专利名称：垂体腺苷酸环化酶激活肽(pacap)受体(vpac2)激动剂及其药物使用方法
垂体腺普酸环化酶激活肽(PACAP) 受体(VPAC2)激动剂及其药物使用方法本申请要求享受于2002年7月12曰申请的美国临时申请 No.60/395，738的优先权，其内容被全部引入作为参考。发明领域本发明涉及新鉴定的多肽以及此多肽用于治疗目的的用途。更具 体地，本发明的多肽可以以依赖于葡萄糖的方式刺激胰腺P -细胞释放 胰烏素，从而为受代谢失调诸如糖尿病或削弱的葡萄糖耐量-一种前糖 尿病状态的病症困扰的个体提供一种治疗的选择方案。发明背景糖尿病的特征是具有削弱的葡萄糖代谢作用，其在高糖尿病患者 中显示为血糖水平升高.依据下述的缺陷将糖尿病分为两个主要的 组I型糖尿病，或胰烏素依赖型糖尿病(1DDM)，当患者的胰腺缺 少生产胰烏素的P-细胞时产生，以及H型糖尿病，或非胰岛素依赖型 糖尿病(NIDDM)，其患者具有削弱的P-细胞功能和改变的胰岛素作 用。目前l型糖尿病患者用胰烏素来进行治疗，而大多数的II型糖尿 病患者用刺激P-细胞功能的药物或增强病人对胰岛素的组织敏感性的 药物进行治疗。几乎一半的II型糖尿病患者受试者随着时间丧失了对 这些药物的应答，然后必须寄予胰乌素疗法。目前用于治疗II型糖尿 病的药物描述在下文中.a-葡糖苷酶抑制剂(例如Precose⑧、VogliboseTM和Miglitol )其 通过延迟内脏对葡萄糖的吸收而降低餐后葡萄糖的移动，这些药物是 安全的并且为轻度糖尿病患者提供了治疗，然而，文献中已经报道了 对胃肠道的副作用。胰岛素敏化刑是增强身体对胰乌素应答的药物.噻唑烷二稱类化 合物诸如AvandiaTM ( rosiglitazone)和ActosTM激活过氧化物酶体增 殖剂-激活的受体(PPAR) Y亚型并调节尚没有被较好描述的一组基因的活性。RezulinTM (troglitazone)是此类型中的第一个药物，其因 为增加了肝脏的酶水平和药物诱导的肝脏毒性而被人们所摒弃了。对 肝的这些影响在使用AvandiaTM和ActosTM的患者中没有成为显著的 问题，即使如此，建议在治疗的第一年每两个月进行一次肝脏酶测定 且此后定期地进行.AvandiaTM和ActosTM好像与水肿和浮肺相关联。 AvandiaTM不与胰烏素一起使用，因为这样会导致充血性心力衰竭。另 一种可能的副作用是体重增加.胰乌素促泌剂(例如，磺酰脲类(SFlIs)及其它通过ATP-依赖型 K+通道起作用的药物)是目前另一种类型用于治疗II型糖尿病的药 物.SFUs是用于具有轻中度禁食糖血症的II型糖尿病患者的标准疗 法.SFUs具有包括可能诱导低血糖、体重增加和高的初级和次级失敗 在内的局限性。10 ~ 20°/。的最初被治疗的患者未能显示显著的治疗效 果(初级失敗)。次级失敗表现为另外的20-30%的患者在使用6个月 后对SFU丧失了治疗效果，在治疗5-7年后具有50。/。SFU应答者的胰 乌素疗法是人们所需要的(Scheen等，Diabetes Res. Clin. Pract. 6:533國543，1989 )。GlucophageTM ( metformin HC1)是一种通过减少肝葡萄糖排出量 并增加外围葡萄糖吸收和利用来降低血糖的双缩胍，该药物对于降低轻度和中度受影响的受试者的血糖是有效的并且不具有体重增加或可 能诱导低血糖的副作用。然而，GlucophageTM具有大量的副作用包括 胃肠道紊乱和乳酸酸中毒。GlucophageTM被禁忌用于年龄超过70岁的 糖尿病患者并且损伤受试者的肾的或肝的功能.最后，GhicophageTM 具有与SFUs相同的初级和次级失败率'胰岛素冶疗在餐后和锻炼后进行，并且内服不能充分地控制血 糖。这些治疗具有如下的缺点，即其是可注射的，其可能产生低血糖， 并且其导致体重增加.由于目前治疗方法具有的问题，需要新的治疗II型糖尿病的治疗 方法。尤其是，维持正常(依赖于葡萄糖的)胰岛素分泌的治疗方法 是需要的，这些新药应该具有以下特性依赖于葡萄糖来促进胰岛素 的分泌(即，仅仅在增加血糖的情况下产生胰岛素分泌)；低的初级 和次级失敗率；以及保持小岛细胞功能.此处公开的开发新治疗方法 的策略基于环腺苷一磷酸(eAMP )信号机制以及其对胰岛素分泌的影响。环化AMP是胰烏素分泌过程的主要调节因子.此信号分子的增加 促进了激活蛋白激酶A途径后k+通道的闭合，K+通道的闭合导致细胞 去极化以及随后的Ca—通道的打开，其反过来导致胰岛素颗粒的胞吐 作用。其在缺少低葡萄糖浓度的情况下对胰岛素分泌的发生基本上没 有任何影响(Weinhaus等,Diabetes 47:1426-1435,1998),促泌剂类 垂体腺苷酸环化酶激活肽("PACAP")以及GLP-1 (胰高血糖素样 肽1)以依赖于葡萄糖的方式利用cAMP系统来调节胰乌素的分泌(Komatsu等，Diabetes 46:1928國1938，1997; Filipsson等，Diabetes 50:1959-1969,2001; Drucker， Endocrinology 142:521-527,2001 )。通 过增加cAMP进行作用的胰鸟素促泌剂诸如GLP-1和PACAP除了增 强胰岛素释放外也能够增强胰岛素的合成(Skoglund等，Diabetes 49:1156-1164,2000; Borboni等，Endocrinology 140:5530-5537,1999 )。 PACAP是一种由胰腺P-细胞进行葡萄糖-依赖性胰岛素分泌的有 效刺激物，三种不同的PACAP受体类型(PAC1， VPAC1和VPAC2) 已被描述(Harmar等，Pharmacol. Reviews 50:265-270,1998; Vaudry 等，Pharmacol. Reviews 52:269-324,2000) ft PACAP没有受体选择性， 三种受体具有类似的活性和效力。PAC1主要在CNS中，而VPAC1 和VPAC2则更广泛地分布.VPAC1位于CNS以及肝脏、肺脏和肠中。 VPAC2位于CNS、胰腺、骨骼肌、心脏、肾脏、脂肪组织、睾丸以及 胃中.最近的研究表明VPAC2负责由P-细胞分泌胰烏素(Inagaki等， Proc， Natl. Acad. Sci. USA 91:2679-2683,1994; Tsutsumi等，Diabetes 51:1453-1460,2002) 。 PACAP的促胰烏素作用是受CTP结合蛋白Gs 调节的.胞内cAMP的累积随后激活了增加
的P-细胞中的非选 择性阳离子通道，以及促进了含有胰乌素的分泌颗粒的胞吐作用.PACAP是那些通过cAMP-介导的信号转导途径发挥作用的新陈 代谢、神经内分泌以及神经介质肽类激素的超家族的新成员(Arimura， Regul. Peptides 37:287-303,1992 )。生物学活性肽由生物 合成前体释放为两种分子形式，具有酰胺化的羧基末端的38-氨基酸肽(PACAP-38 )和/或27-氨基酸肽(PACAP-27) ( Arimura,如上文所 述).两种形式肽的最高浓度被发现存在于脑和睾丸中(Arimura，如上文所述)。肽的较短形式PACAP-27显示出与肠血管活性肽(VIP)具 有68%的结构同源性'然而，PACAP和VIP在中枢神经系统中的分布 表明这些结构相关的肽具有不同的神经递质功能(Koves等， Neuroendocrinology 54:159-169,1991 ).最近的研究证明了 PACAP-38的各种生物学功能，从在繁殖中的 作用(McArdle， Endocrinology 135:815-817,1994 )到刺激胰烏素分泌 的能力(Yada等，J. Biol. Chem. 269:1290-1293,1994)。此外，PACAP 似乎在脂类和碳水化合物代谢的激素调节(Gray等，Mol. Endrocrinol. 15:1739-47,2001 );生理节奏功能(Harmar等，Cell 109:497-508,2002 ); 和免疫系统、生长、能量稳态以及男性生殖功能(Asnicar等， Endrocrinol. 143:3994-4006,2002 );食欲的调节(Tachibana等，Neurosci. Lett. 339:203-206,2003 );以及急性的和慢性炎症性疾病、脓毒性休克 和自身免疫疾病(例如，系统性红斑狼掩)(Pozo， Trends Mol. Med. 9:211-217,2003)中起作用'血管活性肠肽(VIP)是具有28个氨基酸的肽，其首先分离自猪 的上部小肠(Said和Mutt, Science 169:1217-1218,1970;美国专利No, 3,879,371 )。此肽属于包括毒晰皮肽、分泌素、抑生长素和胰高血糖 素的结构相关的小的多肽家族。通过与胞内cAMP信号系统偶联的膜 结合受体蛋白的激活调节VIP的生物学功能。这些受体最初被称为 VIP-R1和VIP-R2，然而，随后发现它们是与VPAC1和VPAC2相同 的受体.VIP显示出与VPAC1和VPAC2类似的活性和效力。为了改善人肺液中VIP的稳定性，Bolin等(Biopolymers 37:57-66，1995)制备了一系列VIP变体来增强这些肽的螺旋倾向和降低蛋白 水解的降解，取代集中在位置8、 12、 17和25-28处，这些已被证明对 于受体结合是不重要的，此外，"GGT"序列被标记到VIP突变蛋白 的C-末端上，期望其更有效地覆盖螺旋。最后，为了进一步稳定螺旋， 合成了一些环状的变体(专利US5，677，419)。尽管这些努力没有指向 受体的选择性，但是它们产生了两个具有大于100倍的VPAC2选择性 的类似物(Gourlet等，Peptides 18:403-408,1997; Xia等，J. Pharmacol. Exp.Ther.， 281:629-633,1997).GLP-1是由肠L-细胞在进餐后释放的并且具有与肠胰乌素激素相 同的功能(即其增强从胰腺P-细胞释放葡萄糖-诱导的胰岛素)。它是一种37-氨基酸肽，其通过依赖于组织类型的胰高血糖素基因而差异表 达。关于GLP-1的支持增加P-细胞中cAMP水平的有益作用的临床资 料已被收集，向缺乏调控的II型糖尿病患者注入GLP-l来使他们的空 腹血糖水平正常化(Gutniak等，New Eng. J. Med. 326:1316-1322,1992 )并且通过持续的注入来改善0 -细胞功能而达到正常受试者 的水平(Harmar等，Diabetes 45:1524-1530,1996).最近的报告表明 GLP-1提高了具有削弱的葡萄糖耐量的受试者中p-细胞对葡萄糖应答 的能力(Byrne等.,Diabetes 47:1259-1265,1998)'然而所有的这些作 用由于肽的短的半衰期而是短暂的.糊精药物被用Exendin 4TM ( AC2993 )进行III期试验，其中的 Exendin 4TM ( AC2993 )是一种最初在毒晰中鉴定的39个氨基酸的肽. 临床研究报道证明糊精提高了用Exendin 4"^治疗的II型糖尿病患者 中的改善的糖血控制.然而，恶心和呕吐的发生是显著的。申请人在WO 01/23420中公开了在体内具有VPAC2受体激动剂作 用的新的多肽，WO 01/23420的说明书在此处被整体引入，并且尤其 是，申请人公开了一种确定为R3P66的VPAC2激动剂。然而其中描 述的多肽，包括R3P66,并非合适的商用候选物，因为其引发的与制 剂中的多肽有关的稳定性问题以及与多肽的短半衰期有关的问题。人们需要一种具有PACAP、GLP-1或Exendin 4TM的依赖于葡萄 糖的胰烏素促分泌活性，但具有较少的副作用，并且优选地在制剂中 是稳定的并具有长的血浆半衰期的改进的肽。此外，严格控制血浆的 葡萄糖水平可防止长期糖尿病患者的并发症。因此，新的糖尿病药物 应该为患者提供改进的生活质量。发明概迷本发明提供了新的多肽，其在体内具有VPAC2受体(下文称 VPAC2 )激动剂的作用并且在可通过具有VPAC2激动剂活性的药物来 改善疾病和病症的治疗中是有效的，优选地，本发明的多肽是选择性 的VPAC2激动剂，具有比VPAC1和PAC1更大的VPAC2效力。例 如，然而并非作为对其的限制，这些多肽刺激胰岛素合成和胰腺P-细 胞以葡萄糖依赖性的方式进行的释放以及随后的血浆葡萄糖减少，这 些促分泌的多肽被显示降低体内血糖超过当葡萄糖攻击时的栽体对照。更优选地，本发明的多肽在制剂中是稳定的，并且具有长的血浆 半衰期以及当释放时在体内持续长时间的作用.本发明的多肽对于具有例如代谢失调，诸如那些因降低的内源胰 岛素分泌而产生的，尤其是II型糖尿病的患者，或对于具有削弱的葡 萄糖耐量-具有轻度胰島素分泌改变的前糖尿病状态的患者，提供了一 种新的治疗方案.此外，本发明的多肽可用于预防和/或治疗I型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成熟期发病型糖尿病(MODY)、成人隐 匿性自身免疫糖尿病(LADA)以及相关联的糖尿病血脂紊乱及其它糖 尿病并发症，以及高血糖、血胰乌素增多、削弱的葡菊糖耐量、削弱 的空腹血糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症、综合症X和胰乌素抗性.本发明的多肽也可被用于预防和/或治疗肥胖症(例如，食欲和食 物摄入的调节)、动脉粥样硬化疾病、高脂质血、高胆固醇血症、低 HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病、冠状 动脉病和高血压)、脑血管疾病和外围血管疾病；以及用于预防和/或 治疗狼疮、多囊印巢综合症、致癌作用和细胞增生、哮喘、男性生殖 问题、溃疡、睡眠障碍、脂类和碳水化合物代谢的紊乱、生理节奏的 机能障碍、生长障碍、能量稳态平衡的紊乱、免疫疾病包括自身免疫 疾病(例如，系统性红斑狼疮)，以及急性和慢性炎症性疾病、脓毒 性休克及其它此处确定的病症，或其它在下面描述的功能。具体地，本发明的一个方面为多肽，其选自SEQIDNOs:l至152， 以及其显示至少一种生物学功能与列举的SEQ ID NOs基本上相同的 片段、衍生物和变体(总称，"本发明的多肽")，包括其功能等价 物。本发明的一个优选的实施方案为一种多肽，其选自SEQIDNOs:l 至38和SEQ ID NOs:115至152，以及其显示出至少一种生物学功能与 列举的SEQIDNOs基本上相同的片段、衍生物和变体。本发明的一个 更优选的实施方案为选自SEQ ID NOs:l至5和SEQ ID NOs:115至 119，以及其显示出至少一种生物学功能与列举的SEQIDNOs基本上 相同的片段、衍生物和变体的多肽.本发明的一个更为优选的实施方 案为选自SEQIDNOs:l、 2、 115和116以及显示出至少一种生物学功 能与列举的SEQ ID NOs基本上相同的片段、衍生物和变体的组的多 肽。本发明的另一个实施方案为一种编码本发明的多肽、重组表达本发明多肽所必需的栽体和宿主细胞.这些多核苷酸序列包括SEQ ID NOs: 154-264。本发明也提供了那些选择性地结合本发明多肽的抗体和抗体片 段.这些抗体在本发明多肽的检测中是有用的，并且可通过本领域公 知的方法来鉴定和制备。 一种多克隆的N-末端IgG抗体和一种单克隆 的C-末端Fab抗体已被制备，其识别本发明的多肽。本发明的另一个目的是提供治疗哺乳动物中的糖尿病、与糖尿病-相关的紊乱疾病和/或其它受本发明的多肽影响，优选地受本发明多肽 的VPAC2激动剂功能作用的疾病或病症的方法，包括将治疗有效量的 任意的本发明的多肽或在VPAC2诸如SEQ ID NOs:l至152处具有活 性的任意多肽给药所述哺乳动物。本发明也公开了制备本发明的多肽，包括重组的和合成的多肽的 方法。附图的简要说明图la-Id描述了 SEQIDNOs:l至152的多肽的氨基酸序列。SEQ ID NOs:115-152为通过顺丁烯二酰亚胺键在C-末端半胱氨酸处加入了 聚乙二醇的肽.PEG可以是22 kD的线性PEG或43 kD的分支PEG,图2描述了克隆到pGEX-6P-l中产生SEQ IDNO:l氨基酸序列的 DNA序列(SEQ ID NO:153).加下划线的限制性酶位点BamHI和 Xhol允许框内克隆到pGEX-6P-l表达栽体中。编码FactorXa识别位 点的12merDNA序列和两个终止密码子被用粗体突出标注。中间的非 突出标注的序列编码SEQIDNO:l (氨基酸序列)，来自VIP的突变密码子用小写核苷酸表述.图3a-3h描述了核酸序列SEQ ID NOs:154至264。这些核酸序列编码本发明的多肽.图4是说明分散的大鼠胰烏细胞在暴露于本发明的聚乙二醇化的 肽之后胰烏素分泌的直方困.图5是显示通过皮下给药途径给药本发明的聚乙二醇化的肽的大 鼠的增强的葡萄糖处理的直方图.图6描述了三种VPAC2类似物(P5、P7和对照R3P66 )在1 mg/mL 含有150mMNaCl和加mM磷酸盐的水溶液中在pH8.0， 4010温育过程中的稳定性倾向。通过毛细管电泳分析来测定样品中肽的纯度.用最初的百分比纯度校正在2-和4-周时间点时的纯度.图7描述了三种VPAC2类似物(P7、P8和对照R3P66 )在2 mg/mL 二甲基亚砜(DMSO)于40TC温育过程中的稳定性倾向。通过毛细管 电泳分析测定样品中肽的纯度.通过最初的百分比纯度校正在2-和4-周时间点时的纯度。图8说明了全长的聚乙二醇化的肽对在N-末端具有单个氨基酸缺 失的类似的聚乙二醇化的肽的选择性识别.发明详述本发明提供了新的多肽，及其与附图la-ID (总称为本发明的多 肽)的多肽显示出具有至少一个基本上相同的生物学功能的片段、衍 生物和变体。本发明的多肽在体内起VPAC2激动剂的作用或在这些疾 病或病症如糖尿病包括I型和II型糖尿病、妊娠期糖尿病、青年人成 熟期发病型成人糖尿病(MODY) ( Herman等，Diabetes 43:40,1994 ); 成人隐匿性自身免疫糖尿病(LADA ) ( Zim迈et等，Diabetes Med.lh299，1994);以及相关联的糖尿病血脂紊乱及其它糖尿病并发 症，以及高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹血 糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症、综合症X和胰岛素抗性的预防和/或 治疗中起作用。此外，本发明的多肽也可用于预防和/或治疗肥胖症(例如食欲和 食物摄入的调节)、动脉粥样硬化疾病、高脂质血、高胆固醇血症、 低HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病、冠 状动脉病和高血压)、脑血管疾病和外围血管疾病；以及用于预防和/ 或治疗狼疮、多囊卵巢综合症、致癌作用和超常增生、哞喘、男性生 殖问题包括人精子活力、溃疡、睡眠障碍及其它此处确定的病症，或 具有其它在下文描述的功能.优选地，本发明的多肽以葡萄糖-依赖性的方式刺激胰腺P -细胞的 胰烏素释放。更优选地，本发明的多肽在含水的和无水的两种制剂中 是稳定的并且具有大于一个小时的血浆半衰期.本发明的多肽为VPAC2激动剂。优选地，它们是选择性的VPAC2 激动剂，相对于VPAC1和/或PAC1对VPAC2具有至少10倍的选择性'更优选地，它们是相对于VPAC1和/或PAC1对VPAC2具有至少 100倍的选择性的选择性VPAC2激动剂。最优选地，它们以葡萄糖-依赖性的方式刺激胰岛素释放到血浆中，而不诱导对例如II型糖尿病 的治疗起相反作用的血浆葡萄糖水平的郁积或增加，另外，本发明多 肽优选地是VPAC2受体的选择性激动剂，由此当选择性地抵抗其它产 生不愉快或危险的副作用如胃肠道水分保留和/或有害的心血管作用诸 如增加心率的受体时，导致例如释放到血浆中的胰岛素的增加.本发明的多肽在含水和无水的制剂中也是稳定的.优选地，本发 明的多肽当溶于水(pH值在7-8之间)或无水的有机溶剂时，于37-40 x:在一周的时间内具有小于10%的降解。更优选地，本发明的多肽当 溶于水(pH值在7-8之间)或无水的有机溶剂时，在37-40"C—周的时 间内具有小于5%的降解.此外，本发明的组合物和制剂可包括本年明 的多肽和大约2%到大约30%的DMSO。在本发明的另一个实施方案 中，组合物和制剂可选择性地包括大约0.2%到大约3% ( w/v)的其它 溶剂诸如丙二醇、二甲基甲跣胺、碳酸亚丙基酯、聚乙二醇和甘油三 酯。最后，优选地，本发明的衍生化多肽在静脉注射后的大鼠中具有至少一个小时的血浆半衰期；更优选的，血浆半衰期为至少两个小时，并且进一步优选地，血浆半衰期为至少3个小时。本发明的多肽为具有降低的内源胰岛素分泌或削弱的葡萄糖耐量，尤其是n型糖尿病的患者提供了一种新的治疗方案.也就是说，本发明的多肽是长效的VPAC2激动剂，可被用于维持、提高和修复葡 萄糖-刺激的胰岛素分泌。此外， 一种VPAC2受体的选择性肽激动剂 能增强胰腺中的葡萄糖-依赖性胰岛素分泌，而不引起与另一 PACAP 受体的非选择性激活有关的副作用。现在定义本说明书中的特定的术语，并且其它的将被定义为如同 所引用的.特定氨基酸的单字母缩写、其相应的氨基酸以及三字母缩 写如下A，丙氨酸(ala); C，半胱氨酸(cys); D，天冬氨酸(asp); E，谷氨酸(glu) ; F，苯丙氨酸(phe) ; G，甘氨酸(gly) ; H，组 氨酸(his ) ; I，异亮氨酸(ile ) ; K，赖氨酸(lys ) ; L，亮氨酸(leu ); M，甲硫氨酸(met) ; N,天冬酰胺(asn) ; P，脯氨酸(pro) ; Q 谷氨酰胺(gin) ; R，精氨酸(arg) ; S，丝氨酸(ser) ; T，苏氨酸(thr ) ; V，纈氨酸(val) ; W，色氨酸(trp ) ; Y，酪氨酸(tyr)。 术语"编码多肽的多核苷酸"包括其仅仅包含多肽的编码序列的 多核苷酸，以及其包括其它的编码和/或非编码序列的多核苷酸。本发明进一步涉及了与上文所述的序列杂交的多核苷酸，这些序列之间具 有至少大约70%，优选至少具有大约卯°/。，并且更优选地至少具有大 约95%的同一性。本发明尤其涉及了在严格条件下与上述多核苷酸杂 交的编码多肽的多核苷酸.此处所用的"严格条件"是指"严格的杂 交条件"。优选地，杂交仅在至少具有大约90%,并且优选地具有大 约95%至97。/。同一性的序列之间发生'在一个优选的实施方案中，与 上述所述的多核香酸杂交的多核苷酸编码基本上保留与cDNAs编码的 成熟多肽相同的生物学功能或活性的多肽。"功能性等价物，'与"基本上相同的生物学功能或活性"各自是 指生物活性的程度在大约30%到大约100%以内，或该多肽显示的生物 活性当与通过相同方法测定的各多肽的生物活性比较时更多.例如，
图1多肽的功能性等价物当通过实施例7的环化AMP (cAMP)闪烁 亲近检测进行测定时，其在表达人VPAC2受体的CHO细胞系中显示 出cAMP的累积.本发明的多肽也即VPAC2激动剂是一种当在实施例7的方案中测 定时显示出30%到大约100%或更多的最大PACAP-27 VPAC2激动剂 活性的多肽'本发明优选的多肽，即相对于PACAP、 VPAC1和PAC1 受体的VPAC2的选择性激动剂为那些多肽，其显示VPAC2激动剂活 性与VPAC1活性的比率为大约10:1或更大，并且更优选地，大约100:1 或更大，和/或显示出VPAC2激动剂活性与PAC1受体活性的比率为 大约10:1或更大，并且更优选地，当在实施例7的方案中利用表达合 适的受体的细胞测定该多肽时该比率为大约100:1或更大。"严格的杂交条件"是指两个多核苷酸(或片段)在42TC在溶液 中过夜温育杂交，该溶液包括50%甲酰胺、5xSSC (750mMNaCl， 75 mM柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH7.6) 、 5x Denhardt溶液、10% 葡聚糖硫酸酯、和20 fig/mL变性的、剪切的鲑精DNA，然后在大约 65TC在O.lxSSC中洗涤过滤器.术语"片段"，"衍生物"和"变体"，当涉及图1的多肽时， 是指维持与这些多肽基本上相同生物学功能或活性的多肽的片段、衍生物和变体，如下所述.类似物包括含有本发明多肽的氨基酸序列在内的前-多肽。本发明 的活性多肽可通过天然的、体内作用或通过本领域公知的方法诸如通 过酶切或化学裂解技术裂解自完全的前多肽分子的其它氨基酸.例如，28-氨基酸的天然肽VIP被天然表达为大量较大的多肽，其然后被 体内加工来释放28-氨基酸的活性的成熟肽。片段是多肽的一部分，其保留基本上类似的功能性活性，如此处 公开的体内模型所述的.衍生物包括所有对多肽的修饰，其基本上保持此处公开的功能并 且包含其它的结构和伴随的功能(例如，具有较大半衰期的聚乙二醇 化多肽)，赋予了靶特异性或其它的活性诸如对预定目标的毒性的融 合多肽，如下文所述。本发明的多肽可以是重组的多肽、天然纯化的多肽或合成的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或变体可以是(i)其中一个或多个氨 基酸残基被保守的或非-保守的氨基酸残基取代(优选地为保守的氨基 酸残基)，并且此取代的氨基酸残基可以是或可以不是通过遣传密码 编码的氨基酸残基，或(ii)其中氨基酸残基的一个或多个包括取代基 的，或(m)其中成熟多肽与另一个化合物，诸如一种增加多肽半衰期 的化合物(例如，聚乙二醇)熔合的，或(iv) —种其中其它的氨基酸 被融合到成熟多肽上的，诸如前导或分泌的序列或被用于成熟多肽的 纯化的序列或前多肽序列，或(v) —种其多肽序列与较大的多肽熔合 的(例如，人白蛋白、抗体或Fc，用于增加作用持续时间)。本领域 的技术人员从此处的教导可以理解这些片段、衍生物和变体以及类似 物在本发明的范围内。优选地，本发明的衍生物将在一或多个推定的，优选非必需氨基 酸残基处含有保守的氨基酸取代(在下面定义的)。"非必需氨基酸，， 残基是一种可改变自蛋白质的野生型序列而没有改变生物活性的残 基，而"必需"氨基酸残基是生物活性所需要的."保守的氨基酸取 代"是指其中氨基酸残基被用具有类似侧链的氨基酸残基替换.具有 类似侧链的氨基酸残基的家族在现有技术中已被定义，本家族包括具 有碱性侧链(例如，赖氨酸，精氨酸，组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性側链(例如，甘氨酸、天冬醜胺、 谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性的側链(例 如，丙氨酸、翔氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫 氨酸色氨酸)、P-分支的侧链(例如，苏氨酸、翔氨酸、异亮氨酸) 以及芳香族侧链(例如，輅氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨 基酸，非-保守取代不能用于保守的氨基酸残基或用于保守的蛋白功能区内的氨基酸残基，诸如残基19和27，其中这些残基是蛋白质活性诸 如VPAC2活性和/或VPAC2选择性所必不可少的.片段或生物学活性 部分包括适于用作药物来产生抗体，以及用作研究试剂等的多肽片 段。片段包括含有充分类似于或来源于本发明多肽氳基酸序列的氨基 酸序列并且具有那些多肽的至少一种活性，但其包含比此处公开的全 长多肽更少的氨基酸的肽.典型地，生物学活性部分包括具有多肽的 至少一种活性的功能区或基序。多肽的生物学活性部分可以是例如五 个或更多氨基酸长的肽。这些生物学活性部分可以合成或通过重组技 术来制备，并且可以通过此处公开的和/或本领域公知的方法来评价本 发明多肽的一或多种功能性活性.此外，本发明优选的衍生物包含已经与另一个化合物熔合的成熟 多肽，诸如一种增加多肽半衰期和/或减少多肽的潜在免疫原性的化合 物(例如，聚乙二醇，"PEG")。就聚乙二醇化而言，可通过本领 域技术人员公知的任意方法来进行多肽与PEG的融合.例如，聚乙二 醇化可通过首先引入一个半胱氨酸突变到多肽中来提供一个接头来连 接PEG，然后与PEG-马来酰亚胺进行位点特异性的衍生作用。半胱氨 酸可被添加到肽的C-末端，并且其中C-末端是本发明中优选的位点。 (参见，例如，Tsutsumi等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (15 ):8548-53，2000; Veronese, Biomaterials 22:405-417,2001; Goodsoon &Katre， Bio/Technology 8:343-346,1990),本发明多肽的变体包括具 有充分类似于图1中SEQ ID NOs氨基酸序列的氨基酸序列的多肽或其 功能区。术语"充分地相似"是指第一氨基酸序列相对于第二氨基酸 序列含有足够的或最小数目的相同或等价的氨基酸残基，使得第一和 第二氨基酸序列具有一个共同的结构域和/或共同的功能活性。例如， 含有至少大约45%,优选大约75%至98%同一性的共同结构域的氨基 酸序列在此处被定义为充分地相似。优选地，变体应充分类似于本发明的优选多肽的氨基酸序列。变体包括由与本发明的多核苷酸杂交或 其在严格条件下互补的多核苷酸编码的多肽的变体。这些变体通常保 持本发明多肽的功能活性。多核苷酸片段的文库可用于产生用于筛选 和随后选择的多样化群体。例如，片段的文库可通过在其中每一分子仅仅发生大约一次切口的条件下用核酸酶处理多核苷酸的双链PCR片 段，退火双链DNA,复性DNA来从不同的切口产物形成包括正义/反 义对的双链DNA，通过用Sl核酸酶处理除去重组双链体的单链部分， 以及将产生的片段文库连接到表达栽体中而产生。通过此方法，可以 荻得编码本发明多肽的N-末端以及不同大小的内部片段.变体包括由于突变而导致的氨基酸序列不同的多肽.用作VPAC2 激动剂的变体可通过筛选突变体的组合文库而被鉴定，例如用于 VPAC2激动剂活性的本发明多肽的平截突变体.在一个实施方案中，类似物的多样化文库通过在核酸水平上组合 的突变来产生并且被多样化的基因文库所编码。变体的多样化文库可 通过，例如将合成的寡核苷酸的混合物酶促连接到基因序列中，使得 潜在变体氨基酸序列的简并组被表达为单独的多肽，或可选择地，被 表达为其中含有该序列组的更大的融合蛋白组(例如，用于噬菌体展 示)，有许多方法可用于从简并寡核苷酸序列产生可能变体的文库。 可在DNA自动合成仪中进行简并基因序列的化学合成，并且然后将合 成基因连接到合适的表达载体中。基因简并组的使用使得有可能在一 种混合物中提供编码可能的变体序列的目的组的所有序列，合成筒并 寡核苷酸的方法是本领域已知的(参见，例如，Narang， Tetrahedron 39:3,1983j Itakura，等，Aimu. Rev, Biochem. 53:323,1984; Itakura 等，Science 198:1056,1984; Ike等，Nucleic Acid Res. 11:477,1983 ),筛选组合文库的基因产物的一些技术是本领域公知的，其中组合 文库是通过点突变或平截产生的并且用于筛选具有选择特性的基因产 物cDNA文库。这些技术适用于通过R-激动剂多肽的组合突变来对产 生的基因文库进行快速筛选.最广泛使用的技术，其用于筛选大基因 文库的高通量分析典型地包括克隆基因文库到可复制的表达载体中， 用产生的栽体的文库转化合适的细胞并在检测目的活性促进编码其产 物被检测的基因栽体分离的条件下表达组合基因.递推集团突变形成 (REM)， 一种增强文库中功能性突变频率的技术，可用于与筛选试验组合来鉴定目的变体。本发明也提供了嵌合的或融合的多肽。设计目的序列来用于定位 传递多肽到胰腺来使可能的副作用最小化。本发明的多肽可由彼此通 过肽键或修饰的肽键连接的氨基酸组成(即，肽的电子等排物)，并且可含有除了 20个基因-编码的氨基酸之外的氨基酸。多肽可通过自然 过程，诸如转译后的作用，或者通过本领域公知的化学修饰技术被修 饰，这些修饰被广泛描述在基本的教科书中和更具体的专著中，以及 在长篇的研究文献中.修饰可发生在多肽的任意位置，包括肽主链、 氨基酸侧链和氨基或羧基末端.可以理解相同类型的修饰可以相同或 不同的程度存在于给定的多肽的一些位点处。同样地，给定的多肽可 含有很多类型的修饰.多肽可以是分支的，例如，作为遍在蛋白化的 结果，并且它们可以是环状的，有或者没有分支。环状的、分支的和 分支环状的多肽可产生于转译后的自然过程或通过合成方法来产生。 修饰包括乙酰化、酰化作用、ADP-核糖基化、醜胺化、核黄素的共价 连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、 脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化 作用、二疏键形成、脱甲基作用、共价交连的形成、半胱氨酸的形成、 焦谷氨酸的形成、曱酰化作用、Y-羧基化、糖基化作用、GPI锚形成、 羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、十四碳酰化、氧化、聚乙醇化、 蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒酰化、酸酯化 作用、转运RNA介导的氨基酸添加到蛋白质上，诸如精氨酰化、以及 遍在蛋白4匕(参见，例如，Proteins ， Structure and Molecular Properties. 第二版，T. E. Creighton， W, H. Freeman and Company, 纽约(1993) ; Posttranslational Covalent Modification of Proteins. B.C.Johnson, ed"学院出版社，纽约，pgs.1-12 ( 1983 ) ; Seifter，等.， Meth. Enzymol 182:626-646,1990; Rattan等，Ann. N, Y. Acad. Sci. 663:48-62,1992).本发明的多肽包括图1的多肽(SEQ ID NOs:l至152 )，以及那 些在序列上具有非实质变化的序列."非实质性变4匕"包括实质上保持本发明多肽的至少一个生物学功能的任意的序列添加、取代或缺失 的变体，优选的生物学功能为VPAC2激动剂活性，并且更优选地为选 择性的VPAC2激动剂活性，并且最优选地，为在此处显示的胰岛素分泌活性。这些功能性等价物可优选地包括与图1的多肽具有至少大约90%同一性的多肽，并且更优选地至少与图1的多肽具有95%同一性， 并且更优选地与闺1的多肽具有至少97%的同一性，也包括这些具有 大体上相同生物活性的多肽。然而，在此处进一步描述的来自图1多 肽在氨基酸序列中具有非实质性变化的显示出功能性等价的任意多肽 被包含在本发明的描述中。本领域公知的两个多肽之间的"相似性"被通过氨基酸序列及其 多肽的保守氨基酸取代物与第二多肽的序列之间的比较来测定，这些 保守的取代包括如上所述的和Dayhoff所描述的(The Atlas of Protein Sequence and Structure 5，1978 ),和Argos所述的(EMBO J. 8:779-785,1989),例如，属于下组之一的氨基酸表示保守的变化-丙氨酸、脯氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸；-半胱氨酸、丝氨酸、輅氨酸、苏氨酸；-翔氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸；-赖氨酸、精氨酸、组氨酸；-苯丙氨酸、輅氨酸、色氨酸、组氨酸；和-天冬氨酸、谷氨酸。本发明同样涉及编码本发明多肽的多核苷酸以及包含这些多核苷 酸的栽体、用本发明栽体遗传改造的宿主细胞，以及通过重组技术产 生本发明多肽的方法。可用本发明的栽体进行遣传改造对宿主细胞(传导、转化或转 染)，其中栽体可以是例如克隆栽体或表达栽体.栽体可以是，例如 质粒、病毒粒子、噬菌体的形式等。工程改造的宿主细胞可培养在被 改变成适于激活启动子或选择转化体的常规培养基中.培养条件，诸 如温度、pH值等，为以前选择用于表达的宿主细胞所使用的，并且对 于普通的技术人员是显而易见的。本发明的多核苷酸可用于通过重组 技术来产生多肽.因此，例如，多核苷酸序列可包含在各种任意的表 达栽体中，尤其是用于表达多肽的栽体或质粒中.这些栽体包括染色 体的、非染色体的以及合成的DNA序列(例如，SV40的衍生物)； 细菌质粒；噬菌体DNA;酵母质粒；获自质粒和噬菌体的DNA组合 的栽体；病毒DNA诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒以及伪狂犬病病毒。 然而，任意其它的栽体或质粒可被使用，只要它们在宿主中是可复制的和有活力的。可通过各种方法将合适的DNA序列插入到载体中。通常，通过本 领域已知的方法将DNA序列插入到合适的限制性核酸内切酶位点中。 认为这些以及其它的方法在本领域技术人员的知识范围内。表达栽体 中的DNA序列可操作地连接于合适的表达调控序列(启动子)来直接 合成mRNA。这些启动子的典型实例包括但不限于，LTR或SV40启 动子、大肠杆菌lae或trp、噬菌体X PL启动子，及其它已知调控基 因在原核或真核细胞或他们的病毒中表达的启动子。表达栽体也可含 有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子.栽体也可包括用于扩增表达的合适的序列.此外，表达栽体优选地含有一种基因来提供 用于选择转化的宿主细胞的表型特性，诸如用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或诸如在大肠杆菌中的四环素或氨节音霉 素抗性。含有在此处描述的合适DNA序列，以及合适启动子或调控序 列的载体可被利用来转化合适的宿主来允许宿主表达蛋白质。合适宿 主的典型实例包括但不限于细菌细胞，诸如大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏 菌、链霉菌属；真菌细胞，诸如酵母；昆虫细胞，诸如果蝇S2和 Spodoptera Sf9;动物细胞诸如CHO、 COS或Bowes黑色素瘤；腺病 毒；植物细胞等。本领域的技术人员从此处的教导可以理解如何进行 合适宿主的选择。本发明也包括含有一个或多个如上所述的序列的重组构建体.构 建体包括一个栽体，诸如质粒或病毒栽体，其中以正向或反向插入了 本发明的序列，在这些实施方案的一个优选的方面，构建体进一步含 有调节序列，包括，例如与该序列可操作地相连的启动子.大量的合 适的栽体和启动子是本领域的普通技术人员所公知的，并且是市售 的。下面的栽体以实例的方式来提供'细菌pQE70、 pQE卯、pQE-9、 pBS、 phagescript、 psiX174、 pBluescript SK、 pBsKS、 pNH8a、 pNH16a、 pNH18a、 pNH46a、 pTRC99A、 pKK223-3、 pKK233-3、 pDR540 和PRIT5。真核生物的pWLneo、 pSV2cat、 pOG44、 pXTl、 pSG、 pSVK3、 pBPV、 pMSG和PSVL。然而，任意其它的栽体或栽体可被使用，只 要它们在宿主中是可复制和有活力的.启动子区域可选自任意的使用 CAT (氯霉素转移酶)载体或其它具有选择性标记的栽体的目的基因。 两个合适的栽体为pkk232-8和pCM7,特定命名的细菌启动子包括lad、 lacZ、 T3、 T7、 gpt、入PR、 PL和trp.真核细胞的启动子包括 CMV的立即早期、HSV胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆病毒的 LTRs和老鼠金属硫蛋白-I。对合适栽体和启动子的选择在本领域普通 技术人员可理解的范围内。本发明也涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是高等 的真核细胞，诸如哺乳动物细胞或低等的真核细胞，诸如酵母细胞， 或宿主细胞可以是原核细胞，诸如细菌细胞。将构建体导入到宿主细 胞中可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔法(Davis 等，Basic Methods in Molecular Biology, 1986)来进行。宿主细胞中 的构建体可通过常规的方式用于产生由重组序列编码的基因产物。可选择地，本发明的多肽可以通过常规的肽合成仪来合成制备，成熟的蛋白可在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其它细胞中合适启 动子的调控下表达。也可以使用无细胞翻译系统利用获自本发明DNA 构建体的RNAs来产生这些蛋白质，用于原核生物和真核生物宿主的 合适克隆和表达栽体被Sambrook等描迷于Molecular Cloning:实验室 指南，第二版，(Cold Spring Harbor, N.Y， 1989)，其内容通过引 用在此作为参考.由更高等的真核生物编码本发明多肽的DNA转录被通过插入一个 增强子到序列中而增强。增强子为DNA的顺式作用元件，通常为从大 约10到大约300bp，其作用于启动子来增强其转录。实例包括在复制 起点的晚期一侧的SV40增强子(bp 100到270)，巨细胞病毒早期启动子增强子，在复制起点晚期一侧的多形瘤增强子以及腺病毒增强 子.通常，重组表达栽体包括允许宿主细胞转化的复制起点以及选择 性标记(例如，大肠杆菌的氨爷青霉素抗性基因或畔酒八叠球菌 (S.cerevisiae) TRP1基因)，以及指导下游结构序列转录的获自高度 表达基因的启动子。这些启动子可获自编码糖酵解酶诸如3磷酸甘油 酸激酶(PGK) 、 a因子、酸性磷酸酶或热激蛋白等的操纵子，异源的 结构序列在合适的阶段被装配了翻译、起始和终止序列，以及优选地， 装配了能够指导分泌翻译的蛋白到周质间隙或胞外介质中的前导序 列。选择性地，异源序列可编码包括赋予目的特性(例如，表达的重 组产物的稳定化或简单化的纯化)的N-末端鉴定肽的融合蛋白。用于细菌的有益表达栽体可以通过插入一个编码目的蛋白的结构DNA序列以及在可操作的阅读阶段插入合适的翻译、起始以及终止信 号与功能性的启动子来构建。栽体可包括一个或多个表型的选择性标 记以及一个复制起点来确保栽体的维持以及如果希望，在宿主内提供 扩增。用于转化的合适的原核生物宿主包括，例如大肠杆菌、枯草芽 胞杆菌、鼠伤寒沙门氏菌以及假单胞菌属、链霉菌属和葡萄球菌属中 的不同的种，尽管其它的也可被使用作为一种选择，用于细菌的有益 表达栽体可包括获自含有众所周知的克隆栽体pBR322 (ATCC 37017)的遗传元件的市售质粒的选择性标记和细菌复制起点.这些商 用栽体包括例如，pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden和GEM1 (Promega， Madison, Wis" USA)。这些pBR322 "主链"部分可与合适的启动子和结构序列相结合而被表达，在合适的宿主菌林的转化和宿主菌林生长到合适的细胞密度后， 将选择的启动子通过适当手段去阻遏(例如，温度变化或化学诱导) 并且将细胞培养另外一段时间。典型地通过离心收集细胞，通过物理 的或化学的方法裂解，并且保留产生的粗提物用于进一步的纯化。用 于蛋白质表达的微生物细胞可通过任意方便的方法来破坏，包括冻融 循环、超声波处理、机械破坏或使用细胞裂解试剂。不同的哺乳动物细胞培养系统也可用于表达重组蛋白质.哺乳动 物表达系统的实例包括猴肾脏成纤维细胞的COS-7细胞系，描述于 Gluzman， Cell 23:175,1981 )，及其它能够表达相容性栽体的细胞系， 例如，C127、 3T3、 CHO、 HeLa和BHK细胞系。哺乳动物表达栽体 可以包括一个复制起点、 一个合适的启动子和增强子，以及任意必需 的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终 止序列和5，侧接非转录序列。获自SV40病毒基因组的DNA序列，例 如SV40起点、早期启动子、增强子、接头和聚腺苷酸化位点可被用来 提供需要的非转录遣传元件.本发明的多肽可被回收并通过目前使用的方法从重组的细胞培养 物中纯化，包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸萃取、阴离子或阳离子交换 层析、磷酸纤维素色谱层析、疏水作用层析、亲和层析、羟基磷灰石 层析和凝集素色谦层析。可根据需要在完成成熟蛋白的构型中使用蛋 白质重折叠步骤.最后，可以将高效液相色镨(HPLC)用于最后的纯 化步骤。本发明的多肽可以是化学合成方法的产物，或由原核生物或真核 生物宿主(例如细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)通过 重组技术来生产。取决于在重组生产方法中使用的宿主，本发明的多 肽可以用哺乳动物或其它真核生物的碳水化合物糖基化或可以是非糖 基化的。本发明的多肽也可以包括最初的甲硫氨酸氨基酸残基.本发 明的分离或纯化的多肽或其生物学活性部分，当通过重组技术产生时 大体上不含有其它的细胞物质或培养基，或当化学合成时大体上不含 有化学前体或其它化合物。优选地，本发明的分离多肽大体上不含有细胞物质并且具有小于大约30% (干重)的非多肽或污染物质。当本 发明的多肽或其生物学活性部分被重组产生时，优选地培养基占多肽 制品的30%以下的体积。当本发明通过化学合成生产时，优选地该制 品含有小于大约30%干重的化合物前体或非发明的化合物。本发明的多肽可通过下面所述的特定的实施例被很方便地分离。 纯化的多肽制品为至少大约70%纯；优选地，该制品为大约85%至大约99°/。純，本制品的纯度可通过本领域已知的任意方法进行评估，诸 如SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和质谦/液相色谱.可以利用本领域众所周知的化学方法完全地或部分地合成编码本 发明多肽的多核苷酸序列(参见，例如，Camthers等，Nucl. Acids Res. Symp, Ser, 215-223，1980; Horn等，Nucl Acids Res. Symp. Ser. 225-232,1980).然后可以将编码多肽的多核苷酸克隆到表达栽体中来表达 多狀，本领域的技术人员应能理解，产生具有非天然存在的密码子的编 码多肽的核苷酸序列也许是有益的。例如，可选择特定的原核生物或 真核生物宿主的优选的密码子来增加多肽表达的速率或来产生具有目 的特性的RNA转录本，诸如比由天然存在的序列产生的转录本的半衰期更长的半衰期。由于种种原因，可以利用本领域已知的常规方法对此处公开的核 苷酸序列进行改造来改变多编码肽的序列，包括但不限于修饰多肽或 mRNA产物的封闭、加工和/或表达的改变。可通过随机断裂来重组 DNA和基因片段以及合成寡核苷酸的PCR重装配来改造核苷酸序 列.例如，定点诱变可被用来插入新的限制性位点，改变糖基化模式， 改变密码子偏爱性，产生接头变体，引入突变等.也提供在本领域的技术人员可以理解的范闺内的相关的化合物， 诸如化学模拟物、有机模拟物或肽模拟物。此处使用的术语"模拟物"、"肽模拟物"、"多肽模拟物，'、"有机模拟物"和"化学模拟物" 包括肽衍生物、肽类似物以及与本发明的肽等价的在三维方向具有原 子排列的化合物。可以理解此处所用的术语"等价于，，是指包含在所 述肽中的具有特定原子或化学部分的取代的化合物，具有鍵长，键角，合物的排列，从而i有本发明肽的生"学功A。在本i明二肽模拟物 中，化学组分的三维排列在结构和/或功能上等价于肽主链和肽的组分 氨基酸侧链的三维排列，使得本发明肽的这些肽模拟物，有机模拟物 和化学模拟物具有实质上的生物活性。这些术语被依照本领域的理解来使用，例如，Fauchere ( Adv, Drug Res. 15:29,1986) ; Veber & Freidinger， (TINS p.392，1985 );和Evans等，(J, Med. Chem. 30:1229,1987)所详细阐述的，在此引作参考。可以理解本发明的各种肽存在生物活性的药效基团。在本领域中 药效基团被理解为包括生物活性所需的理想化的，三维的结构定义. 肽模拟物、有机模拟物和化学模拟物可被设计来适合各自的药效基团 与当前的计算机模拟软件(计算机辅助药物设计)。所述模拟物可通 过结构-功能分析，基于本发明肽中取代基原子的位置信息来产生.本发明提供的肽可通过本领域任意已知的化学合成技术，尤其是 固相合成技术方便地合成，例如，利用商业-获得的自动肽合成仪。本 发明的模拟物可通过通常用于肽合成的固相或液相方法来合成。(参 见，例如，Merrifield, J. Amer, Chem. Soc. 85:2149-54,1963; Carpino， Acc. Chem. Res. 6:191-98， 1973; Birr, Aspects of the Merrifield Peptide Synthesis, Springer-Verlag: Heidelberg, 1978; The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vols. 1, 2， 3，和5， ( Gross & Meinhofer， eds.)， 学院出版社纽约，1979; Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis, 第二版，Pierce Chem. Co.: Rockford， 111" 1984; Kent, Ann. Rev. Biochem. 57:957-89,1988;和Gregg等，Int. J. Peptide Protein Res. 55:161-214,1990，其在此全部引入作为参考)。优选使用固相方法。简要地，N-保护的C-末端氨基酸残基被连接 于不溶解的载体诸如二乙烯基苯交联的聚苯乙烯、聚丙烯跣胺树脂、硅藻土/聚酰胺(p印syn K)、可控的微孔玻璃、纤维素、聚丙烯膜、 丙烯酸-涂层的聚乙烯棒，等.去保护、中和和相继的保护性氨基酸衍 生物的偶联的循环被用于从C-末端依照氨基酸序列来连接氨基酸.对 一些合成肽而言，可以使用利用酸敏感性树脂的FMOC策略。优选的 固相栽体为二乙烯基苯交联的聚苯乙烯树脂，其是以各种功能化的形 式市售的，包括氯甲基树脂、羟甲基树脂、对乙酰胺基曱基树脂、二 苯甲基胺(BHA)树脂、4-甲基二苯曱基胺(MBHA)树脂、肟树脂、 4-烷氧基苯曱醇树脂(Waiig树脂)、4- U，，4，-二甲氧基苯基氨基曱基 (MBHA)树脂-苯氧基甲基树脂、2，4-二甲氧基二苯甲基-胺树脂和4-(2，，4，-二甲氧基苯基-FMOC-氨基-甲基)-苯氧基乙酰胺基正亮氨酰基 MBHA树脂(Rink酰胺MBHA树脂)。此外，酸-敏感的树脂也提供 了C-末端酸类，如果希望的话。尤其优选的a-氨基酸的保护基是碱不 稳定的9-芴基甲氧基-羰基(FMOC).本领域众所周知的是，氨基酸侧链功能团的合适保护基在化学上 与BOC (叔-丁氧基羰基)和FMOC基团是相容的.当利用FMOC化 学作用时，下列的保护性氨基酸衍生物是优选的FMOC-Cys ( Trit)、 FMOC-Ser (But) 、 FMOC-Asn ( Trit) 、 FMOC垂Leu、 FMOC-Thr (Trit) 、 FMOC-Val、 FMOC-Gly、 FMOC-Lys (Boc) 、 FMOC-Gln (Trit) 、 FMOC誦Glu ( OBut) 、 FMOC-His ( Trit) 、 FMOC-Tyr ( But)、 FMOC-Arg (PMC ( 2，2，5，7，8-五甲基苯并二氢吡喃-6-磺跣基))、 FMOC-Arg (BOC) 2、 FMOC-Pro和FMOC-Trp ( BOC )。氨基酸残基可通过利用各种偶联剂和本领域已知的化学作用被偶联，诸如直接 与DIC (二异丙基-碳二亚胺)、DCC(二环己基碳二亚胺)、BOP(苯 并三唑基-N-氧基三(二甲氨基)膦错六氟裤酸)、PyBOP (苯并三唑 -l-基-羟基-三-吡咯烷基膦六氟-磷酸酯)、PyBrOP (溴代-三-吡咯烷基 膦错六氟磷酸酯偶联；通过对称的酸酐偶联；通过活性酯诸如五氯苯 基酯偶联；或通过进行的HOBt (1-羟基苯并三唑)活性酯或通过利用 FMOC-氨基酸氟化物和氯化物或通过利用FMOC-氨基酸-N-羧基肝偶 联。在HOBt或HOAt( 7-氮杂羟基苯并三唑)存在下用HBTU( 2-( 1H-苯并三唑-l-基)、1，1，3，3-四甲基脲锱六氟磷酸酯)或HATU ( 2- (1H-7-氮杂-苯并三唑-l-基)、1，1，3，3-四曱基脲镜六氟磷酸酯)激活是优选的。 尽管优选在市售的肽合成仪(例如，Applied Biosystems 431A等；Applied Biosysteras， Foster City, CA)上自动合成，但固相方法可以 人工进行。在一个代表性的合成方案中，第一个(C-末端)氨基酸被 加载到氯代三苯甲基树脂上.依照ABI FastMoc方案(A卯lied Biosystems )的相继的去保护(用20。/。哌啶/NMP ( N-甲基吡咯烷酮)) 和偶联循环可用于产生序列。通过用乙酸肝加帽的双倍和三倍偶联， 也可被4吏用。可以从树脂上裂解合成的模拟肽并通过用含有合适净化剂的TFA (三氟乙酸)去保护.许多这样的裂解试剂，诸如试剂K(0."g结晶 酚、0.25 mL乙硫醇、0.5mL苯甲碗鍵、0.5mL去离子水、10mLTFA) 以及其它可以被使用。通过过滤从树脂中分离肽并通过瞇沉淀进行分 离。通过传统的方法，诸如凝胶过滤和反相HPLC(高效液相色镨) 进行进一步的纯化。本发明合成的模拟物可以是药用盐的形式，特别 是碱加成盐包括有机碱和无机碱的盐。依照本领域技术人员公知的方 法，通过用合适的碱或无机碱处理肽来制备酸性氨基酸残基的碱加成 盐，或可通过冷冻干燥合适的碱而直接获得目的盐.通常，本领域的技术人员可以理解可通过各种化学技术修饰此处 所述的肽来产生与未修饰的肽具有基本上相同活性，并且选择性地具 有其它的目的特性的肽'例如，肽的羧酸基团可以是以药学上可接受 的阳离子的盐形式来提供。舦内的氨基可以是药学上可接受的酸加成 盐的形式，诸如HC1、 HBr、醋酸、安息香酸、甲苯磺酸基、马来酸、 酒石酸的盐及其它的有机盐，或可被转变为酰胺。通过任一大量的熟 知的保护基诸如乙酰胺基团来保护硫醇。本领域的技术人员也将能够 确定引入环状结构到本发明肽中使得天然结合构象进一步几乎接近的 方法。例如，羧基末端或氨基末端半胱氨酸残基可被添加到肽上，使 得当氧化肽时将含有一个二硫键，由此产生一个环肽。其它的肽环化 方法包括硪酸和羧基-和氨基-末端酰胺和癍的形成。特定地，各种不同的方法被有效地用于构建具有与相应的肽化合 物相同的或类似的目的生物活性的肽衍生物和类似物，所述的肽衍生 物和类似物具有更有利的关于溶解性、稳定性和对水解和蛋白酶解的 敏感性的活性。此类衍生物和类似物包括在N-末端氨基、C-末端羧基修饰，和/或改变肽中的一个或多个酰胺鍵为非-酰胺键的肽。可以理解 两种或多种这样的修饰可偶合在一种肽模拟物结构中(例如，在C-末端羧基上进行修饰并且在肽的两个氨基酸之间包含-CHr氨基甲酸醋 键)。氨基末端修饰包括烷基化、乙酰化、加入一个羧苯甲酰，以及形 成一个琥珀酰亚胺基团。特定地，可使N-末端氨基反应来形式一个通 式RC (O) NH—的酰胺基，其中R是烷基，优选为低级烷基，并且通 过与酰卣、RC (O) Cl或酸fff反应而被加入。典型地，反应可通过在 惰性稀释刑(例如，二氯甲烷)中使大约当量克分子的或过量(例如， 大约5当量)的卣化酰基与肽接触来进行，优选地惰性稀释剂含有过 量(例如，大约10当量)的叔胺，诸如二异丙基乙胺，来清除反应过 程中产生的酸。反应条件是常规的(例如，室温30分钟)，使末端氨 基烷基化来提供低级烷基的N-取代，然后如上所述与酰卣反应将提供 通式RC (O) NR-的N-烷基酰胺基团.可选择地，氨基末端可通过与 琥珀酸酐反应而共价连接于琥珀酰亚胺基团上。使用大约当量克分子 的量或过量的琥珀酸酐(例如，大约5当量)且末端氨基通过本领域 公知的方法在合适的惰性溶剂(例如，二氯曱烷)中被转变为叔胺， 描述在WoUenberg等(美国专利No. 4，612，132 )中，其全部引入作为 参考。可以理解琥珀酸基团可用例如，CV至CV烷基或-SR取代基取 代，其被以常规的方式制备来提供肽N-末端的取代的琥珀酰亚胺.此 烷基取代基可通过低级烯烃(Cr至Q-烷基)与马来酐以Wollenberg 等如上文所述的方式反应来制备，并且-SR取代基可通过使RSH与马 来酐反应来制备，其中R如上述所定义。在另一个有益的实施方案中， 氨基末端可被衍生化来形成节氣基羰基-NH—或取代的节氣基羰基-NH-基团. 此衍生物可通过与大约一当量的或过量的节氧基羰基氯化 物(CBZ-C1)或取代的CBZ-C1在合适的惰性稀释刑(例如，二氯甲 烷)中反应来制备，惰性稀释剂优选地含有叔胺来清除反应过程中产 生的酸。在另一个衍生物中，通过与当量数或过量(例如5当量)的 R--S (O) 2C1在合适的惰性稀释剂(二氯甲烷)中反应来将末端胺转 变为氨磺跣使得N-末端包括一个氨磺酰基团，其中R是烷基并且优选 地为低级烷基，优选地，惰性稀释液含有过量叔胺(例如，IO当量)， 诸如二异丙基乙胺来清除反应过程中产生的酸.反应条件是常规的(例 如，室温30分钟).通过与一当量或过量(例如5当量)的R—OC(O) Cl或R—OC ( O ) OC6H4--p—N02在合适的惰性稀释液(例如，二氯甲烷)中反应来将末端胺转变为氨基曱酸酯，使得在N-末端产生氨基曱 酸酯基团，其中R是烷基，优选地为低级烷基.优选地，情性稀释液 含有过量叔胺(例如，10当量)，诸如二异丙基乙胺来清除反应过程 中产生的任意酸。反应条件是常规的(例如，室温30分钟).通过与 一当量数或过量(例如5当量)的R-N=00在合适的惰性稀释液(例 如，二氯曱烷)中反应将末端胺转变为脲(即，RNHC(O)NH--)基 团，使得在N-末端形成脲基团，其中R如上文所定义的.优选地，惰 性稀释液含有过量叔胺(例如，10当量)，诸如二异丙基乙胺.反应 条件是常规的(例如，室温30分钟).在肽模拟物的制备中，其中C-末端羧基可被酯替代(例如，-C( O ) OR，其中R是烷基，优选地为低级烷基)，使用用于制备舦酸的树脂， 并且侧链保护的肽可用碱基和合适的醇(例如，曱醇)裂解.以常规 方式通过用氟化氢处理除去側链保护基来荻得目的酯.在制备肽模拟 物中，其中C-末端羧基被酰胺—C (O) NR3R4替代，二苯甲基胺树脂被用作肽合成的固相栽体。当合成完成时，用氟化氢处理来从栽体肽 释放肽，直接产生游离的肽酰胺(即，C末端为—C (O) NH2),可选 择地，在肽合成过程中，将氯曱基化树脂的使用与氨反应偶合来由栽 体裂解側链保护肽而产生游离的肽酰胺，并且与烷基胺或二烃基胺反 应来产生側链保护的烷基酰胺或二烷基酰胺(即，C-末端为-C (O) NRRh其中R和Ri是烷基，优选地为低级烷基)'以常规方式用氟 化氢处理除去侧链保护来产生游离的酰胺、烷基酰胺或二烷基酰胺。在另一个可选择的实施方案中，通过分别用N-末端氨基分别置换 羧基或酯的—OH或酯—OR)来诱导C-末端羧基或C-末端酯环化而形 成环肽。例如，合成和裂解产生肽酸后，通过合适的羧基活化剂诸如 二环己基碳二亚胺(DCC)在溶液中，例如，在二氯曱烷(CH2C12)、 二曱基甲酰胺(DMF)或其混合物中将游离酸转变为激活的酯.然后 用N-末端胺置换激活的酯而形成环肽。环化作用，而不是聚合作用， 可通过使用合适的稀释溶液依照本领域公知的方法被增强。可以理解，本发明提供的肽模拟物在结构上类似于本发明的肽， 但具有一或多个选择性地被选自下组的鍵替代的肽键-CH2NH--， 一 CH2S—， —CH2CH2—， —CH-CH-(在顺式和反式构象异构体中)，— COCH2—， —CH(OH)CH2—，和-曙CH2SO—，通过本领域已知的和在下面参考文献中进一步描述的方法进^f亍Spatola， Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, (Weinstein， ed,) ， Marcel Dekker:纽约，p. 267,1983; Spatola, Peptide Backbone Modifications 1:3，1983; Morley， Trends Pharm. 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Engl. 25:767-778,1986;其内容在此引入作为参考)。根据常规的药物设计方法，通过随机测定分子而获得目的模拟物 分子，其结构具有与"天然的"肽相同的结构特征.由结合分子的特定基团的改变产生的定量的作用可通过测定推断的模拟物与肽活性比 较的生物活性来测定。在一个优选的合理药物设计的实施方案中，模 拟物被设计成共有肽的最稳定的三位构象的特征，因此，例如，模拟 物可被设计成以类似于本发明肽具有的足以引起离子的、疏水性的、 或范德华相互作用的方式具有化学基团，如此处公开的。优选的设计合理模拟物的方法采用能够形成肽三维结构的模型的 计算机系统，诸如Hol 1989a; Hol， 1989b;和Hol， 1986例证的那些。 本发明肽的肽-、有机-和化学-模拟物的分子结构可利用市售的计算机 辅助设计程序来产生。此程序的实例包括sybyl 6.5 , hqsarTM，和 alchemy 2000TM ( Tripos) ; galaxyTM和am 2000TM ( AM Technologies,Inc., San Antonio, TX); catalystTM和ceriusTM( Molecular Simulations, Inc., SanDiego， CA ); cACHE PRODUCTS窗，TSARTM， AMBERTM, 以及CHEM-XTM ( Oxford Molecular Products ， Oxford ， CA )和 CHEMBUIU)ER3DTM( Interactive Simulations, Inc., San Diego， CA)。 利用例如人工-识别的分子模型建立程序以及利用此处公开的肽通 过常规的化学合成技术来制备产生的肽-、有机-和化学-模拟物，最优 选地设计成能适应高通量筛选，包括组合的化学作用方法。对产生本 发明的肽-，有机-和化学-模拟物有用的组合方法包括噬菌体展示阵 列、固相合成和组合的化学阵列，可提供，例如通过SIDDCO(Tuscon， Arizona); Tripos, Inc.; Calbiochem/Novabiochera.( San Diego ， CA); Symyx Technologies, Inc. ( Santa Clara, CA ) ; Mediche迈Research, Inc. ( Lemont， IL); Pharm-Eco Laboratories, Inc. ( Bethlehem, PA); 或N.V.Organoii (Oss， Netherlands )提供.本发明的肽-，有机-和化学-模拟物的组合化学生产可依照本领域已知的方法来进行，包括但不 P艮于，公开于Terrett， ( Combinatorial Chemistry, Oxford University Press, London, 1998) ; Gallop等，J. Med. Chem. 37:1233-51,1994; Gordon等，J. Med. Chera. 37:1385-1401,1994; Look等，Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:707-12，1996; Ruhland等，J. Amer. Chem. Soc. 118:253-4,1996; Gordon等，Acc. Chem. Res. 29:144-54,1996; Thompson & Ellman， Chem. Rev. 96:555-600,1996; Fmchtel & Jung, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35:17-42,1996; Pavia， "The Chemical Generation of Molecular Diversity", Network Science Center, www.netsci.org， 1995; Adnan等,"Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization, "Id,， 1995; Davies和Briant， "Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity, "Id., 1995; Pavia ， "Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future, "Id" 1996;以及专利U.S. Nos. 5,880,972; 5,463,564; 5，331573; 和5，573，卯5中 通过初步的高效液相色谱法大体上纯化新合成的多肽(参见，例 如，Creighton, Proteins: Structures And Molecular Principles, WH Freeman和Co"纽约，N.Y.， 1983).本发明的合成多肽的组成可通 过氨基酸分析或通过，例如，Edman降解法(Creighton,如上文所述)测序来证实。另外，可在直接合成中和/或利用化学方法与来自其它蛋 白的序列结合来改变多肽氨基酸序列的任意部分而产生变体多肽或融 合多肽。也可根据本发明通过此多肽的体内表达来使用本发明的多肽，其 通常被称为"基因治疗"。因此，例如，可用一个编码先体外后体内的多肽的多核苷酸(DNA或RNA)来改造细胞，改造的细胞被提供给患者来用多肽进行治疗.这样的方法是本领域公知的。例如，细胞可 被通过本领域已知的方法利用含有编码本发明多肽的RNA的逆转录病毒进行改造.利用基因治疗的胰岛素促泌剂的局部输送可将治疗剂提供到目的 区域(例如，胰腺)。例如胰腺-特异性启动子被用来产生p-细胞胰腺 肿瘤小鼠模型(Hanahan， Nature 315 (6015) :115-22,1985)'体外和体内两种基因治疗方法被关注a —些将潜在的治疗基因转运到细胞群体的方法是已知的(参见，例如，Mulligan, Science 260:926-31,1993),这些方法包括，例如1) 直接的基因传递(参见，例如，Wolff等，Science 247:1465-68,1990);2) 脂质体-介导的DNA传递(参见，例如，Caplen等，NatureMed. 3:39-46,1995; Crystal, Nature Med. 1:15-17，1995; Gao和Huang， Biochem. Biophys. Res. Comm. 179:280-85 1991 );3 )逆转录酶病毒-介导的DNA传递(参见，例如Kay等，Science 262:117-19,1993; Anderson, Science 256:808-13,1992 ),4) DNA病毒-介导的DNA传递.此类DNA病毒包括，例如，腺 病毒(优选地基于栽体的Ad-2或Ad-5 )、疱疹病毒(优选地基于单纯 疱療病毒的栽体)和细小病毒(优选地基于"缺陷的"或非-自主的细 小病毒的栽体，更优选地为基于与腺病毒相关的病毒的栽体，最优选 地为基于AAV-2的栽体)(参见，例如，Ali等，Gene Therapy 1:367-84， 1994;美国专利No.4，797，368;美国专利No. 5,139,941;在此引入作为参考.传递目的基因的特定栽体系统的选择取决于各种因素。 一个重要 的因素是靶细胞群体的特性，尽管逆转录病毒栽体已被广泛地研究并 使用在大量的基因治疗应用中，但是该栽体通常不适合于侵染非分裂的细胞.此外，逆转录酶病毒具有致癌的可能。然而，有关豆病毒栽体方面的最新进展可绕过这样的一些局限性(参见，例如，Naldini等， Science 272:263-67,1996)。可从中获得逆转录病毒质粒载体的逆转录酶病毒包括但不限 于，莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、逆转录酶病毒诸如劳氏 肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽类白血病病毒、长臂猿白血病毒、人 类免疫缺陷性病毒、腺病毒、骨髄及外骨髄增殖的肉瘤病毒、以及 乳腺瘤病毒。腺病毒具有下列优点，它们具有广泛的宿主范围，可侵染静止的 或在末端分化的细胞，诸如神经元或肝细胞并且基本上呈现非致瘤性 (参见，例如，Ali等，1994)。腺病毒看来似乎没有被整合到宿主基 因组中。因为它们存在于染色体外，插入突变的危险被大大地降低了. Ali等，1994.与腺病毒相关的病毒具有类似的优点，如基于腺病毒的栽体.然 而，AAVs显示出位点特异性整合在人的染色体19上(参见，例如， Ali等，1994)。在一个优选的实施方案中，编码本发明的多肽胰烏素促泌剂的 DNA被用于疾病诸如糖尿病和与糖尿病-相关的疾病的基因治疗中.依照这些实施方案，用编码本发明的多肽胰岛素促泌刑或突变蛋 白的DNA进行的基因治疗在诊断的同时或诊断后立即被提供给有需求 的患者。技术人员应能理解任意合适的含有多肽胰為素促泌剂、DNA或 DNA片段、衍生物、或多肽胰乌素促泌剂的变体的基因治疗栽体可根 据此实施方案来使用。构建此栽体的技术是本领域公知的(参见，例 如，Anderson, Nature 392:25-30,1998; Verma等，Nature 389:239-242,1998)。可利用已知的技术完成将含有多肽胰岛素促泌剂DNA的 栽体导入到目的位点。栽体可包括一或多个启动子。合适的启动子包括但不限于，逆转 录病毒LTR， SV40启动子；和人巨细胞病毒(CMV )启动子(Miller 等，Biotechniques 7 (9) :980-9卯，1989)，或任意其它的启动子(例 如，细胞启动子，诸如真核生物的细胞启动子包括但不限于组蛋白、 polIII和(-肌动蛋白启动子)。其它可被使用的病毒启动子包括但不限于腺病毒启动子、胸苷激酶(TK)启动子和B19细小病毒启动子。 合适启动子的选择对于本领域的技术人员结合此处的教导而言是显而 易见的.编码本发明多肽的核酸序列处于合适的启动子的调控下.合适的 启动子包括但不限于，启动子诸如腺病毒主要晚期启动子；或异源的 启动子诸如巨细胞病毒(CMV)启动子；呼吸道合胞病毒(RSV)启 动子；诱导型启动子诸如MMT (金属硫蛋白)启动子；热激启动子； 白蛋白启动子；ApoAI启动子；人球蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶核苷 激酶启动子诸如单纯性疱疹胸苷激醉启动子；逆转录病毒LTRs (包括 在上文描述的修饰的逆转录病毒LTRs) ; P-肌动蛋白启动子；和人 生长激素启动子。启动子也可以是天然的调控编码多肽的基因的启动 子.逆转录病毒质粒栽体可被用于传导包装细胞系而形成生产细胞 系.可被转染的包装细胞的实例包括但不限于，PE501、 PA317、 c|)-2、 (J;-AM、 PA12、 T19-14X、 VT-19-17-、少-CRE、 t|)-CRIP、 GP+E-86、 GP+envAml2和DAN细胞系如描述在Miller (Hum. Gene Ther.l:5-14，19卯)，其整体引入在此作为参考。通过本领域已知的任意方法， 栽体可传导包装细胞。这样的方法包括但不限于，电穿孔法、脂质体 的使用和CaP04沉淀。可替代地，逆转录病毒质粒栽体可被装入到脂 质体中或与脂类偶合，然后给药于宿主。生产细胞系产生传染性的包 括编码多肽的核酸序列的逆转录病毒栽体粒子。此逆转录病毒栽体粒 子然后可用于在体外或体内传导真核细胞。传导的真核细胞将表达编 码多肽的核酸序列。可被传导的真核细胞包括但不限于胚胎干细胞、 胚胎的恶性肿瘤细胞以及造血千细胞、肝细胞、成纤维细胞、成肌细 胞、角质细胞、内皮细胞和支气管的上皮细胞。与基因治疗不同的方法为"转有核细胞治疗"，其中在再导入到 患者之后在体内胞外处理患者的细胞来诱导静止的染色体基因而产生 目的蛋白。转有核细胞治疗假定个体具有激活所必需的正常的基因互 补。转有核细胞治疗涉及引入一个启动子或其它能够激活新生基因的 外源调节序列，到患者细胞的来自体内的染色体DNA中，培养物和筛 选产生活性蛋白的细胞，然后再将激活的细胞导入到患者中来意欲使 得它们变得完全地接受。"基因激活的"细胞然后持续特定的一段时间产生目的蛋白，也许持续至患者的生命之久(参见，例如，美国专利Nos. 5，641，670和5，733，761且通过引入在此作为参考).本发明也包括那些选择性地结合本发明多肽的抗体和抗体片段。 本领域已知的任意类型的抗体可利用本领域众所周知的方法来产生。 例如，抗体可被产生来特异性地结合到本发明多肽的抗原表位上。此 处使用的"抗体"包括完整的免疫球蛋白分子及其片段，诸如Fab、 F (ab，)2和Fv，其能够结合本发明多肽的抗原表位。典型地，抗原表 位的形成要求至少6、 8、 10或12个连续的氨基酸。然而，涉及非-连 续氨基酸的抗原表位可以需要更多的氨基酸，例如至少15、 25 .或50 个氨基酸。特异性地结合于本发明多肽的抗原表位的抗体可被应用在治疗以 及在免疫化学试验中，诸如Western印迹、酶联免疫吸附，放射免疫 测定，免疫组织化学测定，免疫沉淀反应，或其它的本领域已知的免 疫化学试验中。不同的免疫测定可用于鉴定具有目的特异性的抗体。 许多的竟争性结合或免疫放射测定的方案是本领域公知的.这样的免 疫测定典型地涉及免疫原和特异性地结合于该免疫原的抗体之间形成 复合物的测定。典型地，当应用免疫化学测定时，特异性地结合于本发明多肽的 抗体形成了比其它蛋白质产生的检测信号至少高5-、10-或20倍的检测 信号.优选地，在免疫化学测定中，特异性地结合于本发明多肽的抗 体没有检测到其它的蛋白质并且可从溶液中免疫沉淀本发明的多肽.本发明的多肽可被用来免疫哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、豚 鼠、猴或人，来产生多克隆的抗体。如果希望，本发明的多肽可共轭 结合于栽体蛋白，诸如牛血清清蛋白、甲状腺球蛋白和钥孔血兰素上。 取决于宿主种类，不同的助剂可用于增强免疫学的应答.这样的助剂 包括但不限于，Freund，s佐剂、矿物胶(例如，氢氧化铝)和表面活 性物质(例如，溶血卵磷脂、复合多元醇、多聚阴离子、肽油乳化液、 钥孔血兰素和二硝基苯盼)。在应用的助剂中，BCG (卡介苗)和小 棒状杆菌是特别有用的。可利用产生抗体分子的任意技术，通过在培养物中连续传代细胞 系来制备特异性地结合于本发明多肽的单克隆抗体.这些技术包括但 不限于杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术和EBV杂交瘤技术(Kohler等，Nature 256:495-97,1985; Kozbor等，J. Immunol. Methods 81:3142,1985; Cote等，Proc. Natl. Acad. Sci. 80:2026-30,1983; Cole 等，Mol. Cell Biol. 62:109-20,1984),此外，对此技术进行了改进来产生"嵌合的抗体"，可拼接小鼠抗体基因与人抗体基因来获得具有合适的抗原特异性和生物活性的分 子(Morrison等，Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-55,1984; Neuberger 等，Nature 312:604画08，1984; Takeda等，Nature 314;452誦54，1985)。单克隆及其它抗体也可被"人源化"来防止当患者被治疗时设置免疫 应答抵抗抗体。这样的抗体可充分地类似于直接在治疗中使用的人抗 体的序列或可能需要改变一些关键残基。啮齿动物抗体和人序列之间 的序列差异可通过个体残基的位点定向诱变或通过对全部互补测定区 域进行评分来置换那些不同于人序列的残基而被最小化.可选择地， 利用重组方法来产生人源化抗体(参见，例如，GB21886MB).特异 性地结合于本发明多肽的抗体可含有部分或完全人源化的抗原结合部 位，如美国专利No. 5,565,332所公开的。可选择地，利用本领域已知的方法改进单链抗体产生的技术来产 生特异性结合于本发明多肽的单链抗体。具有相关特异性的抗体，除 了具有显著独特型成的抗体外，可通过链重整由随机组合的免疫球蛋 白文库来产生(Burton, Proc. Na". Acad. Sci. 88:11120-23,1991 )'也可利用DNA扩增方法对单-链抗体进行构建，诸如PCR，利用 杂交瘤cDNA作为模板(Thirion等，Eur. J. Cancer Prev, 5:507-11,1996)。单链抗体可以是单-或双特异性的，并且可是二价的或四价 的.四价的双特异性的单链抗体被教导在，例如，Coloma & Morrison (Nat. Biotechnol. 15:159-63,1997) ' 二价的双特异性的单链抗体的构 建被教导在Mallender & Voss (J. Biol. Chem, 269:199-206,1994 )中。如下所述，利用手工的或自动的核苷酸合成来构建编码羊链抗体 的核苷酸序列，通过标准的重组DNA方法克隆到表达构建体中，并导 入到细胞中来表达编码序列。可选择地，可以直接利用例如丝状噬菌 体技术来产生单-链抗体(Verhaar等，Int. J. Cancer 61:497-501,1995; Nicholls等，J. Immunol. Meth. 165:81-91,1993 ),通过在淋巴细胞群体中活体内诱导产生，或通过筛选免疫球蛋白 文库或在文献中公开的高度特异性结合试剂的組来产生特异性结合于本发明多肽的抗体(Orlandi等，Proc. Natl, Acad. Sci. 86:38333-37，1989; Winter等，Nature 349:293-99,1991)。其它类型的抗体可被构建和治疗性地使用在本发明的方法中 例 如，嵌合抗体的构建如WO 93/03151所公开的，获自免疫球蛋白并且 其是多价的和多特异性的结合蛋白，诸如"二价的二聚抗体"也可被 制备(参见，例如WO94/13804),具有结合于本发明多肽的能力的人抗体也可由MorphoSys HuCAL⑧文库鉴定如下。本发明的多肽可被涂敷在微量滴定板上并与 MorphoSys HuCAL Fab噬菌体文库一起温育。那些不结合于本发明 多肽的噬菌体-连接的Fabs可从平板上被冲洗掉，仅留下紧紧结合于本 发明的多肽上的噬菌体。结合的噬菌体可被洗脱，例如通过改变pH植 或通过与大肠杆菌一起洗脱并通过大肠杆菌宿主的转染被扩增.这些 处理过程可重复一次或两次来富集紧紧地结合于本发明多肽上的抗体 群体.来自富集池的Fabs然后被表达，纯化，并通过ELISA测定进行 筛选。可通过本领域众所周知的方法来纯化本发明的抗体.例如，可通 过让抗体流经本发明的多肽将被结合的柱而进行亲合性纯化。可因此 利用具有高盐浓度的緩冲液从柱上洗脱结合的抗体.本发明的多肽由于具有刺激郎格罕氏岛细胞体外分泌胰岛素的能 力，并引起体内血糖的下降，可被用于治疗糖尿病，包括I型糖尿病和 II型糖尿病(非胰乌素依赖型糖尿病)两种。此治疗也可延迟糖尿病 和糖尿病并发症的发病.多肽可被用来防止具有削弱的葡萄糖耐量的 受试者发展为H型糖尿病.可在本发明方法中利用本发明的化合物治 疗或预防的其它疾病和病症包括青年人成熟期发病型糖尿病(MODY) ( Herman等，Diabetes 43:40,1994 );潜在的成人隐匿性 自身免疫糖尿病(LADA) (Zimmet等，Diabetes Med. 11:299,1994 ); 削弱的葡萄糖耐量(IGT) (Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care 22 (增刊1) :S5，1999;削弱的空腹葡 萄糖(IFG) (Charles等，Diabetes 40:796,1991 );妊娠期糖尿病(Metzger， Diabetes, 40:197,1991 );以及新陈代谢综合症X.本发明的多肽也可用于肥胖症、动脉粥样硬化疾病、高脂质血、 高胆固醇血症、低HDL水平、高血压、心血管疾病(包括动脉粥样硬化、冠心病、冠状动脉病和高血压)、脑血管疾病和外围血管疾病的治疗中；以及用于狼疮、多囊卵巢综合症、致癌作用和细胞增生、哞 喘、男性生殖问题、溃疡、睡眠陣碍、脂类和碳水化合物代谢的素乱、 生理节奏的机能障碍、生长陣碍、能量动态平衡的紊乱、包括自身免 疫疾病(例如，系统性红斑狼疮)的免疫疾病，以及急性和慢性炎症 性疾病、脓毒性休克的治疗中也是有效的.本发明的化合物也可用于治疗与生理失调相关的，例如，生产脂 类累积细胞的细胞分化、胰島素敏感性和血糖水平的调节，其涉及， 例如异常的胰腺0 -细胞功能、胰岛素分泌肿瘤和/或由于胰岛素的自身 抗体、胰乌素受体的自身抗体或自身抗体，也即刺激胰腺P-细胞的而 产生的自身免疫低血糖，导致动脉粥样硬化噬斑形成的巨噬细胞分 化、炎症性应答、致癌作用、细胞增生、脂肪细胞基因表达、脂肪细 胞分化、胰腺P-细胞量的减少、胰岛素分泌、对胰烏素的组织敏感性、 脂肪肉瘤细胞发育、多囊卵巢疾病、慢性排卵停止、雄激素过多症、 黄体嗣产生、类固醇生成、细胞中的氧化还原电势和氧化压力、氧化 氮合酶(NOS)产生、增加的Y-谷氨酰基转肽酶、过氧化氢酶、血浆 甘油三酯、HDL以及LDL胆固醇水平等.本发明的化合物也可用于本发明的方法中来治疗糖尿病的次级起 因(Expert Committee on Classification of Diabetes Mellitus， Diabetes Care22 (增刊1) :S5，1"9).这样的次级起因包括糖皮质激素过量、 生长激素过量、肾上腺髄质瘤和药物诱导的糖尿病。可诱导糖尿病 的药物包括但不限于朴鼠脲、烟酸、糖皮质激素、二苯乙内酰脲、 甲状腺激素、P-肾上腺素试刑、a-干扰素和用于治疗HIV传染病 的药物.此外，本发明的多肽可用于治疗哮喘(Bolin等，Biopolymer 37:57-66，1995;美国专利No. 5,677,419;表明多肽R3P0在松驰的豚鼠 气管平滑肌中是活化的)；血压过低诱导(VIP诱导血压过低，心动 过速，以及哞喘患者的面部潮红(Morice等，Peptides 7:279-280，1986; Morice等，Lancet 2:1225-1227,1983 );男性生殖问题(Siow等，Arch. Androl. 43 ( 1 ) :67-71，1999 );作为抗细胞程序死亡/神经保护药物 (Brenneman等，Ann. N, Y. Acad. Sci. 865:207-12,1998 );缺血期间 的心脏保护(Kalfm等，J. Pharmacol. Exp. Ther. 1268 ( 2 ) :952-8,1994;Das等,Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:297-308,1998，控制昼夜节律钟及其 关联的棄乱(Hamar等，Cell 109:497-508,2002; Shen等，Proc. Natl. Acad. Sci, 97:11575-80,2000)，最后作为抗溃疡药物(Timcel等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 865:309-22,1998 )。本发明的多肽可单独使用或与其它本领域技术人员公知的治疗和/ 或化合物组合应用于糖尿病和相关失调的治疗中.可选择地，此处描 述的方法和化合物可被部分或完全地应用于组合治疗中.本发明的多肽也可与其它已知的治疗组合共同给药用于糖尿病的 治疗，包括PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、cc-葡糖苷 酶抑制剂、胰乌素敏化剂、胰烏素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化 合物、胰乌素和抗肥胖症药物.此治疗可以是在本发明的多肽给药之 前、同时或之后给药.胰岛素包括长的和短的两种作用形式和胰乌素 的制剂.PPAR激动剂可包括任意PPAR亚基或其组合的激动刑。例 如，PPAR激动剂可包括PPAR-a、 PPAR-y、 PPAR-5或两个或三 个PPAR亚基的组合。PPAR激动剂包括，例如，rosiglitazone和 piogUtazone。磺酰脲类药物包括，例如，优降糖、格列美脲、氯磺丙 脲和格列甲溱.当与本发明的多肽一起给药时对治疗糖尿病有用的a -葡糖苦酶抑制剂包括阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖.对治疗糖尿 病有用的胰乌素敏化剂包括噻唑烷二镧和非-噱唑烷二胡。当与本发明 多肽一起给药对糖尿病治疗有用的降低肝葡萄糖排出量化合物包括二 甲双胍，诸如Glucophage和Ghic叩hage XR。当与本发明多肽一起对 治疗糖尿病有用的胰岛素促泌剂包括磺酰脲和非-磺酰脲药物GLP-1、 GIP、 分泌素、nateglinide、 meglitinide、 repaglinide、优降糖、 glim印iride、氯磺丙脲、格列曱漆。GLP-1包括具有比天然的GLP-1 更长半衰期的GLP-1的衍生物，诸如，例如，脂肪酸衍生化的GLP-1 和exendin。在本发明的一个实施方案中，本发明的多肽与胰烏素促泌剂结合使用来增强胰腺e-细胞对胰岛素促分泌素的敏感性。本发明的多肽也可与抗肥胖症药物结合用于本发明的方法中。抗 肥胖症药物包括p-3激动剂、CB-1拮抗剂、食欲抑制剂，诸如，例如， sibutramine ( Meridia )， 和脂肪酶抑制剂，诸如，例如，orlistat (Xenical)。本发明的多肽可与通常用于治疗糖尿病病人的脂类紊乱的药物结合用于本发明的方法中。此类药物包括但不限于HMG-CoA还原酶抑 制剂、烟酸、胆汁酸螯合剂和纤维酸衍生物.本发明的多肽也可与抗 高血压的药物结合使用，诸如，例如，P-阻断剂和ACE抑制剂。此种共-治疗可以以两种或多种药物(例如，本发明的化合物与胰 岛素敏化剂和抗肥胖症药物结合)的任意组合给药.此种共-治疗可以 以如上所述药物组合物的形式给药。此处使用的不同的术语定义如下a当介绍本发明或其优选的实施方案的元件时，冠词"一个""一 种""该"和"所述的"是指有一个或多个元素。术语"包含"、"包 括"和"具有"是指包括在内的，除了所列元素之外可能还有其它元素。此处使用的术语"受试者"包括哺乳动物(例如，人和动物).术语"治疗"包括提供以直接或间接地改善受试者病症为目的医 疗救护，或减緩受试者的病症或紊乱的任意方法、作用、应用、治疗 等，其中受试者包括人。术语"组合治疗"或"共-治疗"是指给药两种或多种治疗药物来 治疗糖尿病病症和/或紊乱。此种给药包括两种或多种治疗药物以大体 上同时的方式共同-给药，诸如在具有固定比率的活性成分的单个胶囊 中或在多个分离的各个抑制剂药物的胶囊中。此外，这样的给药包括 以连续的方式使用每种类型的治疗药物.术语"治疗有效的"是指每种药物的给药量，它将达到改善糖尿 病病症或紊乱严重程度的目标，而避免或最小化与所用治疗方法相关 联的不良副作用.术语"药学上可接受的，，是指受试项目适于用在药物产品中。基于公知的测定方法来测定哺乳动物中病症的治疗效果，并且比 较这些结果与用于治疗这些病症的已知药物的结果，本发明多肽的有 效剂量可容易地被测定来用于每一目的适应症的治疗。在这些病症之 一的治疗中给药活性成分(例如，多肽)的量可根据特定化合物的因 素和所使用的剂量单位、给药的方式、疗程、被治疗患者的年龄且性 别、以及治疗的病症的特性和程度而在很大程度上进行变化。给药活性成分的总量通常可在大约0.0001 mg/kg到大约200 mg/kg 的范围，并且优选地为0.01 mg/kg到大约200 mg/kg体重每天.单位剂量可包含从大约0.05 mg到大约1500毫克的活性成分，可以每天给药 一或多次。通过注射，包括静脉注射、肌内注射、皮下注射和非肠道 注射以及使用输注技术给药的每日剂量可以是从大约0.01到大约200 mg/kg。每天直肠给药方案可以是从0.01到200 mg/kg总体重'透过皮 肤起作用的浓度可被要求保持日剂量从0,01到200 mg/kg.当然，每一患者的特异性的最初和连续的给药方案依据诊断医生 确定的病症的特性和严重程度、所用特异性多肽的活性、患者的年龄、 患者的饮食、给药的时间、给药途径、药物的排泄速度、药物组合等 进行变化。本领域的技术人员可利用常规处理测试来确定所要的本发 明多肽的治疗方式和剂量.本发明多肽可以在适当配制的药物组合物中通过给药于需要的患 者而实现所希望的药理学作用。为了实现本发明的目的，患者为需要 进行特定的病症或疾病治疗的哺乳动物，包括人。因此，本发明包括 包含药学上可接受的栽体和治疗有效量的多肽的药物组合物。药学上 可接受的载体是在活性成分的有效活性的浓度对患者相对无毒和无害 的，使得栽体的任何副作用不损害活性成分的有益作用的任意栽体。 多肽的治疗有效量是对特定被治疗的病症产生效果或影响的量.此处 描述的可与药学上可接受的栽体一起给药的多肽可被利用任何有效的 常规剂量单位形式给药，包括，例如，立即释放和定时释放制刑、口 服、非肠道、局部地等等.为了用于口服，多肽可被配制到固体或液体制刑中诸如，例如， 胶囊、药丸、片剂、锭剂、糖锭、熔化物、粉末、溶液、悬浮液或乳 浊液中，并且可按照本领域公知的生产药物组合物的方法进行制备。 固体单位剂型可以是胶囊，其可以是普通的硬壳的或软壳的凝胶类型包括，例如，表面活性剂、润滑剂和惰性填料诸如乳糖、蔗糖、磷酸 钙和玉米淀粉.在另一个实施方案中，本发明的多肽可以是具有常规片剂基质诸 如乳糖、蔗糖和玉米淀粉，与粘合剂诸如金合欢胶、玉米淀粉或凝胶 结合的片剂；在给药后用于辅助片剂破裂和溶解的崩解剂诸如马铃薯 淀粉、藻酸、玉米淀粉和瓜耳豆胶；意欲提高片剂颗粒流动性和防止 片剂物质粘着到片剂塑模和压力机表面的润滑剂，例如，滑石粉、硬 脂酸或镁、钙或硬脂酸锌；色素；着色剂；和意欲增强片剂美感特性使得它们更为患者接受的增味剂，用于口服液体剂型的合适的赋形 剂，包括稀释剂诸如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇，添加或 者不添加药学上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂。不同的其它 物质可以作为涂层或修饰剂量单元的外观而存在。例如片剂、丸剂或 胶嚢可以涂有虫胶、糖或两者.
可分散性粉剂和颗粒适用于水悬浮液的制备。它们在混合物中提 供了活性成分与扩展剂或润湿剂、悬浮剂和一或多种防腐剂。合适的 分散剂或润湿剂和悬浮剂已在上文中举例说明。也可存在其它的赋形 剂，例如，那些如上所述的甜味剂、调味品和着色剂。
本发明的药物组合物也可为水包油乳化剂的形式，油相可以是有 机油，诸如液体石蜡或有机油的混合物。合适的乳化剂可以是(1)天
然存在的树胶，诸如阿拉伯树胶和黄蓍树胶，(2)天然存在的礴脂， 诸如大豆和印碑脂，(3)获自脂肪酸和己糖醇酸酐的醋或偏醋，例如， 单油酸山梨醇酐酯，和(4)所述偏酯与环氧乙烷，例如，聚环氧乙烷 单油酸山梨醇酐酯的缩合物。乳浊液也包括甜味剂和调味剂。
含油的悬浮液可以通过在植物油诸如，例如诸如，例如花生油、 橄榄油、芝麻油或椰子油中或在矿物油，诸如液体石蜡中悬浮活性成 分来配制.含油的悬浮液可包括增稠剂诸如，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸 蜡醇.悬浮液也可包括一或多种防腐剂，例如，乙基或正-丙基对鞋基 苯甲酸盐； 一或多种着色剂； 一或多种调味剂；和一或多种甜味剂诸 如蔗糖或糖精。
糖浆和酏剂可以与甜味剂诸如，例如丙三醇、丙二醇、山梨糖醇 或蔗糖一起配制.这样的制剂也可以包括緩和剂、防腐剂、调味剂和 着色剂。
本发明的多肽也可以以非肠道方式给药，也即皮下地、静脉内、 肌内注射或腹腔内，作为在生理可接受的稀释液中化合物的可注射制 剂带有一种药物栽体，其可以是无菌液体或液体诸如水、盐、含水葡 萄糖和相关糖液的混合物；醇诸如乙醇、异丙醇或十六醇；二醇诸如 丙二醇或聚乙二醇；甘醇缩酮，诸如2，2-二甲基一1，1-二氧戊环-4-甲醇， 酸诸如聚(乙二醇)400;油；脂肪酸；脂肪酸酯或甘油酯；或乙酰化 脂肪酸甘油酯，添加或者没有添加药学上可接受的表面活性剂诸如皂 或去垢剂、悬浮剂，诸如果胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素或乳化剂及其它的药物助剂。
可用于本发明的非肠道制剂的油类的实例为石油，动物的、植物 或合成来源的，例如，花生油、豆油、芝麻油、棉子油、玉米油、橄 榄油、矿脂矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合 适的脂肪酸酯为，例如油酸乙酯和十四碳烷酸异丙酯。合适的皂包括 脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，合适的洗涤剂包括阳离子的洗涤剂，
例如，二甲基二烃基铵基离化物、烷基吡啶鹵化物和烷基胺乙酸盐； 阴离子的洗涤剂，例如，烷基、芳基和烯属磺酸酯，烷基、烯烃、醚 和单酸甘油醋硫酸盐和己醋；非离子的洗涤剂，例如，脂肪胺氧化物、 脂肪酸链烷醇酰胺，和聚环氧乙烷聚丙烯共聚物；以及两性的洗涤剂， 例如，烷基-P-氨基丙酸盐和2-烷基咪唑啉季胺盐，以及混合物.
本发明的非肠道组合物典型地可包括在溶液中的按重量计从大约 0.5%到大约25%的活性成分。防腐剂和緩冲液也可被方便地使用.为 了减少或消除对注射位点的刺激，此组合物可包括一种具有从大约12 到大约17的亲水亲油平衡(HLB)非离子型表面活性剂。此制剂中的 表面活性剂的量按重量计为从大约5%到大约15%的范围。表面活性剂 可以是具有上述HLB的单一组分或可以是两种或多种具有目的HLB 的组分的混合物.
在非肠道制剂中使用的表面活性剂的实例为聚乙烯山梨糖醇酐脂 肪酸醋，例如，单油酸山梨醇酐酯和环氧乙烷与疏水性基质的髙分子 量加合物，通过环氧丙烷与丙二醇缩合来形成，
药物组合物可以是可注射的无菌的含水悬浮液的形式.此悬浮液 可以按照已知的方法配制，利用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂诸 如，例如，羧甲基纤维素钠、甲纤维素、羟丙基甲基-纤维素、海藻酸 钠、聚乙烯吡咯烷嗣、黄蓍树胶和阿拉伯树胶；分散剂或润湿剂，其 可以是天然存在的磷脂，诸如卵磷脂、烯化氧与脂肪酸的缩合物，例 如，聚环氧乙烷硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合物，例如， 十七亚乙基氧基十六碳烷醇、环氧乙烷与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏 酯的缩合物，诸如聚环氧乙烷山梨糖醇一油酸，或环氧乙烷与获自脂 肪酸和己糖醇酸酐的偏酯的缩合物，例如聚环氧乙烷单油酸山梨醇酐 酯。
无菌的注射制剂也可以是一种在无毒的非肠道可接受的稀释液或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液。可以使用的稀释剂和溶剂为，例如，
水、Ringer，s溶液和等渗的氯化钠溶液。此外，无菌不挥发油通常用作 溶剂或悬浮介质。为了实现这些目的，任何温和的、不挥发油可以被 使用，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸诸如油酸可以 使用在注射的制剂中.
本发明的组合物也可以用药物直肠给药的栓剂形式给药.这些组 合物可以通过混合药物(例如，多肽)与合适的非刺激赋形剂来制备， 其中的赋形剂在一般温度下是固体，但在直肠温度时是液体，并且因 此在直肠中融化来释放药物。此类物质是，例如，可可脂和聚乙二醇.
另一种用于本发明方法的制剂利用透过皮肤输送装置("贴")， 此种透过皮肤的贴可被用来以可控制的量提供持续的或不连续的本发 明化合物的浸入.用于输送药物的透过皮肤的贴的构建和使用是本领 域公知的(参见，例如，美国专利No, 5，023，252，引入在此作为参考). 此贴可以被构建来持续地、脉动地或在需要时输送药物.
通过机械输送装置将药物组合物输入给患者是希望的或必需的. 输送药物的机械输送装置的构建和使用是本领域公知的。例如，直接 给药药物到脑的直接技术通常涉及放置施药导管到患者的脑室系统来 绕过血脑屏陣.这样的植入输送系统，用于输送药物到身体的特异性 解剖学区域，被描述在美国专利No.5，011，472中，引入在此作为参考。
根据需要或目的，本发明的组合物可包括其它常规的药学上可接 受的配料成分，通常指栽体或稀释剂。本发明的任意组合物可通过添 加抗氧化剂，诸如抗坏血酸或通过其它合适的防腐剂来防腐.以合适 的剂型制备此类組合物的常规方法可以被使用。
通常使用的可依据给药途径配制组合物药物的组分包括酸化 剂，例如但不限于，乙酸、柠檬酸、延胡索酸、盐酸、硝酸；和碱化 剂诸如，但不限于，氨溶液、碳酸铵、二乙醇胺、单乙醇胺、氢氧化 钾、硼酸钠、碳酸钠、氬氧化钠、三羟乙基胺、三乙醇胺.
其它的药物组分包括，例如但不限于，吸附剂(例如，粉末状的 纤维素和活性炭)；气雾剂推进剂(例如，二氧化碳、CC12F2、 F2C1C-CC1F2和CaF3);空气置换剂(例如，氮气和氩气)；抗真菌 的防腐剂(例如，苯甲酸、对羟基苯甲酸丁醋、对鞋基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠)；抗菌的防腐剂(例如，杀藻铵、氯化节乙氧铵、苯甲醇、氯化十六烷吡啶、氯代丁
醇、苯酚、苯乙醇、硝酸苯汞和硫柳汞)；抗氧化剂(例如，抗坏血 酸、抗坏血酰棕榈酸酯、丁羟基大茴香醚、2，6-二叔丁基对甲苯酚、次 磷酸、单2-硫基乙醇、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、甲 搭合次硫酸氩钠、焦亚硫酸钠)；粘结材料(例如，嵌段聚合物、天 然和合成橡胶、聚丙烯酸酯、聚氨酯、硅树脂和苯乙烯-丁二烯共聚物)； 緩冲剂(例如偏磷酸钟、鳞酸二氢钾、乙酸钠、无水柠檬酸钠和柠檬 酸钠二水合物)；栽体(例如，阿拉伯胶糖浆、芳香族糖浆、芳香酰
剂、櫻桃糖浆、可可粉糖浆、橙皮糖浆、糖浆、玉米油、矿物油、花 生油、芝麻油、抑菌的氯化钠注射液和抑菌的注射用水)；螯合剂(例 如乙二胺四乙酸二钠盐和乙二胺四乙酸)；着色剂(例如，FD&CRed No. 3， FD&CRedNo. 20， FD & C Yellow No. 6， FD & C Blue No. 2 ， D&CGreenNo.5， D & C Orange No. 5， D&CRedNo.8，焦糖和氧 化铁红)；澄清剂(例如，膨润土)；乳化剂(但不限于，阿拉伯胶、 cetomacrogol、十六烷醇、单硬脂酸甘油酯、卵磷脂、单油酸山梨醇酐 酯、聚乙烯50硬脂酸酯)；包被剂(例如，凝胶和邻苯二甲酸醋酸纤 维素)；香料(例如，茴香油、肉桂油、可可粉、薄荷醇、橙油、薄 荷油和香草醛)；润湿剂(例如，甘油、丙二醇和山梨糖醇)；研磨 剂(例如，矿物油和甘油)；油类(例如，花生油、矿物油、橄榄油、 花生油、芝麻油和植物油)；软貪基质(例如，羊毛脂、亲水性软骨、 聚乙二醇油骨、矿脂、亲水性的矿脂、白色油骨、黄色油奮和玫瑰水 油奮)；穿透增强剂(透过皮肤的输送)(例如， 一羟基或多羟基醇、 饱和或不饱和的脂肪醇、饱和或不饱和的脂肪酸酯、饱和或不饱和的 二羧基的酸类、基本的油类、磷脂酰基衍生物、脑裤脂、砗烯、酰胺、 酸、酮和脲)；增塑剂(例如，邻苯二甲酸二乙酯和甘油)；溶剂(例 如，醇、玉米油、棉子油、甘油、异丙醇、矿物油、油酸、花生油、 净化水、注射用水、无菌注射水和用于冲洗的无菌水)；增稠剂(例 如，十六烷醇、十六烷基醋蜡、微晶石蜡、石蜡、十八烷醇、白蜡； 栓剂基质(例如，可可脂和聚乙二醇(混合物))；表面活性剂(例 如，杀藻铵，nonoxynoU0、 oxtoxyno19、聚山梨酸酯80、十二烷基碗 酸钠和聚山梨糖甘油一棕榈酸酯)；悬浮剂(例如，琼脂、膨润土、 carbomers、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、高吟土、甲基纤维素、黄蓍胶和veegiim );甜味剂(例 如，天冬甜素、葡萄糖、甘油、甘露糖醇、丙二醇、糖精钠、山梨糖 醇和蔗糖)；片剂防粘剂(例如，硬脂酸镁和滑石粉)；片刑粘合剂 (例如，阿拉伯胶、海藻酸、羧甲基纤维素钠、可压缩的糖、乙基纤 维素、凝胶、液体葡萄糖、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷明和预胶凝 的淀粉)；片剂和胶囊稀释剂(例如，二元的磷酸钙、高岭土、乳糖、 甘露糖醇、微晶纤维素、粉末状的纤维素，碳酸钙沉淀、碳酸钠、砩 酸钠、山梨糖醇和淀粉)；片剂包被剂(例如，液体状葡萄糖、羟乙 基纤维素、羟基丙基纤维素、羟丙基曱基纤维素、曱基纤维素、乙基 纤维素、苯二甲酸醋酸纤维素和虫胶)；片剂定向受压赋形剂(例如， 二元的裤酸钙)；片剂崩解剂(例如，海藻酸、羧甲基纤维素钙、微 晶纤维素、polacriHin potassium、海藻酸钠、淀粉乙醇酸钠和淀粉)； 片剂助流剂(例如，胶态氧化硅、玉米淀粉和滑石粉)；片剂润滑剂 (例如，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、硬脂酸和硬脂酸锌)；片剂/ 胶囊不透明剂(例如，二氧化钛)；片剂抛光刑(例如，carnubawax 和白蜡)；增稠剂(例如，蜂蜡、十六烷醇和石蜡)；渗透剂(例如， 葡萄糖和氯化钠)；增粘剂(例如，海藻酸、膨润土、 carbomers、羧 曱基纤维素钠、甲纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、海藻酸钠和黄蓍胶)； 以及润湿刑(例如，十七亚乙基氧基十六碳烷醇、卵辨脂、聚乙烯山 梨糖醇一油酸、聚环氧乙烷山梨糖醇一油酸和聚环氧乙烷硬脂酸酯)。
此处描述的多肽可以作为单一药物或与一或多种其它的药物组合 给药，其中组合用药没有产生不能接受的副作用。例如，本发明的多 肽可以与已知的抗肥胖症药或已知的抗糖尿病药或其它的指示剂等以 及其混合物和组合组合。
此处所述的多肽也可以以游离碱形式或含在组合物中应用在研究 和诊断中，或作为分析参照的标准等。因此，本发明包括由惰性栽体 和有效量的通过在此描述的方法鉴定的化合物或其盐或酯组成的组合 物。惰性栽体是不与化合物相互作用的传送和提供栽体、运送方式、 主体、示踪物质等到欲传送的化合物的任何物质。化合物的有效量是 对进行的特定方法产生效果或影响的量。
已知多肽在舍水的和无水环境中发生水解、脱酰胺作用、氧化作 用、外消旋作用和异构化，降解诸如水解、脱酰胺作用或氧化作用可通过毛细管电泳容易地检测.尽管有酶催降解，但是具有延长的血浆 半衰期或生物学驻留时间的多肽在水溶液中最少应该是稳定的.在体温时， 一天时间内显示出小于10%降解的多肽是必需的。在体温时， 一天时间内显示出小于5%降解的多肽是更优逸的。由于在慢性糖尿病 患者中的治疗寿命，大量优选的这些药物适宜于给药，此外很少通过 非肠道路径。在体温时的一周期间内的稳定性(即小于较低的降解百 分比)将允许较少地频繁给药.在冷冻温度时的在几年中的稳定性将 允许制造商提供液体制剂，因此避免重建的麻烦.另外，在有机溶剂 中的稳定性将提供把多肽配制到新的刑型诸如植入物中，制剂适于皮下注射、静脉注射、肌内注射等；合适的药物栽体； 并且用于配制和给药的技术是本领域公知的可用于制备的任意方法 (参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co" EastonPa"第20版，2000)。本发明将通过下文实施例进行进一步的说明，但其不应被理解为 以任何方式对本发明范围的限制。胶嚢配方胶嚢制剂由下述物质制备而成本发明的多肽 淀粉 硬脂酸镁10 mg 109 mg 1 mg将组分混合，通过合适的网筛，并填充到硬的胶囊中。 片剂配方片剂由下述物质制备而成:本发明的多肽微晶纤维素 胶体二氧化硅硬脂酸25 mg 200 mg 10 mg 5.0 mg47将组分混合并压缩来形成片剂。可使用合适的含水和无水涂层以 增强适口性，提高雅洁性和稳定性或延迟吸收. 无菌的静脲内注射溶液利用无菌的注射水制备本发明目的化合物的mg/mL溶液，并且如 果需要则调整pH值.将溶液用无菌的5%葡菊糖稀释用于给药，并且作为静脉内注入给药. 肌内注射悬浮液 制备下列的肌内注射悬浮液本发明的多肽 羧甲基纤维素钠TWEEN 80氯化钠苯甲醇悬浮液通过肌内注射给药. 硬壳胶囊通过用150mg乳糖、50mg的纤维素和6mg的硬脂酸镁的各种粉 末状的活性成分填充标准的上下两件的硬甘氨酸菌素胶囊来制备大量 的单位胶嚢。软胶囊制备活性成分在可吸收的油诸如豆油、棉子油或橄榄油中的混合 物并通过正置换泵注射到熔化物凝胶中来形成包含活性成分的软胶 袭。将胶囊洗涤并干燥。可将活性成分溶于聚乙二醇、甘油和山梨糖 醇的混合物来制备水溶性的医用混合物。立即释放的片剂/胶嚢这些是通过常规的和新的方法制备的固体口服剂型。这些单位被 口服而不需水以用于药物的快速溶解和输送.将活性成分混合在包含 组分诸如糖、凝胶、果胶和甜味剂的液体中。通过冷冻干燥和固态提 取技术将这些液体固化为固体片剂或锭剂。可以用粘弹性的和热弹性 的糖和聚合物或发泡组分压缩将药物化合物来产生用于快速释放而不 需水的多孔介质。50 pg/mL 5 mg/mL 4 mg/迈L 9 mg/mL 9 mg/m!v可以理解对本发明进行不脱离此处所述的本发明的精神或范围的 改变和修饰对于本领域的普通技术人员来说是显而易见的。实施例为了使本发明能够被更好地理解，下面对实施例进行了描述，这 些实施例仅仅用于解释的目的，不应被理解为以任何方式对本发明范 围进行限制.所有提及的出版物被整体引入作为参考。实施例1.肽合成方法设计本发明的多肽来提高这些肽的稳定性和延长其半衰期。特定地，这些肽的非突变形式(参见，例如，WO 01/23420,整体引入在此) 在水中和无水环境中显示出N-末端水解、脱酰胺作用以及二聚化和三 聚化。为了提高稳定性和最小化水解作用、脱酰胺作用和二聚化/三聚 化，将天冬酰胺残基(位置9和28)突变为谷氨跣胺残基。此外，位 置17处的纈氨酸、位置19处的丙氨酸、位置29处的赖氨酸、位置30 处的精氨酸、位置31处的輅氨酸也被突变。此外，如下所述，本发明 的多肽也被聚乙二醇化来延长半衰期.下列的常规方法被用于合成本发明的一些多肽通过FMOC/叔丁基策略，在连续流动条件下利用Rapp-Polymere PEG-聚苯乙彿树脂(Rapp-Polymere, Tubingen, Germany)进行肽的 合成(Pennington & Dunn, Peptide Synthesis Protocols, Volume 35,1994)。在合成完成后，从树脂裂解肽并利用TFA/DTT/H20/三异 丙基硅烷(88/5/5/2)去保护。利用冷的二乙醚从裂解的混合物中沉淀 肽.将沉淀物用冷的醚沖洗三次，然后在冷冻干燥之前溶于5%的乙 酸。通过反相色谱法在YMC-Pack ODS-AQ柱(YMC ， Inc., Wilmington, NC )上，利用具有3% TFA的水/乙腈作为从0%到100% 乙腈的梯度，和通过MALDI质谱法在VOYAGER DE (MALDI质谱 >|义，(5-2386-00型，PerSeptive BioSystems， Framingham， MA)来 校验肽。以1/1比例将肽样品被添加至基质援冲液(具有3% TFA的 50/50 (0320/乙腈)中，通过反相色错法在Waters Delta Pr印4000 HPLC 系统(Waters Corporation, Milford， MA)上纯化不满足>95%的纯度 标准的肽。实施例2,肽聚乙二醇化可通过将聚乙二醇(PEG)部分连接于肽由此降低肽被肾清除以 及减少肽的蛋白酵降解来增强肽在体内的半衰期。VPAC2受体激动剂 的应用受其非常短的体内半衰期的严重限制；然而，连接PEG部分与 肽(聚乙二醇化)延长了肽的半衰期，使其充分地允许一天一次至一 周一次的治疗.聚乙二醇化可通过本领域公知的任何方法来进行.然而，在此实 施例中，通过将唯一的半胱氨酸突变引入到肽中，然后通过肽的巯基 和曱氧基-PEG-马来酖亚胺试剂(Nektar (Inhale/Shearwater) ， San Carlos, CA)的巯基之间的稳定的硫醚键将半胱氨酸聚乙二醇化来聚 乙二醇化。优选地，在肽的C-末端导入唯一的半胱氨酸来最小化通过 聚乙二醇化导致的活性可能的减少。特定地，将两倍摩尔的过量mPEGmal(MW22kD和43kD)试剂 添加给1毫克的肽(例如，在肽的C-末端具有半胱氨酸突变的SEQ ID NO:l)并在pH6溶于反应緩冲液中(0.1M磷酸钠/0.1M NaCI/0.1M EDTA)。在室温下0.5小时后，将反应用2倍摩尔的过量DTT对 mPEG-mal进行终止反应，肽-PEG-mal反应混合物被用于阳离子交换 柱来除去残余的PEG试剂，然后通过凝胶过滤柱来除去残余的游离 肽。通过SDS-PAGE和MALDI-TOF质谱法测定聚乙二醇化位点的纯 度、质量和数目。当22kDPEG附着于本发明的舦时，有效的VPAC2 受体激活被保持.此外，VPAC2对VPAC1和PAC1的受体激活选择 性也被保留。用较小PEG(例如，线性22 kD PEG)聚乙二醇化较小 地降低肽的活性是可能的，而大的PEG (例如，分支的43kD PEG) 将更可能地降低活性。然而，较大的PEG将进一步增强血浆半衰期， 4吏得一周一次的注射是可能的(Harris等，Clin. Pharmacokinet， 40:539-551,2001 ).实施例3.肽的克隆为了重组表达这些肽，将编码肽的DNA序列在C-末端克隆到具有 分离单体的肽和GST的单因子Xa识别位点的谷胱甘肽S-转移酶 (GST),通过杂交包含BamHI或XhoI限制性酶位点的两个重叠的 单链DNA片段(70-90 mers )来合成编码融合到肽的DNA序列的因子 Xa识别位点的基因，随后克隆基因DNA序列的5'，然后通过DNA聚 合酶I (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD)的大片段DNA合成相对的链。基于设计的各肽氨基酸序列的反向翻译选择各基因的DNA序列.在一些情况下，通过对上述方法制备的基因进行PCR突变 来产生编码肽的基因(Picard等，Nucleic Acids Res 22:2587-91,1994; Sambrook等，Molecular Cloning:实验室手册，第二版，冷泉港实验 室出版社，纽约，1989).然后通过BamHI和XhoI降解双链产物并 连接到也已用Bam HI和Xho I降解的pGEX-6P-l ( Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)上。例如，为了表达作为与GST 的熔合物的SEQ ID NO:l，将设计的DNA序列(图2 )克隆到pGEX-6P-l 中。实施例4.肽的重组表达和纯化在371C培养用含质粒的GST-肽熔合物转化的BL21细胞 (Stratagene， LaJoIla, CA)直至OD綱达到0.6至1.0，然后细胞用 ImM IPTG (Life Technologies, Carlsbad, CA )在37"C温育两小时。 在7700g离心细胞(2L) 15分钟，称重，并储存在JOTC至少3小时， 将冷冻的细胞丸被重新悬浮在100 mL含有250 pL蛋白酶抑制剂混合 物(Sigma Chemical, St. Louis, MO) /克细胞的水冷PBS中，在3x 下超声处理1分钟15秒。然后在10,000 g离心细胞20分钟.将上清液 与2 mL的50%谷胱甘肽琼脂糖4B树脂(Pharmacia )混合，在4TC振 荡器上过夜。在1,500 g下离心上清液/树脂15分钟，填充到空的聚制 备性层析柱(Bio-Rad， Hercules, CA)中，用30mLPBS，然后用10 mL因子Xa緩冲液(1 mM CaC12, 100 mM NaCl，和50 mM Tris-HCl， pH8.0)冲洗。通过加入60单位的在1 mL因子Xa緩冲液中的因子Xa (Pharmacia)从柱裂解肽，在4TC温育过夜，并通过C18 HPLC (Beckman System Gold)分离，利用2 mL环和2 mL/分4中的流速进行 下列的程序IO分钟的緩冲液A (0.1%TFA/H20) ， 30分钟的緩沖液 B (0.1%TFA/ACN)的梯度，10分钟的緩冲液A， 10分钟的梯度，和 10分钟的緩冲液A。收集峰组分(每个1 mL)并通过10-20"/。 Tricine-SDS凝胶电泳筛选。收集含有闺1的肽的组分并干燥。典型的 产量为几百微克的游离肽/升大肠杆菌培养物。重组肽显示与其合成形 式具有相同的活性.实施例5.从分散的大鼠小烏细胞分泌胰岛素根据如下步骤测定由本发明的大量肽介导的分散的大鼠胰岛的胰烏素分泌.利用胶原酶降解从SD大鼠(200-250g)分离的胰岛。用胰 蛋白酶处理分散的胰烏细胞，接种到96孔V形底平板中，并进行粒状 沉淀。然后在含有或者不含有本发明肽的培养基中过夜培养.对培养 基抽气并在371C用含有3 mM葡萄糖的Krebs-Ringer-HEPES緩冲液 预培养细胞。除去预温育緩冲液，并在37TC将细胞培养在含有或者不 含肽的合适葡萄糖浓度(例如，8 mM)的Krebs-Ringer-HEPES緩冲 液中达适当的时间。在某些研究中，也包括合适浓度的GLP-l.除去 一部分上清液并通过SPA测定其胰岛素含量。结果用"对照的倍数" (FOC )来表示。在300 nM浓度时，具有SEQ ID NO:l+cys+PEG ( 43kD )的氨基酸序列的多肽使分散的胰乌细胞的胰岛素分泌增加了大约 1.7倍(附困3)。在该分析中，分散的大鼠胰乌细胞分泌的胰烏素被确定为增加了 至少1.4倍.本发明多肽的VPAC2受体激动剂组分使分散的胰烏细胞 分泌的胰岛素增加了至少1.4倍到约1.7倍 实施例6.聚乙二醇化肽对大鼠腹膜内葡萄糖耐量的作用通过对大鼠皮下给药检测本发明的聚乙二醇化肽的体内活性。给 禁食过夜的大鼠皮下注射对照或聚乙二醇化肽U-100网/kg) . 3小时 后，测定基础血糖，并对大鼠腹膜内施用2 g/kg的葡萄糖.15、 30和 60分钟后再次测定血糖。根据IPGTT (腹膜内葡萄糖耐量试验)，本 发明的代表性聚乙二醇化肽相对于介质显著地降低了血糖水平，葡萄 糖AUC减少了 17%-28% (附图4)。这表明聚乙二醇化肽具有体内延 长的降低葡萄糖的活性。本发明的聚乙二醇化肽除了具有降低葡萄糖 的活性外，它也显示出延长肽在体内的半衰期的活性。PACAP-27具有 非常短的体内半衰期(IO分钟)。在肽给药后3小时，本发明的聚乙 二醇化肽降低血糖的能力是在此时间点上在循环中存在所述肽的明显 标志并且由此相对于PACAP-27，具有延长的半衰期。实施例7, cAMP SPA将表达VPAC2肽的CHO细胞以8 x 104细胞/孔的浓度在96-孔平 板中涂板，并在37TC于aMEM、核苷、谷氨酰胺(Gibco/BRL， Rockville， MD) 、 5%FBS、 100 ( g/mL Pen/Strep， 0.4mg/mL潮霉素 和1.5mg/mL的遣传霉素(Gibco/BRL)中生长24小时。除去培养基， 并用PBS清洗平板，用肽(于10 mM Hepes， 150 mM NaCl， 5 mM KC1，2.5mMCaCl2, 1.2 mM KH2P04， 1.2 mM MgS04， 25 mM NaHC03 ( pH 7.4 ) ， 1% BSA和100 !iM IBMX )在371C温育细胞15分钟，利用cAMP SPA直接筛选分析系统(Amersham Pharmacia Biotech Inc.， Piscataway, NJ)测定细胞提取物中cAMP的量。按照试剂盒提供的 说明书确定裂解物中cAMP的量。利用Prizm软件通过非线性回归标 绘每个肽浓度产生的cAMP的量，并进行分析以确定每种肽的EC50。基于VIP设计本发明的多肽已经显示出缺少在PAC1处的活性 (Vaudry等，Pharmacol. Rev, 52:269画324，2000),因此，人们相信本 发明的多肽在PAC1处不具有明显的活性。对本发明的代表性多肽的分析结果显示于下表l中.确定为P5、 P7、 P8、 P12和P12+PEG的肽都是VPAC2受体的有效激动剂，通过 内源肽PACAP-27激活受体来实现受体激活达到100%的最高水平。此 外，确定为P5、 P7、 P8、 P12和P12+PEG的肽是选择性的VPAC2受 体拮抗剂，具有对VPAC1非常弱的拮抗剂活性.PACAP-27是VPAC1 的有效拮抗剂.表l肽SEQ ID NO.VPAC2 EC50 ( nM)VPAC1 EC50 ( nM )PACAP-27SEQ ID NO:1160.090.35P5SEQ ID NO:l0.33232.5P7SEQ ID NO:57.81>1000P8SEQ ID NO:20.19130.5P12SEQ ID NO:l+ C-末端的Cys0.38>1000P12加22 kD PEG1.32>1000P12加43 kD PEG4.19>1000实施例8.药物组合物-IV和SC制剂利用本领域公知的任一生产方法，用4mg的SEQIDNO:l的多肽 或具有4 mg多肽含量的当量的衍生的多肽和1L无菌盐水制备无菌IV 注射制剂。高浓度的多肽可用于制备SC制剂。对于确定为SEQ ID NO:l的多肽或衍生的多肽而言，将4 mg的所述多肽溶于100 mL盐水或 DMSO中，并在无菌小瓶无菌过滤后填充所述组合物. 实施例9.包括本发明肽的制剂的稳定性将实施例8描述的制剂放置于恒定稳定性小室中.定期取出样品 通过毛细管电泳进行分析，所述毛细管电泳是检测这些制剂中多肽降 解的最灵敏的方法。对多个峰面积求和，并用亲本多肽的峰区域除以 峰面积总数(附图5和6)。比值是纯度％。因为新鲜多肽中存在杂质， 通过用不同时间点的纯度除以初始纯度来将纯度改变标准化. 实施例IO.生成肽特异性抗体并通过EUSA测定肽 通过利用ABI433A肽合成仪合成本发明多肽的特异性片段而产生 本发明多肽的多克隆特异性抗体。然后从树脂裂解肽，并在Beckman System Gold的分析和并制备性的HPLC体系上进行纯化'透视MALDI质详分光光度计系统用来鉴定正确的产物，利用冷冻干燥器干燥肽。 然后将肽(2 mg)通过Cys上的游离疏基基团结合到钥孔血兰素 (KLH)上。在第0、 14、 35、 56和77天免疫雌性新西兰白兔。在第0天用250 mg肽和完全的Feund佐剂皮下注射每只兔子.随后每只兔子使用125 mg肽进行免疫，在第21天开始取血并在此后每隔21天连续取血。通 过将粗血清流过特异性肽亲和纯化柱进行抗肽抗体的纯化。通过 ELISA测定抗体滴度。用特异于本发明肽的C-末端Morphosys F ( ab )抗体包被96-孔 Immulon4HBX平板并在41C温育过夜，然后封闭平板防止非特异性结 合，然后将肽标准样品(2500 ng/mL-160 pg/mL)稀释在33%的血浆 中，并将样品以l:3稀释在緩冲液中，随后在室温下温育1.5小时.清 洗后，将特异于本发明肽的多克隆N-末端抗体在平板上温育1小时. 随后添加辣根过氣化酶(HRP)-驴抗兔抗体，并将样品和标准样品温 育1小时，用3，3，，5，5，-四甲基联苯胺(TMB)溶液温育后评估检测并 在OD4S0处读取平板(附图7 )。可以通过本领域公知的体外、离体和体内分析完成本发明多肽的 活性检测。例如，为了证明药剂对治疗糖尿病和相关紊乱，诸如X综 合症、葡萄糖耐量削弱、禁食葡萄糖减少和血胰乌素增多；动脉粥样 硬化病和相关紊乱，诸如高甘油三酯血症；以及肥胖症的效力，可以使用下列分析。测定血糖水平的方法对db/db小鼠(获自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME )放 血(通过眼或者尾静脉放血)并根据当量平均血糖水平进行分组。用 试验多肽每日口服给药(通过药用栽体用填喂法) 一次，共14天.此 时，通过眼或尾角静脉再次对动物放血并确定血糖水平。在所有情况 下，用GIucometer Elite XL ( Bayer Corporation, Elkhart, IN)测定葡萄糖水平.甘油三酯水平的测定方法对hApoAl小鼠(获自Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME ) 取血(通过眼或者尾静脉取血)并根据当量平均血清甘油三酯水平进 行分组。用试验多肽每日口服给药(通过药用栽体用填哏法) 一次， 共8天。然后经眼或尾角静脉再次对动物取血并确定血清甘油三酯的 水平。在/斤有情〗兄下,矛J用Teclmicon Axon Autoanalyzer (Bayer Corporation, Tarrytown， NY)测定甘油三酯的水平，高密度脂蛋白胆固醇含量的测定方法为了确定血浆HDL-胆固醇含量，对hApoAl小鼠取血并根据当量 平均血浆HDL-胆固醇含量进行分组。给小鼠每日口服栽体或试验多 肽，每日 一次，共7天，然后在第8天再次取血.利用Synchron Clinical System ( CX4 ) ( Beckman Coulter, Fullerton， CA)分析血浆的HDL陽 胆固醇。总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯以及葡萄糖水平的测定方法 在另一体内分析中，对肥胖猴取血，然后每日一次口服栽体或试验多肽，历时4周，然后再次取血'利用Synchron Clinical System (CX4) (Beckman Coulter, Fullerton， CA)分析血清的总胆固醇、HDL-胆固醇、甘油三酯以及葡菊糖。通过0 liver等，(Pr oc. Natl. Acad.Sci. USA 98:5306-5311,2001 )描述的核磁共振详学分析脂蛋白亚类. 对心血管参数的影响的测定方法也进行心血管参数(例如，心率以及血压)的评估。给SHR大鼠 每曰一次口服栽体或试验多肽，历时2周。利用Grinsell等，(Am.J. Hypertens. 13:370-375,2000)描述的尾-套箍方法测定血压和心率。如 Shen等(J. Pharmacol, Exp, Therap. 278:1435-1443,1996)所述监控猴的血压和心率。评估化合物对瘦弱过夜禁食的大鼠食物摄入减少(抑制食欲)的效果空腹-再喂养急性喂料分析本方案的目的是测定单剂量的未知化合物对瘦弱的过夜空腹大鼠 食物消耗的影响。空腹-再喂养大鼠模型常常用于肥胖症领域以鉴定可 能具有厌食作用的化合物.此动物模型已被成功用于鉴定和表征正在 或者已被用于控制肥胖人体重的化合物的效果分布图(参见，例如Balvet等，Gen. Pharmacol. 13:293-297,1982; Grignaschi等，Br. J, Pharmacol, 127:11卯-1194，1999; McTavish和Heel, Drug 43:713-733,1992; Rowland等，Life Sci. 36:2295-2300,1985 ),典型的研究包括平均体重约为280 g的60-80只雄性大鼠(n=10/ 试验组)，将大鼠关在控制温度和湿度以及12/12光暗循环的标准动物 房内。将大鼠单独饲养在具有网孔底板的悬挫笼中，连续给水和食物， 除非是研究空腹动物时。栽体试验基于栽体试验中大鼠的表现进行分组。在效果试验前 的2和7天之间进行栽体试验。黑暗期间(总共约16-18小时)对大鼠 过夜禁食.给动物0.5mL的去离子水，给药后1小时，将预称重的食 物瓶放回动物笼，允许大鼠进食l小时.l小时后，将洒落的物质放回 食物缸以确定消耗的食物量。将大鼠分配成组，使得1小时食物消耗 的平均值和平均值的标准误差在组之间类似.效杲试验在黑暗阶段(总共约16-18小时)将大鼠禁食过夜。用 指定剂量的多肽处理动物。给药后1小时，将预称重的食物放回笼内。 返回食物后在30、 60、 90、 180和240分钟时记录食物摄入量。测定每个时间点的食物消耗量，将洒落的物质放回食物瓶，然后对食物瓶称 重。测定每个时间点的食物消耗量.利用合适的统计分析确定处理组 之间的差异.评估化合物对肥胖Zucker fa/fa大鼠体重减少以及食物和耗水量 的效果长期喂料分析此方案的目的是测定未知化合物的长期给药对肥胖Zucker fa/fa 大鼠体重以及食物和水耗量的影响，肥胖Zuckerfa/fa大鼠常常用于测定化合物在体重减少中的效果.这个动物模型已经成功地用于鉴定和 表征正在或已经用于控制肥胖人体重的化合物效果分布图(参见，例如，Al-Barazanji等,Obes Res. 8:317-323，2000; Assimacopoulos曙Jeannet 等，Am, J, Physiol. 260( 2 Pt 2 ):R278-283，1991; Dryden等，Horm. Metab. Res. 31:363-366,1999; Edwards和Stevens, Pharmacol. Biochem. Behav. 47:865-872,1994; Grinker等，Pharmacol. Biochem. Behav. 12:265-275,1980)。典型的研究包括平均体重约550 g的60-80只雄性Zucker fa/fa (11=10/试验组)。将大鼠关在控制温度和湿度以及12/12光暗循环的 标准动物房内。连续进水和食物。将大鼠单独飼养在具有格形地面的 大的大鼠鞋盒中。在记录两天体重的基线测定值和24-小时的食物和水 耗量前，使动物适应格形地面和用研究载体模仿剂量至少4天。基于 基线上他们的体重将大鼠归于6-8个试验组中的一个.设立分组使得平均体重的平均值和平均值的标准差类似.在LD/周期的黑暗阶段前，每日通过填喂法给动物口服指定剂量的 多肽达预确定的天数(一般6-14天).在这时候测定体重、食物和水 耗量。在最后一天，通过吸入C02处死动物，并测定体重。可以通过利用这种长期的喂料分析来测定本发明的多肽对减轻或 控制体重的效果.所有上述说明书中提及的出版物和专利都在此处引作参考。对本 发明所述的组合物和方法的各种修饰和变化对本领域技术人员是显而 易见的，只要不离开本发明的范围和精神，虽然已经连同具体的优选 实施方案对本发明进行了描述，但是应该理解要求保护的所述的本发 明不应该受限于这种具体的实施方案，实际上，对于分子生物学或相 关领域技术人员而言显而易见的实施本发明的上述方案的各种修饰应 在所附的权利要求的范围之内，本领域技术人员仅仅利用常规实验就 应该认识到或能够确定本发明所述的具体实施方案的许多等价物。这 种等价物应该包括在下列权利要求中。
权利要求
1.一种选自SEQ ID NOs1至152及其功能性等价片段、衍生物和变体的多肽。
2. 编码权利要求l的多肽序列的多核苷酸或其简并变体。
3. —种含有权利要求2的多核苷酸的栽体.
4. 一种含有权利要求3的栽体的宿主细胞。
5. —种产生多肽的方法，包括a) 在适于所述多肽表达的条件下培养权利要求4的宿主细胞；和b) 从该宿主细胞培养物中回收所述的多肽-
6. —种纯化的抗体，其特异性与权利要求l的多肽结合。
7. 根据权利要求l的多肽，其中所述的多肽选自SEQIDNOs:l、 2、 3、 4和5。
8. 根据权利要求1的多肽，其中所述的多肽选自SEQ ID NOs:115、 116、 117、 118和119。
9. 一种选自SEQIDNOs:154至264的多核苷酸.
10. —种药物组合物，其包括治疗有效量的权利要求1的多肽或其 功能性等价物片段、衍生物和变体以及药学上可接受的栽体.
11. 根据权利要求10的药物组合物，其中所述的组合物包括大约 2%到大约30%的DMSO和任选的选自丙二醇、二甲基甲酰胺、碳酸 亚丙基酯、聚乙二醇和甘油三酯的溶剂。
12. 根据权利要求10的药物组合物，其中所述的多肽选自SEQID NOs:l、 2、 3、 4、 5、 115、 116、 117、 118和119。
13. —种药物组合物，其包括治疗有效量的权利要求l的多肽或其 功能性等价物片段、衍生物和变体以及药学上可接受的栽体和一或多 种药物。
14. 根据权利要求13的药物组合物，其中所述的药物选自PPAR 激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、oc-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素 敏化剂、胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰鸟素、抗 肥胖症药物、HMG辅酵A还原酶抑制剂、烟酸、胆汁酸螯合剂、纤维酸衍生物以及抗高血压的药物.
15. —种包括治疗有效量的权利要求1的多肽或其功能性等价物 片段、衍生物和变体以及与其结合的惰性栽体的组合物。
16. —种治疗糖尿病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
17. 根据权利要求16的方法，其中所述的糖尿病选自I型糖尿病、 II型糖尿病、青年人成熟期发病型糖尿病、成人隐匿性自身免疫糖尿 病以及妊娠期糖尿病.
18. —种治疗综合症X的方法，包括给需要治疗的受试者给药治 疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
19. 一种治疗与糖尿病相关的疾病的方法，包括给需要治疗的受试 者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
20. 根据权利要求19的方法，其中所述的与糖尿病-相关的疾病选 自高血糖、血胰烏素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、 血脂紊乱、高甘油三酯血症和胰岛素抗性'
21. —种治疗糖尿病的方法，包括给需要治疗的受试者给药与一或 多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤.
22. 根据权利要求21的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、 磺酰脲药物、非-磺酖脲促泌剂、a-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化刑、 胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药 物.
23. 根据权利要求22的方法，其中所述的糖尿病选自I型糖尿病、 II型糖尿病、青年人成熟期发病型糖尿病、成人隐匿性自身免疫糖尿 病以及妊娠期糖尿病.
24. —种治疗综合症X的方法，包括给需要治疗的受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
25. 根据权利要求24的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、ot-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、 胰岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药 物。
26. —种治疗与糖尿病相关的疾病的方法，包括给需要治疗的受试 者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤。
27. 根据权利要求26的方法，其中所述的与糖尿病相关的疾病选 自高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、血脂紊乱、高甘油三酯血症和胰岛素抗性。
28. 根据要求27的方法，其中所述的药物选自PPAR激动刑、磺 酰脲药物、非磺耽脲促泌剂、ot-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰 島素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰岛素和抗肥胖症药物。
29. —种治疗糖尿病、综合症X或与糖尿病相关的疾病的方法， 包括给需要治疗的受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权 利要求l的多肽的步骤，其中药物选自HMG辅酶A还原酶抑制剂、 烟酸、胆汁酸螯合剂、纤维酸衍生物和抗高血压的药物.
30. 根据权利要求29的方法，其中所述的与糖尿病相关的疾病选 自高血糖、血胰岛素增多、削弱的葡萄糖耐量、削弱的空腹葡萄糖、 血脂奮乱、高甘油三酯血症和胰岛素抗性，
31. 根据权利要求21到30中任意一项的方法，其中将权利要求l 的多肽和一种或多种药物作为单药物剂量制剂给药。
32. —种治疗或预防糖尿病的次级起因的方法，包括给需要治疗或 预防的受试者给药治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
33. 根据权利要求32的方法，其中所述的次级起因选自糖皮质激 素过量、生长激素过量、嗜铬细胞瘤和药物诱导的糖尿病。
34. —种治疗或预防糖尿病的次级起因的方法，包括给需要的治疗 或预防受试者给药与一或多种药物组合的治疗有效量的权利要求1的 多肽的步骤.
35. 根据要求34的方法，其中所述的药物选自PPAR激动剂、磺 酰脲药物、非-磺酰脲促泌剂、a-葡糖苷酶抑制剂、胰岛素敏化剂、胰 岛素促泌剂、降低肝葡萄糖排出量的化合物、胰乌素和抗肥胖症药物.
36. —种治疗呼吸道疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
37. —种治疗肥胖症的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗有 效量的权利要求l的多肽的步骤。
38. —种调节食欲的方法，包括给需要调节食欲的受试者给药治疗 有效量的权利要求l的多肽的步骤.
39. —种治疗心血管疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治 疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
40. —种治疗或预防脂质和碳水化合物代谢疾病的方法，包括给需要治疗或预防的受试者给药治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤，
41. 一种治疗睡眠障碍的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗 有效量的权利要求1的多肽的步骤.
42. —种治疗男性生殖疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药 治疗有效量的权利要求1的多肽的步骤.
43. —种治疗生长疾病或能量稳态紊乱的方法，包括给需要治疗的 受试者给药治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
44. 一种治疗免疫疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药治疗 有效量的权利要求l的多肽的步骤。
45. —种治疗自身免疫疾病的方法，包括给需要治疗的受试者给药 治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤.
46. —种治疗急性和慢性炎症性疾病的方法，包括给需要治疗的受 试者给药治疗有效量的权利要求l的多肽的步骤。
47. —种治疗脓毒性休克的方法，包括给需要治疗的受试者给药治 疗有效量的权利要求l的多肽的步骤，
48. —种通过给受试者给药权利要求1的多肽而以葡萄糖依赖性 的方式在受试者中刺激胰乌素释放的方法.
49. 一种基因治疗组合物，它包括与治疗有效量的基因治疗栽体组 合的权利要求2的多核苷酸.
50. 用于治疗和/或预防糖尿病和与糖尿病-相关的疾病的权利要求 1的多肽。
51. 含有至少一种权利要求1的多肽以及至少一种药学上可接受 的、药学上安全的栽体或赋形剂的药物。
52. 根据权利要求1的多肽在生产用于治疗和/或预防糖尿病和与 糖尿病-相关的疾病的药物中的应用.
53.用于治疗和/或预防糖尿病的权利要求51的药物.
全文摘要
本发明提供了新的在体内作为VPAC2受体激动剂的肽。这些胰岛素促分泌的多肽显示出当葡萄糖攻击时比对照更为降低体内的血糖。本发明的多肽在制剂中也是稳定的并且具有长的半衰期。该本发明的肽为具有降低的内源胰岛素分泌，尤其是II型糖尿病的患者提供了一种新的治疗方案。具体地，本发明是一种选自VPAC2相关多肽或其功能性等价物的特异性组的多肽。本发明也提供了治疗哺乳动物代谢疾病的方法，包括将治疗有效量的胰岛素促分泌肽给药于所述哺乳动物。本发明也公开了制备本发明多肽的方法，包括重组的和合成的两种。
文档编号C07K14/705GK101405298SQ03816644
公开日2009年4月8日 申请日期2003年7月11日 优先权日2002年7月12日
发明者D·N·克尔纳, J·惠兰, M·L·杜马斯, W·A·弗罗兰德, 潘晓群, 炜 王, 王有章 申请人:拜尔药品公司