 16-20h ;
[0180] (4)噬菌体抗体的纯化：将过夜菌转移到50ml无菌离心管中，4800rpm，4°C离心 20min，将上清转移到新的50ml离心管中，加入体积比为1/5的40% PEG4000&2. 5M NaCl溶 液，强烈振荡后冰浴20min ;然后再于4800rpm，4°C离心20min，弃上清，沉淀重悬于适量无 菌的IX PBS缓冲液中，然后用0. 22 μ Μ的滤膜过滤除菌，并进行滴度测定。
[0181] 对纯化后的抗体进行其与螯合物的竞争ELISA包括步骤：
[0182] (1)抗原包被：抗原Cd-DTPA-BSA用包被液稀释