专利名称：pH偏移的等电位捕集离析物的方法
技术领域：
本发明申请的领域是两性化合物的分离和浓缩。更具体地说，本发明申请涉及使用pH偏移捕集技术改变包含至少一种两性样品组份的样品组成的方法。
背景技术：
电泳技术和等电点聚焦(IEF)技术特别仍然是用于分离小的和大的、简单的和复杂的等两性组份的关键技术。IEF用于许多领域和工业中，可在分析和制备规模上进行。例如，IEF用于临床诊断、生物工艺学、药品和食品工业等，可以单独或者与其它的分析或者制备技术结合使用。
在IEF中，在pH梯度中借助于电场分离两性组份，其中pH从阳极处较低的pH值增加到阴极处较高的pH值。(关于IEF的专题论文见例如，P.G.Righetti，Isoelectric focusingtheory，methodology andapplications，Elsevier Biomedical，Amsterdam，1983，在此引入作为参考。)因为两性组份的净电荷在等电状态下为零，每当它的环境pH变成等于它的等电点(pl)值时，两性组份的电泳迁移速度就变成零。因此，具有不同pl值的两性组份在pH梯度下在不同的点停止迁移。
相对稳定的连续pH梯度可以由几种手段产生。例如，可使用载体两性电解质(在它们pl值邻近处具有足够缓冲能力和电导率的化合物)的混合物。此外，适当数量的适当的弱酸和弱碱或者弱酸和强碱或者强酸和弱碱可以体积控制方式结合为一种离子可渗透的基质，比如一种交联的聚丙烯酰胺凝胶，以形成并稳定pH梯度，其然后被用作固定不动的pH梯度IEF(IPGIEF)。(关于IPGIEF的专题论文见例如，P.G.Righetti，Immobilized pH gradientstheory and methodology，Elsevier，Amsterdam，1990，在此引入作为参考。)。
做为选择，两性样品组份还可以使用基于等电位膜的多隔室电解槽(例如，Faupel et al，U.S.5,082,548，在此引入作为参考)通过等电位捕集(IET)彼此进行分离，其中在IET分离过程结束时，得到了处于它们等电状态的两性样品组份。
发明内容
本发明申请的实施方式，使用pH偏移的等电位捕集(IET)方法，通过加入一种或多种适当的在其pl值邻近具有足够缓冲量、滴定容量和电导率的等电位缓冲剂电泳改变包含至少一种两性组份样品的初始成分，以在IET过程结束时得到其非等电状态的两性样品组份。
简要地，根据本发明申请的一种实施方法提供选择具有至少一个离子可渗透的等电位阻挡层的电泳分离体系，提供选择具有比两性样品组份pl值较低的pH值的阳极电解液，提供选择具有比两性样品组份pl值较高pH值的阴极电解液，提供具有比阳极电解液较高的和比阴极电解液pH值较低的pl值，而且与两性样品组份pl值不同的等电位缓冲液，将样品和等电位的缓冲液引入电泳体系，通过进行电泳分离捕集非等电状态的两性样品组份。
一个方面提供选择具有一种或多种分离隔室的电泳分离系统。另外的方面提供选择两个或更多离子可渗透等电位的阻挡层，所述的阻挡层的pl值不同于两性样品组份和等电位缓冲液的pl值。
另外的方面提供选择第二等电位的缓冲液，所述的缓冲液的pl值不同于两性样品组份、第一等电位缓冲液和等电位阻挡层的pl值。另外的方面提供通过进行电泳分离捕集第一两性样品组份和第二两性样品组份，所述的两性样品组份在非等电阻挡层的在两个边上都处于非等电状态。
在第一方面，本发明提供一种关于利用电泳分离两性组份的方法，该方法包括在电泳分离系统中安置含具有一定pl值两性组份的样品，所述的系统包括具有一定pH的阳极电解液和具有一定pH的阴极电解液，该阴极电解液的pH比阳极电解液pH高，布置于该阳极电解液和阴极电解液之间的一种或多种离子可渗透阻挡层，其中至少一个阻挡层是具有一定pl值的非等电阻挡层，所述的pl值比阳极电解液pH高但比阴极电解液pH低；提供一种具有一定pl值的等电位的缓冲液，所述的pl值比该阳极电解液的pH高，但比该阴极电解液的pH低，而且不同于两性样品组份的pl值，不同于离子可渗透的等电位阻挡层的pl值；及使样品置于电位下以在电泳系统中在等电缓冲液存在下收集非等电状态的两性样品组份。
优选，该电泳分离系统包括含阳极和适合于容纳该阳极电解液的阳极室，含阴极和适应于容纳阴极电解液的阴极室，布置于阳极室和阴极室之间以具有一定pl值的离子可渗透的等电位阻挡层形式的一个离子可渗透阻挡层。
优选，该电泳分离系统进一步包括布置于该阳极室和该阴极室之间的第一和第二离子可渗透阻挡层，在阳极室和阴极室之间形成第一分离隔室。
在优选的形式中，第一和第二离子可渗透阻挡层是等电位的阻挡层，每一个具有确定的但是不同的pl。
将样品提供到样品隔室、阳极室或者阴极室的至少一个中。在一个优选的形式中，将样品提供到样品隔室，在样品隔室中在非等电状态下分离两性组份。做为选择，在样品隔室、阴极室或者阳极室中得到非等电状态的两性组份。
预期样品包含两个或更多的两性组份，所述的组份在样品隔室、阴极室、阳极室、两个或更多的样品隔室、阳极室或者阴极室中以非等电状态得到。
该电泳分离系统可进一步包含布置于阳极室和阴极室之间的第三离子可渗透阻挡层，形成邻近第一分离隔室的第二分离隔室，该系统具有第一pl值的第一离子可渗透等电位阻挡层和第二pl值的第二离子可渗透等电位阻挡层，第二pl值不同于第一离子可渗透等电位阻挡层的第一pl值。
优选，所有的离子可渗透阻挡层是等电位的阻挡层，每一个具有确定的但是不同的pl。预期任一或更多的阻挡层可以是等电位的阻挡层。
在该形式中，样品可以被提供到第一样品隔室、第二样品隔室、第一和第二样品隔室、阳极室或者阴极室。在第一样品隔室、第二样品隔室、阴极室或者阳极室中得到非等电状态的两性组份。
样品包含两个或更多的两性组份，所述的两性组份在第一样品隔室、第二样品隔室、阴极室、阳极室或者第一样品隔室和第二样品隔室的每一个中以非等电状态得到。
在另外的优选形式中，该电泳分离系统包括多个布置于阳极室和阴极室之间的离子可渗透阻挡层，形成布置于阳极阴极室之间的多个分离隔室， 其中，两个或更多的离子可渗透阻挡层是离子可渗透等电位阻挡层，每一个具有不同的pl值。三个或更多的离子可渗透阻挡层可以是离子可渗透等电位阻挡层，每一个具有不同的pl值。预期所有的离子可渗透阻挡层可以是离子可渗透等电位阻挡层，每一个具有pl值。
该方法可以包括将每一个具有不同的pl值的第一等电位的缓冲液和第二等电位的缓冲液，提供到样品隔室、阳极室或者阴极室的至少两个中。
该离子可渗透阻挡层可选自任何适当的材料或者物质，比如不溶混液体、多孔质固体、非离子膜、膜、等电位的膜、水凝胶膜、凝胶和水凝胶。
本发明发明人已经发现水凝胶膜优选基于聚醚砜、基于聚(乙烯基)醇或者基于聚丙烯酰胺。预期任何其它类型的水凝胶膜可用于本发明。
优选，该非离子的膜是支撑膜比如负载在玻璃纤维、滤纸、聚合物网状物和纸上的交联聚丙烯酰胺和聚(乙烯基)醇。该离子可渗透阻挡层可以是多孔玻璃料比如玻璃粉、陶瓷的玻璃料和聚合的玻璃料。
在一个优选的形式中，该离子可渗透阻挡层可基本上限制尺寸或者水合离子半径大于预定尺寸的分子通过。
该离子可渗透等电位阻挡层优选是等电位的多孔质固体、等电位的膜和等电位的凝胶。更优选，该离子可渗透等电位阻挡层是等电位的膜。
该离子可渗透阻挡层优选防止阻挡层之间溶解物大量的对流混合。在应用中，优选隔室之间基本上没有对流混合。
将该等电位的缓冲液提供到样品隔室、阳极室和阴极室的至少一个中。优选，等电位的缓冲液的pl值与两性样品组份的pl值相差至少约0.001pH单位。pl值和与等电位的缓冲液pl值最接近的pKa值之间差的绝对值优选小于约1.5。
等电位的缓冲液是任何适当的缓冲液，其可使两性组份基本上以非等电状态获得。适当的缓冲剂包括然而并非限于亚氨基二乙酸、N-甲基亚氨基乙酰乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酰-天冬氨酸、间氨基苯甲酸、组氨酰-甘氨酸、组氨酰-组氨酸、组氨酸、1，2-二氨基丙酸、鸟氨酸、赖氨酸、lysil-赖氨酸和精氨酸。优选，该等电位的缓冲液是谷氨酸或者赖氨酸。当使用两种等电位的缓冲剂时，本发明发明人已经发现谷氨酸和赖氨酸是特别适当的。该方法可进一步包括提供非离子的增溶剂。
优选，该增溶剂是离子型去垢剂。例子包括然而并非限于吐温TM20、BrijTM30、TRITONTMX-100或NDSB-195。
该方法特别适于分离两性样品组份比如蛋白质、多肽、低聚肽、对氨基酚、氨基膦酸和氨基酸。优选，该两性样品组份是蛋白质。
本发明克服了现有技术等电分离需要组份在它的等电状态进行分离的问题，因为电泳分离更快，而且几乎没有组份溶解性的问题。
本发明进一步的优点是它可以在任何可适于等电分离的电泳分离系统中进行。该方法不需要特殊设备，导致已知的电泳分离系统更有效的利用。
在整个说明书中，除非上下文要求，否则该单词“包含〔comprise〕”或者变化比如“包括〔comprises〕”或者“包括〔comprising〕”应理解为包含声称的要素、整体或者步骤或者要素、整体或者步骤的组的内含物，然而并非排除任何其它的要素、整体或者步骤，或者要素、整体或者步骤的组。
任何讨论的已经包括在说明书中的文献、证书、材料、方法、论文等等仅为了为本发明提供背景的目的。不能作为一种承认，因为它在该申请每一个权利要求的优先权日以前存在于澳大利亚，任何或者所有的这些文件形成与本发明有关领域中的现有技术的基础或者是普通常识。
为使本发明被更清楚地理解，参考以下附图和实施例描述优选的形式。
附图简述
图1是可用来实施本发明申请实施方式的一种等电位捕集(IET)装置(现有技术)(Gradipore，澳大利亚)的示意图。
图2是表明在本发明申请分离过程开始时，显示于图1中IET装置隔室中代表性溶液的特征的示意图。
图3是利用如实施例1描述的毛细管等电聚焦分析的鸡蛋白样品的全列成像紫外线吸光率检测器记录；图4是在IET分离结束时，从显示于图1的IET装置的阴极和阳极分离隔室中除去的等分样品的全列成像紫外线吸光率检测器记录，所述的装置如实施例2描述进行操作，并用如实施例1描述的毛细管等电聚焦进行分析；图5是在IET分离结束时，从显示于图1的IET装置的阴极和阳极分离隔室中除去的等分样品的全列成像紫外线吸光率检测器记录，所述的装置如实施例3描述进行操作，并用如实施例1描述的毛细管等电聚焦进行分析；图6是在从实施例3阳极分离隔室得到样品的IET分离结束时，从显示于图1的IET装置的阴极和阳极分离隔室中除去的等分样品的全列成像紫外线吸光率检测器记录，所述的装置如实施例4描述进行操作，并用如实施例1描述的毛细管等电聚焦进行分析；
图7是在IET分离结束时，从显示于图1的IET装置的阴极和阳极分离隔室中除去的等分样品的全列成像紫外线吸光率检测器记录，所述的装置如实施例5描述进行操作，并用如实施例1描述的毛细管等电聚焦进行分析；图8是在压力调节的毛细管电泳分离过程中，在IET分离开始和结束时，从如实施例6描述操作的IET装置的分离隔室中除去的等分样品的紫外线吸光率检测器记录。
图9是在压力调节的毛细管电泳分离过程中，在IET分离开始和结束时，从如实施例7描述操作的IET装置的分离隔室中除去的等分样品的紫外线吸光率检测器记录。
图10是在八次穿过后IET分离结束时，从显示于图1的IET装置的阴极和阳极分离隔室中除去的等分样品的全列成像紫外线吸光率检测器记录，所述的装置如实施例8描述进行操作，并用如实施例1描述的毛细管等电聚焦进行分析；实施本发明的模式以下以非限制性详述方式描述本发明申请的改变具有两性样品组份的样品混合物的初始组成的实施方式。
图1指可用于实施本发明描述的实施方式的本领域已知的非等电捕集(IET)装置。在该IET分离装置(Gradipore，澳大利亚)中，阳极10位于阳极室15。阳极电解液20充满阳极室15。阳极电解液20是一种酸性溶液，例如，它是一种磷酸的水溶液(H3PO4)。当然，此外本领域已知的其它适当的酸性溶液也可使用。阳极离子可渗透阻挡层30将阳极室15和邻近的阳极分离隔室40分开。离子可渗透阻挡层30允许离子通过，但是基本上阻止阳极室15和阳极分离隔室40中内容物的对流混合。此外，离子可渗透阻挡层30通常称为离子可渗透、防对流的阻挡层或者限制膜。尽管在该实施例中阳极离子可渗透阻挡层30是一种离子可渗透、防对流的非等电位阻挡层，但它也可一种离子可渗透的、防对流的等电位的阻挡层，或者任何其它的可允许离子通过但可阻止阳极分离隔室40和阳极室15中内容物对流混合的阻挡层。离子可渗透的等电分离阻挡层50在其pl值时具有足够的缓冲和滴定容量，将阳极分离隔室40和阴极分离隔室60分开，基本上阻止隔室40和60内容物的对流混合。等电分离阻挡层50可以是一种等电位的膜、固定的等电位的凝胶、等电位的通路或者任何其它的本领域已知的在其pl值具有足够缓冲和滴定容量的等电位的阻挡层。
阴极的离子可渗透阻挡层70将阴极分离隔室60和包含阴极电解液80的阴极室85分开。阴极的离子可渗透阻挡层70允许离子通过，但是基本上阻止阴极分离隔室60和阴极室85中内容物的对流混合。此外，阴极的离子可渗透阻挡层70通常称为离子可渗透、防对流的阻挡层或者限制膜。尽管在该实施例中阴极离子可渗透阻挡层70是一种离子可渗透、防对流的非等电位阻挡层，但它也可一种离子可渗透的、防对流的等电位的阻挡层，或者任何其它的可允许离子通过但可阻止阴极分离隔室60和阴极室85中内容物对流混合的阻挡层。阴极电解液80是碱溶液，例如，它是氢氧化钠的水溶液(NaOH)。其它适当的本领域已知的碱溶液也可使用。阴极室85包含阴极90。
尽管图1仅仅是适当的IET分离装置的一个实施例，但也也可使用其它的IET分离装置构造。根据基本的IET原则选择适当的IET装置要素的标准是本领域熟知的(例如，Faupel et al.，U.S.5,082,548，在此引入作为参考)。例如，可以在阳极离子可渗透阻挡层30和阴极的离子可渗透阻挡层70之间仅使用一个分离隔室，或阳极离子可渗透阻挡层30和阴极的离子可渗透阻挡层70之间使用多于两个分离隔室。而且，阳极离子可渗透阻挡层30和阴极的离子可渗透阻挡层70可以具有相似的结构或者不同的结构。例如，它们可以是离子可渗透的、防对流的、非等电位的阻挡层，或者离子可渗透的、防对流的、等电位的阻挡层，或者任何其它的本领域已知的阻挡层，以使阻挡层30和70是离子可渗透的，但基本上防止它们分开的邻近隔室内容物的对流混合。
尽管图1显示出一种具有三种离子可渗透阻挡层的电泳装置或者系统，但本发明可以在仅具有一个分离阳极室和阴极室的等电位阻挡层的系统中进行。在该形式中，将样品和等电位的缓冲液提供到一个或多个阳极和阴极室，而且该组份在阳极和阴极室的任何一个中在非等电状态下分离。
图2是表明在本发明申请分离过程开始时，显示于图1中IET装置隔室中代表性溶液的特征的示意图。一个特征是在IET装置分离隔室中利用等电位的缓冲液，其中该等电位的缓冲液在其pl值时具有足够的缓冲和滴定容量及电导率。例如，阳极分离隔室40包含两性样品组份100和110的混合物和第一等电位的缓冲液120，其中第一等电位的缓冲液在其pl值处具有足够的缓冲和滴定容量及电导率，及阴极分离隔室60包含两性样品组份100和110的混合物和第二等电位的缓冲液130，其中第二等电位的缓冲液130在其pl值处也具有足够的缓冲和滴定容量及电导率。选择的该等电分离阻挡层50的pl值不同于第一两性样品组份100和第二两性样品组份110的pl值。例如，在图2中，选择的等电分离阻挡层50的pl值介于两性样品组份100和110的pl值之间。
选择第一和第二等电位的缓冲剂120和130的pl值不同的第一和第二两性样品组份100和110的pl值、等电分离阻挡层50的pl值，及阳极电解液20和阴极电解液80的pH值，以使在IET分离过程结束时，第一和第二两性样品组份以它们的非等电状态存在。在图2中，两性样品组份100是例如pl＝4的蛋白质，而两性样品组份110是例如pl＝6的蛋白质。等电分离阻挡层50的pl值为5，第一等电位的缓冲液120的pl值为约3.3，第二等电位的缓冲液130的pl值约为10，和阳极电解液20的pH值约为2及阴极电解液80的pl值约为12。在该实施例中，等电位的缓冲液120是20mM的谷氨酸溶液，等电位的缓冲液130是20mM的赖氨酸溶液，阳极电解液20是磷酸水溶液和阴极电解液80是氢氧化钠的水溶液。
根据众所周知的IET方案，在阳极10和阴极90之间施加电势以迫使所有的两性组份迁移进入IET装置各自的隔室中。在IET分离过程结束时，在阳极分离隔室40(即，第一两性样品组份100和等电位的缓冲液120收集在阳极分离隔室40)中收集pl值高于阳极电解液20的pH值，但低于等电分离阻挡层50的pl值的所有的两性组份，在阴极分离隔室60(即，第二两性样品组份110和等电位的缓冲液130收集在阴极分离隔室60中)收集PL值低于阴极电解液80的pH值但高于等电分离阻挡层50Pl值的所有的两性组份。然而，由于在阳极分离隔室40中存在等电位的缓冲液120，因此在IET过程结束时以其非等电状态得到第一两性样品组份100。此外，由于在阳极分离隔室60中存在等电位的缓冲液130，因此在IET过程结束时以其非等电状态得到第二两性样品组份110。
本领域实施者预期在任一时刻多于两个两性样品组份可存在于样品中。本领域实施者也预期可将第一等电位的缓冲液120和第二等电位的缓冲液130引入隔室40和/或60，彼此不同(例如，等电位的缓冲液120可以被引入阳极分离隔室40，等电位的缓冲液130可以被引入阴极的分离隔室60)，单独与样品混合(例如，等电位的缓冲液120和两性样品组份100和110的混合物被引入阳极分离隔室40，和等电位的缓冲液130和两性样品组份100和110的混合物被引入阴极的分离隔室60)，互相混合(例如，等电位的缓冲液120和130被引入阳极分离隔室40和/或60)，及彼此和样品混合(例如，等电位的缓冲液120、等电位的缓冲液130和两性样品组份100和110的被引入隔室40和/或60)。本领域的实施者进一步预期在任一时刻可能有超过两种两性样品组份、超过两种分离隔室、超过两种等电缓冲剂及超过一种等电分离阻挡层。
进一步，本领域实施者预期样品和等电位的缓冲液引入分离装置中的次序或者顺序可改变，也就是说，样品或者缓冲剂可以一起引入到该分离装置或者以任何次序。
作为非限制性实施例，具有不同pl值的几种两性样品组份的混合物可以分开进入两个部件。在该实施例中，根据本发明的应用在IET分离过程结束时，第一两性样品组份100可包含pl值低于等电分离阻挡层50pl值的两性样品组份的混合物，同时第二两性样品组份110可包含pl值高于等电分离阻挡层50pl值的两性样品组份的混合物。两性样品组份100和110可以是任何可根据等电点聚焦或者等电位捕集原理进行分离的两性样品组份。
在图2中，这样选择等电分离阻挡层50以使其pl值高于第一两性样品组份100的pl值。选择第一等电位的缓冲液120以使其pl值低于等电分离阻挡层50的pl值。尽管第一等电位的缓冲液120的pl值低于等电分离阻挡层50的pl值，但第一等电位的缓冲液120的pl值可以高于或者低于第一两性样品组份100的pl值，因为在IET分离结束时，两者将迫使第一两性样品组份100进入非等电状态。例如，在图2中，等电位的缓冲液120的pl值低于第一两性样品100的pl值。然而，等电位的缓冲液120的pl值也可高于第一两性样品组份100的pl值。
类似的，在图2中，这样选择等电分离阻挡层50以使其pl值低于第二两性样品组份100的pl值。选择第二等电位的缓冲液130以使其pl值高于等电分离阻挡层50的pl值。尽管第二等电位的缓冲液1 30的pl值高于等电分离阻挡层50的pl值，但第二等电位的缓冲液130的pl值可高于或者低于第二两性样品组份110的pl值，因为在IET分离结束时，两者将迫使第二两性样品组份110进入非等电状态。例如，在图2中，第二等电位的缓冲液130的pl值高于第二两性样品组份110的pl值。然而，等电位的缓冲液130的pl值也可低于第二两性样品组份110的pl值。
在另外的实施方式中，等电位的缓冲液120的pl值高于等电位的阻挡层50的pl值，等电位的缓冲液130的pl值低于等电位的阻挡层50的pl值。尽管等电位的缓冲液120的pl值高于等电位的阻挡层50的pl值，等电位的缓冲液120的pl值低于第二两性样品组份110的pl值。类似的，尽管等电位的缓冲液130的pl值低于等电位的阻挡层50的pl值，等电位的缓冲液130的pl值高于第一两性样品组份100的pl值。在另外的实施方式中，等电位的缓冲液120的pl值高于等电位的阻挡层50的pl值，而且高于第二两性样品组份110的pl值，等电位的缓冲液130的pl值低于等电分离阻挡层50的pl值，而且低于第一两性样品组份100的pl值。
而图2使用两种等电位的缓冲剂，仅使用一个等电位的缓冲液也可实施本发明的实施方式。例如，可以使用等电位的缓冲液120而不使用等电位的缓冲液130。类似的，可以使用等电位的缓冲液130而不使用等电位的缓冲液120。例如，当样品包含几种不同pl值的两性组份时，使用单一等电位的缓冲液是有利的。
作为仅使用一个等电位缓冲液原理的非限制性实施例，选择等电位的缓冲液120以使其具有这样的pl值要确保在IET分离结束时，等电位的缓冲液120存在于同一分离隔室中作为选择的两性样品组份(例如，第一两性样品组份100)，并使所述的样品组份处于非等电位。例如，当第一两性样品组份100的pl值高于等电分离阻挡层50的pl值时，也选择等电位的缓冲液120以所其pl值高于等电分离阻挡层50的pl值。类似的，当第一两性样品组份100的pl值低于等电分离阻挡层50的pl值时，选择等电位的缓冲液120以所其pl值低于等电分离阻挡层50的pl值。尽管等电位的缓冲液120的pl值不同于第一两性样品组份100的pl值，但等电位的缓冲液120的pl值可高于或者低于第一两性样品组份100的pl值。在一个实施方式中，选择等电位的缓冲液120以使其pl值高于第一两性样品组份100的pl值。在另外的实施方式中，选择等电位的缓冲液120以使其pl值低于第一两性样品组份100的pl值。
在另外的非限制性实施方式中，选择等电位的缓冲液120以使具有这样的pl值要确保在IET分离结束时，等电位的缓冲液120存在于不同于第一和第二两性样品组份100和110的分离隔室中。在该方式中，可以在等电分离阻挡层50的一侧得到两性样品组份，同时非电解液样品组份仍然在等电分离阻挡层50的另一侧。例如，在一个实施方式中，样品溶液包含具有不同pl值的两性样品组份100和110及非电解液样品组份115。这样选择等电分离阻挡层50的pl值以使两性样品组份100和110在IET分离过程结束时位于等电分离阻挡层的同一侧。例如，在该实施方式中，这样选择等电位阻挡层50的pl值以使其低于两性样品组份100和110两者的pl值。这样选择等电位的缓冲液120的pl值以在IET分离过程结束时，使等电位的缓冲液120位于等电分离阻挡层50的另一侧，而不是两性样品组份100和110。例如，在该实施方式中，这样选择等电位的缓冲液120的pl值以使其低于两性样品组份100和110和等电分离阻挡层50的pl值。阴极分离隔室60充满等电位的缓冲液120，而阳极分离隔室40可单独用样品溶液充满，或者充满样品溶液和等电位的缓冲液120的混合物。在IET分离过程结束时，阳极分离隔室包含非电解液样品组份115和等电位的缓冲液120，后者在阳极分离隔室40中提供足够的电导率。在IET分离过程结束时，阴极分离隔室60包含两性样品组份100和110的混合物，其在阴极分离隔室60中可提供足够的电导率。
当样品仅放入IET装置的分离隔室的其中之一时，虽然不必要，但有利的是用等电位的缓冲液120而非水装满另一个分离隔室，因为等电位的缓冲液120改进在整个IET装置中的电位分布，导致很快的IET分离。
适当的等电位缓冲剂120和130在其pl值邻近处具有足够的缓冲和滴定容量和电导率。为了使非等电缓冲液在其pl值处具有足够的缓冲量和足够的电导率，优选它的pl值和它的最接近的pKa值差小于l，优选小于0.75，更优选小于0.5。例如，适当的等电位缓冲剂包括N-甲基亚氨基乙酰乙酸、亚氨基二乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酰-天冬氨酸、间-氨基苯甲酸、组氨酰-甘氨酸、组氨酰-组氨酸、组氨酸、1，2-二氨基丙酸、鸟氨酸、赖氨酸、lysil-赖氨酸和精氨酸。本领域实施者预期其它适当的具有足够缓冲和滴定容量和电导率的等电位缓冲剂也可使用。
尽管图2说明了单一的二元分离，但其它的实施方式可实施连续的二元分离。对于每一连续的IET分离选择的等电位的缓冲剂可以相同或者不同。例如，在第一连续IET分离结束时，等电位的缓冲液120可包含第一两性样品组份100和110。如果第二连续IET分离希望的目标是第一等电位样品组份100，那么希望在等电位的缓冲液135溶液中得到，这样选择第二连续分离的等电分离阻挡层50以使其pl值处于第一和第二等电位的样品组份100和110的pl值之间，这样选择等电位的缓冲液120以使其pl值大于等电位的样品组份100和110和等电分离阻挡层50的pl值。在一个实施方式中，阳极和阴极的分离隔室40和60可以充满等电位的样品组份100和110和等电位的缓冲剂120和135的混合物。在另外的实施方式中，阳极分离隔室40可以充满等电位的缓冲液135，阴极的分离隔室60可以充满等电位的样品组份100和110和等电位的缓冲剂120和135的混合物。在另外的实施方式中，阳极分离隔室40可以充满等电位的缓冲液135，阴极的分离隔室60可以充满等电位的样品组份100和110和等电位的缓冲剂120的混合物。在另外的实施方式中，阳极分离隔室40可以充满等电位的缓冲液135，阴极的分离隔室60可以充满等电位的样品组份100和110和等电位的缓冲剂120和135的混合物。
在其它的实施方式，新鲜的等电位的缓冲液可以加入在任何连续的分离步骤中，或者等电位的缓冲液可以从早先的分离步骤继续下去。其它的实施方式在多等电位的缓冲剂存在的情况下，可同时实施多馏分分离(例如，在IsoPrimeTM装置(Amersham-PHarmacia)上进行)。
尽管等电位缓冲液的存在通常通过使其处于非等电位可提高两性样品组份的溶解性，但用于IEF系统的适当的增溶剂也可用于本发明中。例如，本领域已知的非离子的和两性离子增溶剂也可用于增加样品组份的溶解性。例如，吐温TM20、玻雷吉TM30、TRITONTMX-100(Aldrich)或者任何其它适当的非离子增溶剂也可使用。类似的，NDSB-195TM(Toronto Research Chemicals，North York，ON，Canada)或者本领域已知的任何其它适当的两性离子增溶剂可以使用。
为有助于理解本发明，本发明包括以下实施例并描述了一系列试验的结果。以下关于本发明的实施例不应解释为特别地限制本发明，或者本发明现在已知的或者随后开发的这样的变化，都在本发明描述和要求的范围内。
实施例实施例1全列紫外线吸光率成像毛细管等电聚焦分离鸡蛋白样品。
鸡蛋白，在去离子水中以1～25的比率烯释，用作包含两性组份的样品。使用在iCE280仪器上的全列紫外线吸光率成像毛细管等电聚焦(Convergent Bioscience、Toronto、Canada)分析该鸡蛋白样品。该熔融石英分离毛细管长5厘米，它的内径为75微米。
该聚焦介质包含8％载体两性电解质(Pharmalyte 3-10，Amersham-PHarmacia)，涵盖pH3-10的范围，处于0.28％的甲基纤维素水溶液中(avg.m.w.＝80,000，Aldrich)。要分析的75微升样品与150微升的聚焦介质混合。该溶液的等分试样加入到该分离毛细管中，在3,000V聚焦5分钟。1-二甲胺基萘-5-磺酰苯基丙氨酸(大约pl＝3.52)和间羟异丁肾上腺素(大约pl＝9.61)用作pl标识物。图3显示出该鸡蛋白样品的该全列紫外线吸光率成像毛细管IEF电泳图。在毛细管区域聚焦的卵清蛋白对应于像素450～650。在毛细管区域聚焦的卵铁传递蛋白对应于像素1050～1150。
实施例2利用已知的IET方法(现有技术)制备规模分离鸡蛋白样品。
为了比较本发明与已知的IET方法，使用已知的IET方法在如下所述条件下进行制备规模分离包含两性组份的样品。
在由Gradipore，Australia生产的IET装置上实现代表现有技术的分离。该IET盒(U.S.6,328,869)包含由5,000D标称取舍点的聚醚砜膜(Gelman)制造的阳极离子可渗透阻挡层30，阳极分离隔室40，Pl＝4.7的等电分离阻挡层50(Gradipore)从固定化TM电解质化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备，阴极的分离隔室60，及由5,000D标称取舍点的聚醚砜膜(格尔曼)制造的阴极离子可渗透阻挡层70。80mL的50mM磷酸溶液(大约pH＝1.8)以2L/min的流动速率循环通过阳极室15。80mL的50mM氢氧化钠溶液(大约pH＝12.4)以2L/min的流动速率循环通过阴极室85。40mL的每一个过滤的鸡蛋白溶液(含以1～25的比率用去离子水烯释的蛋白)以20mL/min的流速分别循环通过阳极和阴极的分离隔室40和60。将阳极10置于阳极室15中，将阴极90置于阴极室85中。起始的外加电势是250V，产生的电流为400mA。在鸡蛋白溶液10次流通通过该分离隔室之后，电流下降到37mA。然后将电势增加到500V，产生的电流为74mA。该分离实际在7次以上流通之后完成，完成时的电流稳定在25mA，总的分离时间为40分钟。在鸡蛋白溶液每一次流过之后，从阳极阴极的分离隔室40和60中取出等分样品，利用如实施例1描述的全列紫外线吸光率成像毛细管IEF仪器进行分析。
作为IET分离的结果，pl值低于4.7的蛋白质，比如卵清蛋白(大约pl＝4.6)，聚集在pl＝4.7等电分离阻挡层50阳极侧的阳极分离隔室40中(图4中的底框，注记为“下游”)。Pl值大于4.7的蛋白质，比如卵铁传递蛋白(大约pl＝6.1)聚集在等电分离阻挡层50阴极侧的阴极分离隔室60中(图4中的顶框，注记为“上游”)。实际所有的卵清蛋白和该较低的pl蛋白质转移进入阳极分离隔室40。在IET分离结束时肉眼观察分离盒内部显示在阳极分离隔室40中存在有沉淀的蛋白质。
实施例3利用IET分离方法制备规模分离鸡蛋白样品。
在如下所述条件及根据本发明的两种等电位的缓冲剂存在下，制备规模分离包含两性组份的样品。
在实施例2使用的IET装置上进行本发明的IET分离。该IET盒(U.S.6,328,869)包含由5,000D标称的取舍点聚醚砜膜(格尔曼)制造的阳极离子可渗透阻挡层30，阳极分离隔室40，Pl＝4.8的等电分离阻挡层50(Gradipore)，由lmmobilineTM化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备，阴极分离隔室60，和由5,000D标称的取舍点聚醚砜膜(格尔曼)制造的阴极离子可渗透阻挡层70。80mL的50mM磷酸溶液(大约pH＝1.8)以2L/min的流速循环通过阳极室15。80mL的50mM氢氧化钠溶液(大约pH＝12.4)以2L/min的流速循环通过阴极室85。40mL的每一个过滤的鸡蛋白溶液(含以1～25的稀释率，分别溶解在20mM谷氨酸和20mM赖氨酸的鸡蛋白)以20mL/min的流速分别循环通过阳极和阴极的分离隔室40和60。将阳极10置于阳极室15中，将阴极90置于阴极室85中。起始的外加电势是250V，产生的电流为480mA。该分离实际在鸡蛋白溶液10次流通过分离隔室之后完成，特征在于完成时的电流稳定在53mA，总的分离时间为25分钟。在〔鸡蛋白溶液〕每一次流过之后，从阳极阴极的分离隔室40和60中取出等分样品，利用如实施例1描述的全列紫外线吸光率成像毛细管IEF仪器进行分析。
作为本发明IET分离的结果，pl值低于4.8的蛋白质，比如卵清蛋白(大约pl＝4.6)，聚集在pl＝4.8等电分离阻挡层50阳极侧的阳极分离隔室40中(图5中的底框，注记为“下游”)。pl值大于4.8的蛋白质，比如卵铁传递蛋白(大约pl＝6.1)聚集在等电分离阻挡层50阴极侧的阴极分离隔室60中(图5中的顶框，注记为“上游”)。实际所有的卵清蛋白和该较低的pl蛋白质转移进入阳极分离隔室40。在IET分离结束时肉眼观察分离盒的内部表明，在阳极分离隔室40或者阴极分离隔室60中都没有发生蛋白质沉淀。
因此，如同在实施例2中，在实施例3中可实现同样有效的分离，但是分离需要较短的时间，需要较少量的溶液通过IET盒，尽管事实上在整个分离过程中施加的电势较低。另外，已知的IET分离的一个主要的限制，即，在它们的等电状态回收的两性样品组份的低溶解度引起它们的沉淀，被减少了。
实施例4利用IET分离方法制备规模连续二元分离鸡蛋白样品。
在如下所述条件及根据本发明的两种等电位的缓冲剂存在下，制备规模连续二元分离包含两性组份的样品，以从pl值间隔小的两性组份中得到馏分。
在该实施例中，从实施例3中阳极分离隔室40回收的样品使用IET盒(U.S.6,328,869)再一次经IET分离，所述的盒包含由5,000D标称的取舍点的聚醚砜膜(Gelman)制造的阳极离子可渗透阻挡层30，阳极分离隔室40，Pl＝4.5的等电分离阻挡层50(Gradipore)，由lmmobilineTM化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备，阴极分离隔室60，和由5,000D标称的取舍点聚醚砜膜(格尔曼)制造的阴极离子可渗透阻挡层70。80mL的50mM磷酸溶液(大约pH＝1.8)以2L/min的流速循环通过阳极室15。80mL的50mM氢氧化钠溶液(大约pH＝12.4)以2L/min的流速循环通过阴极室85。38mL从使用pl值为4.8的等电分离阻挡层50的实施例3 IET分离之后的阳极分离隔室40中回收的流体以20mL/min的流速循环通过阳极分离隔室40。因此，初始在实施例3中加入的pl＜4.8的蛋白质和谷氨酸存在于该物流中。40mL的20mM赖氨酸溶液以20mL/min的流速循环通过阴极分离隔室60。阳极10置于阳极室15中，阴极90置于阴极室85中。外加电势是250V，产生初始电流为87mA。在初步分馏的鸡蛋白溶液6次流通之后，电流稳定在68mA。在〔鸡蛋白溶液〕每一次流过之后，从阳极和阴极的分离隔室40和60中取出等分样品，利用如实施例1描述的全列紫外线吸光率成像毛细管IEF仪器进行分析。
作为连续施加第二IET分离的结果，pl值低于4.5的蛋白质残存在pl＝4.5等电分离阻挡层50的阳极侧上的阳极分离隔室40(在图6中的底框，注记为“下游的”)。pl值大于4.5的蛋白质，比如卵清蛋白(大约pl＝4.6)聚集在等电分离阻挡层50阴极侧的阴极分离隔室60中(图6中的顶框，注记为“上游”)。在阳极分离隔室40的谷氨酸和阴极分离隔室60的赖氨酸存在的辅助下，在6次流通之后卵清蛋白的移转完成约90％。值得注意的是，阴极分离隔室60不包含任何pl＜4.5的蛋白质；这些残留在阳极分离隔室40中。阳极分离隔室40包含一些残留的pl＞4.5的蛋白质。再一次，在本发明IET分离结束时，肉眼观察IET盒的内部显示在阳极分离隔室40或者阴极分离隔室60中没有蛋白质沉淀。
实施例5
利用IET分离方法制备规模分离包含两性组份的鸡蛋白样品。
在如下所述条件及根据本发明的一种等电位的缓冲剂存在下，制备规模分离包含两性组份的样品。
在实施例3和4中使用的IET装置上实现本发明的分离，该IET盒(U.S.6,328,869)包含由1,000D标称取舍点的聚丙烯酰胺膜(Gelman)制造的阳极离子可渗透阻挡层30，阳极分离隔室40，pl＝5.0的等电分离阻挡层50(Gradipore)，由lmmobilineTM化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备，阴极分离隔室60，和由1,000D标称的取舍点聚丙烯酰胺膜(格尔曼)制造的阴极离子可渗透阻挡层70。60mL的2mM乙酸溶液(大约pH＝3.9)以2L/min的流速循环通过阳极室15。60mL的15mM氢氧化钠溶液(大约pH＝10.5)以2L/min的流速循环通过阴极室85。30mL过滤的鸡蛋白溶液(含以1～25的比率用去离子水烯释的鸡蛋白)以20mL/min的流速循环通过阳极分离隔室40。30mL过滤的鸡蛋白溶液(含以1～25的比率在5mM赖氨酸溶液中烯释的鸡蛋白)以20mL/min的流速循环通过阴极分离隔室60。阳极10置于阳极室15中，阴极90置于阴极室85中。外加电势是250V，产生的初始电流为280mA。在〔鸡蛋白溶液〕每一次流过之后，从阳极和阴极的分离隔室40和60中取出等分样品，利用如实施例1描述的全列紫外线吸光率成像毛细管IEF仪器进行分析。在鸡蛋白溶液3次流通之后，IET分离几乎完成，如图7所示，需要总的分离时间为6分钟。
作为IET分离的结果，pl值低于5.0的蛋白质，比如卵清蛋白(大约pl＝4.6)，聚集在pl＝5.0等电分离阻挡层50阳极侧的阳极分离隔室40中(图7中的底框，注记为“下游”)。Pl值大于5.0的蛋白质，比如卵铁传递蛋白(大约pl＝6.1)聚集在等电分离阻挡层50阴极侧的阴极分离隔室60中(图7中的顶框，注记为“上游”)。实际所有的卵清蛋白和该较低的pl蛋白质转移进入阳极分离隔室40。
实施例6通过IET分离方法制备规模使两性样品混合物脱盐。
在如下所述条件及根据本发明的一种等电位的缓冲剂存在下，制备规模使包含两性组份的样品脱盐。
在实施例2使用的IET装置上进行本发明的除盐过程。该IET盒(U.S.6,328,869)包含由交联的聚(乙烯醇)膜(Gradipore)制造的阳极离子可渗透阻挡层30，和由交联的聚(乙烯醇)(Gradipore)膜制造的阴极离子可渗透阻挡层70。200mL的80mM磷酸溶液(大约pH＝1.6)以2L/min的流速循环通过阳极室15。200mL的400mM氢氧化钠溶液(大约pH＝13.2)以2L/min的流速循环通过阴极室85。30mL的样品溶液(初始含30mM酪胺作为两性样品组份，30mM间-氨基苯甲酸作为等电位的缓冲液，和30mM苯甲基三甲基铵对-甲苯磺酸盐作为强电解质盐)以20mL/min流速循环通过该分离隔室。阳极10置于阳极室15中，阴极90置于阴极室85中。初始，外加电势是5V，产生的电流为500mA。该循环溶液被电泳450分钟表明，两性样品组份酪胺可以非等电状态被收集在IET装置中(与等电位的缓冲液间氨基苯甲酸混合)，时间很长(7.5小时)。在450分钟时，外加电势为80V，产生的电泳电流为300mA。在整个实验过程中取自分离隔室的等分样品利用压力调节的毛细管电泳(PreMCE)进行分析，所述的方法如描述于W.A.Williams和G.Vigh的“A Fast，Accurate Mobility Determination Methodfor capillary electrophoresis capillary electrophoresis”，AnalyticalChemistry，68(1996)1174。初始样品的PreMCE紫外线吸光率检测器记录显示于图8的顶框(注记为T0min)，最后的aliquot显示于图8的底框(注记为T450min)。在该检测器记录中，注记BTA表示相当于苯甲基三甲基铵离子的峰，注记PTSA表示相当于对-甲苯磺酸盐离子的峰，注记mABA表示相当于间-氨基苯甲酸的峰，而注记NM1、NM2和NM3表明硝基甲烷的峰，在PreMCE分析中的内标物。
作为本发明IET分离结果，从包含两性组份酪胺的样品中除去强电解质盐苯甲基三甲基铵对甲苯磺酸盐。酪胺与间-氨基苯甲酸一起收集在分离隔室，处于非等电状态。因此，样品的初始成分已经被成功改变，处于非等电状态的两性样品组份被收集在IET装置中。
实施例7利用IET分离方法制备规模使鸡蛋白样品脱盐。
在如下所述条件及根据本发明的两种等电位的缓冲剂存在下，制备规模使包含两性组份的样品脱盐。
在实施例2使用的IET装置上进行本发明的除盐过程。该IET盒(U.S.6,328,869)包含由5,000D标称的取舍点聚醚砜膜(格尔曼)制造的阳极离子可渗透阻挡层30，和由5,000D标称的取舍点聚醚砜膜(Gelman)制造的阴极离子可渗透阻挡层70。200mL的50mM磷酸溶液(大约pH＝1.8)以2L/min的流速循环通过阳极室15。200mL的50mM氢氧化钠溶液(大约pH＝12.4)以2L/min的流速循环通过阴极室85。80mL过滤的鸡蛋白溶液(含鸡蛋白用作两性样品组份，按1～25的比率溶解在包含20mM谷氨酸作为第一等电位的缓冲液、20mM赖氨酸作为第二等电位的缓冲液和25mM苯甲基三甲基铵对甲苯磺酸盐作为强电解质盐的溶液中)以40mL/min的流速循环通过该分离隔室。阳极10置于阳极室15中，阴极90置于阴极室85中。初始外加电势是35V，产生的电流为500mA。如完成时电流稳定在24mA所表示，在少到55分钟，从再循环鸡蛋白溶液中除去大量的苯甲基三甲基铵对-甲苯磺酸盐。在整个实验过程中取自分离隔室的等分样品利用压力调节的毛细管电泳(PreMCE)进行分析，所述的方法如描述于W.A.Williams和G.Vigh的“A Fast，Accurate Mobility Determination Method for capillaryelectrophoresis capillary electrophoresis”，Analytical Chemistry，68(1996)1174。初始样品的PreMCE紫外线吸光率检测器记录显示于图9的顶框(注记为T0min)，最后的等分试样显示于图9的底框(注记为T55min)。在该检测器记录中，注记BTA表示相当于苯甲基三甲基铵离子的峰，注记PTSA表示相当于对-甲苯磺酸盐离子的峰，而注记NMl、NM2和NM3表明硝基甲烷的峰，在PreMCE分析中的内标物。
作为本发明IET分离结果，从样品中除去强电解质盐苯甲基三甲基铵对甲苯磺酸盐，而两性样品组份，该鸡蛋白蛋白质在它们的非等电状态被收集在分离隔室中，与赖氨酸和谷氨酸混合。因此，样品的初始成分已经被成功改变，处于非等电状态的两性样品组份被收集在IET装置中。
实施例8利用IET分离方法制备规模分离鸡蛋白样品。
在如下所述条件及根据本发明的两种等电位的缓冲剂存在下，制备规模分离包含两性组份的样品。
在实施例2使用的IET装置上进行本发明的IET分离。该IET盒(U.S.6,328,869)包含阳极离子可渗透阻挡层30，由pl＝3.0等电位的阻挡层(Gradipore)制造，所述的阻挡层(Gradipore)由ImmobilineTM化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备，阳极分离隔室40，pl＝5.0的等电分离阻挡层50(Gradipore)，由lmmobilineTM化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备，阴极分离隔室60，和阴极离子可渗透阻挡层70，由Pl＝8.2的等电分离阻挡层(Gradipore)制造，所述的阻挡层(Gradipore)由lmmobilineTM化学品(Amersham-PHarmacia)、丙烯酰胺和N-N′-亚甲基双-丙烯酰胺(Amersham-PHarmacia)制备。80mL的10mM磷酸溶液以2L/min的流速循环通过阳极室15。80mL的10mM三乙醇胺溶液以2L/min的流速循环通过阴极室85。30mL的每一个过滤的鸡蛋白溶液(含以1～25的稀释率，分别溶解在20mM谷氨酸和20mM组氨酸的鸡蛋白)以20mL/min的流速分别循环通过阳极和阴极的分离隔室40和60。将阳极10置于阳极室15中，将阴极90置于阴极室85中。初始的电泳电流设定为250mA。该分离实际在鸡蛋白溶液8次流通过分离隔室之后完成，总的分离时间为16分钟。在〔鸡蛋白溶液〕每一次流过之后，从阳极和阴极的分离隔室40和60中取出等分样品，利用如实施例1描述的全列紫外线吸光率成像毛细管IEF仪器进行分析。
作为本发明IET分离的结果，pl值低于5.0的蛋白质，比如卵清蛋白(大约pl＝4.6)，聚集在pl＝5.0等电分离阻挡层50阳极侧的阳极分离隔室40中(图10中的底框，注记为“下游”)。pl值大于5.0的蛋白质，比如卵铁传递蛋白(大约pl＝6.1)聚集在等电分离阻挡层50阴极侧的阴极分离隔室60中(图10中的顶框，注记为“上游”)。实际所有的卵清蛋白和该较低的pl蛋白质转移进入阳极分离隔室40。在IET分离结束时肉眼观察分离盒的内部表明，在阳极分离隔室40或者阴极分离隔室60中都没有发生蛋白质沉淀。
本领域的普通技术人员预期在不背离本发明精神或者范围宽的描述前提下，如特定的实施方式所示，本发明可有许多的变化和/或改变。因此，本发明实施方式被认为是在各方面作为说明性而非限制性的。
权利要求
1.一种利用电泳分离两性组份的方法，该方法包括将含pl值的两性组份的样品置于电泳分离系统中，所述的系统包括具有pH的阳极电解液和具有pH的阴极电解液，阴极电解液的pH高于阳极电解液的pH，一种或多种离子可渗透阻挡层布置于阳极电解液和阴极电解液之间，其中至少一个阻挡层是等电位的阻挡层，其pl值高于阳极电解液的pH，但低于阴极电解液的pH；提供等电位的缓冲液，其pl值高于阳极电解液的pH，但低于阴极电解液的pH，而且不同于两性样品组分的pl值和离子可渗透等电位阻挡层的pl值；和在该电泳系统中，在等电位的缓冲液存在下，将样品置于电势下以收集非等电状态的两性样品组份。
2.如权利要求1的方法，其中该电泳分离系统包括含阳极并适合于容纳阳极电解液的阳极室，含阴极和适合于容纳阴极电解液的阴极室，及布置于阳极室和阴极室之间的具有pl值的离子可渗透等电位阻挡层形式的一个离子可渗透阻挡层。
3.如权利要求2的方法，其中该电泳分离系统进一步包括布置于该阳极室和该阴极室之间的第一和第二离子可渗透阻挡层，在阳极室和阴极室之间形成第一分离隔室。
4.如权利要求3的方法，其中第一和第二离子可渗透阻挡层是每一个具有确定但不同pl的离子可渗透等电位阻挡层。
5.如权利要求3或者4的方法，其中将样品提供到样品隔室、阳极室或者阴极室的至少一个中。
6.如权利要求5的方法，其中将样品提供到样品隔室，在样品隔室中以非等电状态分离两性组份。
7.如权利要求5的方法，其中在样品隔室或者阴极室或者阳极室中以非等电状态得到两性组份。
8.如权利要求3或者4的方法，其中样品包含两个或更多的两性组份，所述的组份在样品隔室、阴极室、阳极室、两个或更多的样品隔室、阳极室或者阴极室中以非等电状态得到。
9.如权利要求3的方法，其中该电泳分离系统可进一步包含布置于阳极室和阴极室之间的另外的离子可渗透阻挡层，形成邻近第一分离隔室的第二分离隔室，该系统具有第一pl值的第一离子可渗透等电位阻挡层和具有第二pl值的第二离子可渗透等电位阻挡层，所述的第二pl值不同于第一离子可渗透等电位阻挡层的第一pl值。
10.如权利要求9的方法，其中离子可渗透阻挡层都是每一个具有确定但不同pl的等电位阻挡层。
11.如权利要求9或者10的方法，其中样品被提供到第一样品隔室、第二样品隔室、阳极室、阴极室或者第一和第二样品隔室中。
12.如权利要求11的方法，其中在第一样品隔室、第二样品隔室、阳极室或者阴极室中以非等电状态得到两性组份。
13.如权利要求9或者10的方法，其中样品包含两个或更多的两性组份，所述的两性组份在第一样品隔室、第二样品隔室、或者第一样品隔室和第二样品隔室的每一个中以非等电状态得到。
14.如权利要求2的方法，其中该电泳分离系统进一步包括多个布置于阳极室和阴极室之间的离子可渗透阻挡层，形成置于阳极和阴极室之间的多个分离隔室，其中两个或更多离子可渗透阻挡层是每一个具有不同pl值的离子可渗透等电位阻挡层。
15.如权利要求14的方法，其中三种或更多的离子可渗透阻挡层的每一个是具有不同pl值的离子可渗透等电位阻挡层。
16.如权利要求14的方法，其中所有的离子可渗透阻挡层每一个都是具有不同pl值的离子可渗透等电位阻挡层。
17.如权利要求9～16任一权利要求的方法，其中第一等电位的缓冲液和第二等电位的缓冲液每一个具有不同的pl值，提供到样品隔室、阳极室或者阴极室的至少两个中。
18.如权利要求1～17任一权利要求的方法，其中该离子可渗透阻挡层选自不溶混液体、多孔质固体、非离子膜、膜、等电位膜、水凝胶膜、凝胶和水凝胶。
19.如权利要求18的方法，其中该水凝胶膜是基于聚醚砜、基于聚(乙烯基)醇或者基于聚丙烯酰胺的膜。
20.如权利要求18的方法，其中非离子膜是支撑膜，选自负载于玻璃纤维、滤纸、聚合的网状物和纸上的交联的聚丙烯酰胺和聚(乙烯基)醇。
21.如权利要求18的方法，其中该离子可渗透阻挡层是多孔玻璃料，选自玻璃粉、陶瓷玻璃料和聚合玻璃料。
22.如权利要求18～21任一权利要求的方法，其中该离子可渗透阻挡层基本上限制尺寸或者水合离子半径大于预定尺寸的分子通过。
23.如权利要求1～17任一权利要求的方法，其中该离子可渗透等电位阻挡层选自等电位多孔质固体、等电位膜和等电位凝胶。
24.如权利要求23的方法，其中该离子可渗透等电位阻挡层是等电位的膜。
25.如权利要求1～24任一权利要求的方法，其中隔室之间基本上没有对流混合。
26.如权利要求1～25任一权利要求的方法，其中将等电位的缓冲液提供到样品隔室、阳极室和阴极室的至少一个中。
27.如权利要求26的方法，其中等电位缓冲液的pl值与两性样品组份pl值相差至少0.001pH单位。
28.如权利要求1～27任一权利要求的方法，其中pl值和与等电位缓冲液pl值最接近的pKa值差的绝对值小于约1.5。
29.如权利要求1～28任一权利要求的方法，其中该等电位缓冲液选自亚氨基二乙酸、N-甲基亚氨基乙酰乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酰-天冬氨酸、间-氨基苯甲酸、组氨酰-甘氨酸、组氨酰-组氨酸、组氨酸、1，2-二氨基丙酸、鸟氨酸、赖氨酸、lysil-赖氨酸和精氨酸。
30.如权利要求29的方法，其中该等电位的缓冲液是谷氨酸或者赖氨酸。
31.如权利要求17方法，其中第一等电位的缓冲液是谷氨酸，第二等电位的缓冲液是赖氨酸。
32.如权利要求1～31任一权利要求的方法，进一步包括提供非离子的增溶剂。
33.如权利要求32的方法，其中该增溶剂是非离子型去垢剂。
34.如权利要求1～33任一权利要求的方法，其中两性样品组份选自蛋白质、多肽、低聚肽、氨基酚、氨基膦酸和氨基酸。
35.如权利要求35的方法，其中该两性样品组份是蛋白质。
全文摘要
提供一种利用电泳分离两性组分的方法，该方法包括将含pl值的两性组分的样品置于电泳分离系统中，所述的系统包括具有pH的阳极电解液、具有pH的阴极电解液，阴极电解液的pH高于阳极电解液的pH，布置于阳极电解液和阴极电解液之间的一种或多种离子可渗透阻挡层，其中至少一个阻挡层是等电位的阻挡层，其pl值高于阳极电解液pH，但低于阴极电解液pH；提供等电位的缓冲液，其pl值高于阳极电解液的pH，但低于阴极电解液pH，不同于两性样品组分的pl值，也不同于离子可渗透等电位阻挡层的pl值；和在该电泳系统中，在等电位的缓冲液存在下，将样品置于电势下以收集非等电状态的两性样品组分。
文档编号C07K1/26GK1668367SQ03816652
公开日2005年9月14日 申请日期2003年6月3日 优先权日2002年6月5日
发明者久洛·维格 申请人:得克萨斯A&M大学体系