专利名称：siRNA脂质体的制备的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂领域，涉及在制备siRNA脂质体过程中首先 siRNA与鱼精蛋白结合形成复合物，具体涉及siRNA与鱼精蛋白按一定 的比例结合后再制备成脂质体。提供了一种能够稳定、高效包裹核酸的 脂质体。
技术背景RNA干扰(RNAi)是指双链RNA(dsRNA)导入细胞后诱导耙mRNA发生特异性的降解，导致基因沉默的现象。又称为转录后基因沉默 (PTGS)，是生物长期进化过程中对病毒、转录因子和其他转移核酸等 外源物质的防御系统。RNAi具有一些重要特征(1) RNAi属于转录后水平的基因沉默 (PTGS)机制，(2)具有高度的序列特异性;.(3)具有抑制基因表达的 高效性；(4) RNAi效应可以在不同的细胞间长距离传递和维持。RNA干扰技术2002年被Science杂志评为年度十大科技成就之首， Nature杂志亦将siRNA评为年度重大科技成果之一。Bosher认为RNAi 现象的研究可能是未来IO年生物学领域中最激动人心，也最有可能产生 丰富成果的领域之一。RNA研究的突破性进展，是生物医学领域近20 年来，可与人类基因组计划相提并论的最重大成果之一。1998年Frie发现RNAi现象后，很快科研人员开始用双链RNA作为 抑制目的基因表达的试剂。典型的RNAi技术相对于反义技术有着特别的 优势，它基本上对任何mRNA系列的作用都有着非常高的成功率。目前， RNA干扰的研究大多集中在丙型肝炎、爱滋病、流行性感冒、肿瘤等疾病的研究。目前，限制siRNA(小干扰核糖核酸)临床应用的问题是如何把siRNA 运输到体内。由于siRNA在体内易于降解，裸露的siRNA在体内未到达 靶细胞发挥作用以前已经降解。人们采用了化学修饰的siRNA和阳离子 型脂质体(在脂质体中加入DC-胆固醇或十八垸胺等)以及多聚赖氨酸 脂质体复合物的方法。由于阳离子型脂质体和多聚赖氨酸脂质体复合物 细胞毒性大，很难应用到临床。本发明采用临床上应用多年的鱼精蛋白 作为与siRNA的结合物，制备siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体，提高了脂 质体的稳定性和包封率，降低了细胞毒性。 本发明的公开内容本发明的目的是为了提高siRNA在脂质体中的稳定性和包封率，为 siRNA进入细胞和在体内的运输至耙细胞提供一个手段，进而为siRNA的 实验研究和临床应用创造条件。本发明siRNA脂质体的原辅料包含磷脂、胆固醇、siRNA、鱼精蛋白、 保护剂。磷脂是指天然磷脂、合成磷脂、氢化磷脂。胆固醇是指药用级胆 固醇。siRNA是指化学合成的siRNA、修饰的siRNA、通过Dicer酶降解 生产的siRNA。鱼精蛋白是指可以临床应用的药用级鱼精蛋白。保护剂是 指糖类(麦芽糖、蔗糖、葡萄糖等)、醇(甘露醇、山梨醇等)、蛋白类(白 蛋白等)。另外，为了脂质体的稳定和防止磷脂氧化还可加入适量的吐温， 维生素E，维生素C。本发明首先将siRNA与鱼精蛋白制成混合溶液作为被包封物，使用本 领域技术人员所熟知的脂质体制备方法(如薄膜分散法、逆相蒸发法、注 入法、熔融法等)制备siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体。本发明通过下列步骤来描述siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体的制备1、 siRNA与鱼精蛋白结合成为被包封物，将siRNA溶液与鱼精蛋白按照一定比例混合，其中SiRNA与鱼精蛋白的质量比为1: 0.1至l: 10。
2、 使用本领域技术人员所熟知的脂质体制备方法制成siRNA脂质体。
siRNA是强极性物质，带有大量负电荷，极易溶于水，制成普通的脂 质体，通常包封率很低，大约在30%左右；阳离子脂质体虽然在包埋siRNA 的效果非常好，但是由于阳离子脂质体的细胞毒性，限制了它的临床应用。 本发明制备的siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体提高了 siRNA包埋的效率， 包封率达到80%以上，并且增强了 siRNA的稳定性，由于使用的都是中国 国家食品药品监督管理局批准的药用辅料，大大降低了细胞毒性和体内副 作用，为临床应用创造了条件。
应用实例
下列实施例用于进一步说明本发明，并不意味着对本发明有任何限制。
实施例l:
取siRNA500 g，鱼精蛋白lmg，溶于5ml水中形成混合溶液。
取磷脂0.15g，胆固醇0.015g，吐温-80 0.015g， VE 0.0025g溶于 5ml无水乙醇中制成脂质溶液。
将上述脂质溶液加入到圆底烧瓶中，在30-4(TC恒温水浴中旋转减压蒸 发，去除有机溶剂，形成脂膜。将siRNA-鱼精蛋白混合溶液注入上述烧瓶 中，水合形成siRNA-脂质体。
siRNA复合物脂质体经粒度分析仪检测，平均粒径为200nm，离子交 换法测定包封率为82.1%。
实施例2:取siRNA500iig，鱼精蛋白lmg，溶于5ml水中形成混合溶液。 取磷脂0.15g，胆固醇0.015g，吐温-80 0.015g， VE 0.0025g溶于5ml无水乙醇中制成脂质溶液。使用蠕动泵将上述两种溶液按等速等比混合，将混合后的溶液加入圆 底烧瓶中，在30-4(TC恒温水浴中减压蒸发，去除有机溶剂，形成siRNA复合物脂质体。siRNA脂质体经粒度分析仪检测，平均粒径为280mn，离子交换法测 定包封率为81.6%。
权利要求
1、一种siRNA脂质体，它主要特征是含有磷脂、胆固醇、siRNA、鱼精蛋白。
2、 权利要求1的磷脂是指天然磷脂、合成磷脂、氢化磷脂。
3、 权利要求1的siRNA是指化学合成的siRNA、修饰的siRNA、通过Dicer 酶降解生产的siRNA。
4、 一种制备siRNA脂质体的方法，其特征在于siRNA首先与鱼精蛋白结 合形成复合物。
5、 权利要求4的方法中，siRNA与鱼精蛋白的质量比为1: 0.1 1: 10。
6、 权利要求5中，siRNA与鱼精蛋白的质量比优选的比例是1: 1 1: 2。
7、 权利要求4的方法中，磷脂与胆固醇的比例l: 1 10: 1。
8、 权利要求7的方法中，磷脂与胆固醇的优选的比例8: 1 10: 1。
9、 权利要求4的方法中，磷脂与siRNA的比例为20: 1 500: 1。
10、 权利要求9的方法中，磷脂与siRNA的优选的比例为70: 1 200: 1。
全文摘要
小干扰核糖核酸(siRNA)是一种亲水性物质，一般制备成阳离子脂质体而应用，本发明通过siRNA与鱼精蛋白结合复合物，作为被包封物，利用本领域技术人员熟知得脂质体制备方法得到了稳定的siRNA-鱼精蛋白复合物脂质体，脂质体的粒径在200～300nm左右，包封率达80％以上。
文档编号A61P31/00GK101332185SQ20071007241
公开日2008年12月31日 申请日期2007年6月28日 优先权日2007年6月28日
发明者宇 丁, 淼 于, 冷国庆, 恒 刘, 岩 徐, 李会成, 李郑武, 晴 王 申请人:哈药集团生物工程有限公司