专利名称：包含脂质体包胶的寡核苷酸和表位的免疫刺激性组合物的制作方法
包含脂质体包胶的寡核苷酸和表位的免疫刺激性组合物发明背景发明领域本发明涉及包含脂质体包胶的寡核苷酸和表位的免疫刺激性组合物。相关技术描述对基于表位的肽类疫苗已进行了大规模研究，通过它们与作为B-细胞表位和 T-细胞表位的B细胞受体(BCR)和MHC的结合能力，这些疫苗对于诱导和调节免疫应答以防止传染性和恶性疾病来说是至关重要的(1-3)。化学失活的疫苗被广泛用于临床，但是这些疫苗具有缺点，例如病毒重新激活的风险、用于维持疫苗稳定性的成本、引起自体免疫疾病以及某些疫苗中不支持足够的保护作用(1，3，4)。为了克服这些缺点，最近30年中开发了合成肽类，通过使用被设计用于刺激特定淋巴细胞亚群的表位来操控免疫应答，以引起选择性的B-和T-细胞瘾大。因此，肽类疫苗作为用于抗癌疫苗(5，6)和传染病例如流感病毒(3)、疟疾(7)、乙型肝炎(8)和HIV(9)的潜在有用的预防和治疗方法，受到关注。尽管肽类疫苗在各种动物模型中被活跃地研究，但它们的功效仅限于治疗人类。为了提高肽类疫苗的效能，评估了将脂质体用于疫苗递送(10)，并使用佐剂例如鞭毛(11)和CpG-DNA(12) 进行配制以增加免疫应答的强度。在开发增强细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的疫苗中，对脂质体作为递送介质以进行了大规模评估(10，13)。包胶的脂质体能够针对环境提供保护并递送到靶细胞。PH敏感性脂质体例如磷脂酰-β -油酰-Y -棕榈酰乙醇胺(DOPE，二油酰磷脂酰乙醇胺)/胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)的特征在于在低pH(5. 0)下将内含物释放到胞质溶胶中并发生脂类掺混(14)。研究人员已显示，pH敏感性脂质体提高了抗原向胞质溶胶的递送和CTL应答的诱导(15)。此外，在用包胶在pH敏感性脂质体中的从汉坦病毒核衣壳蛋白(M6)或人乳头状瘤病毒E7合成的CTL表位免疫的小鼠中，报道了有效的抗原特异性CTL应答(16)。为了增加抗原被巨噬细胞和树突状细胞的摄取，使用阳离子型脂质体作为递送介质。通过包胶的阳离子型脂质体例如 lipofectamine、DC-Choi, DC-Chol/DOPE, EPC/SA/C 等，增强了 CTL 应答和抗体生产(10)。尽管脂质体是用于将抗原递送至APC的强有力载体，但仍对其进行了调查以增强免疫原性和佐剂活性。CpG-DNA与其他免疫刺激剂例如鞭毛、脂A、细胞因子等相比，作为用于免疫佐剂的潜在有用的治疗形式，其免疫刺激活性受到关注(17，18)。几项调查显示， CpG-DNA上调抗原呈递细胞活性、Thl免疫应答、免疫球蛋白(Ig)同种型转换(19-21)。通过用脂质体包胶CpG-DNA，增强了作为强有力佐剂的免疫刺激活性。Suzuki等显示，包胶在阳离子型脂质体中的CpG-DNA诱导了 IL-12和IFN-γ的表达，并且共包胶有卵清蛋白(OVA) 的CpG-DNA-脂质体引起OVA特异性CTL的诱导，其表现出对抗表达OVA的肿瘤的强细胞毒性02)。此外，SSCL增加了被B细胞、树突状细胞和巨噬细胞的摄取，并且CpG-DNA与OVA 的共包胶增加了抗原特异性IFN-Y和IgG生产0；3)。此外，Li等的调查显示，共包胶在 DSPC/Chol脂质体中的CpG-DNA和HER-2/neu衍生肽增强了 CTL应答和IgG生产Q4)。
硫代磷酸酯改性的CpG-DNA(PS-DNA)已被用于临床应用(25)，所述改性用硫取代骨架中非桥接的氧，为其提供了核酸酶抗性和向细胞中的高效摄入。然而，几项研究指出， PS-DNA引起骨架相关的副作用，例如暂时性脾肿大、淋巴滤泡破坏和关节炎06- )。因此，调查人员开发了磷酸二酯键CpG-DNA(PO-DNA)的天然对应物以诱导没有严重副作用的最优先天免疫应答。与PS-DNA相反，在人类细胞中没有观察到PO-DNA的效应。然而，报道了在用包胶在脂质体(DOTAP，lipofectin)中的PO-DNA和非CpG-DNA刺激的人类细胞中， 诱导了有效的免疫应答09，30)。在以前的研究中，我们通过牛分枝杆菌(M.bovis)基因组DNA的计算机辅助分析鉴定了天然磷酸二酯键CpG-DNA(PO-DNA)，并筛选到具有免疫刺激活性的牛分枝杆菌基因组DNA序列(31)。我们的实验分析证实了含有CpG基序的有效PO-DNAjPMB-ODN 4531 (0)， 具有作为强有力佐剂诱导抗原驱动的Thl应答而没有严重副作用的功能效应(31，32)。在本研究中，我们比较了包胶在几种脂质体中的PO-DNA(MB-0DN 4531(0))在人类和小鼠细胞中刺激免疫应答的能力。此外，我们显示，包胶在D0PE/CHEMS脂质体中的PO-DNA (MB-0DN 4531(0))和几种肽显著增加了肽特异性IgG生产。这些结果表明，通过用D0PE/CHEMS脂质体递送以及使用MB-ODN 4531(0)的佐剂效应，增进了肽疫苗的效能，其可以被迅捷地用于传染病大流行、治疗性抗体的开发和暴露于生物恐怖主义药剂的应用中。在整个本申请中参考了各种出版物和专利，其引用被提供在括号中。为了充分描述本发明以及本发明所属技术领域的现状，在此将这些出版物和专利的公开内容以其全文引为本申请的参考。发明概述本发明人进行了深入研究，以开发能够预防和治疗各种癌症和传染病的新的免疫佐剂。结果，他们鉴定到了蛋白抗原的肽表位，并发现将所述表位和寡核苷酸包胶在具有特定组成的脂质体中提供了极大增强的免疫刺激活性。因此，本发明的目的是提供用于增强免疫应答的组合物。本发明的另一个目的是提供用于具有免疫原性的表位的筛选方法。本发明的另一个目的是提供用于针对蛋白抗原的抗体的筛选方法。本发明的另一个目的是提供针对蛋白抗原的抗体的制备方法。本发明的另一个目的是提供对抗甲型流感病毒、癌症、丙肝病毒或RSV(呼吸道合胞病毒)的肽类疫苗组合物。从下面的详细描述以及随附的权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将变
得明显。附图简述图Ia-Ic显示了用脂质体(DOPE CHEMS(1 1))和HEL(鸡卵溶菌酶)复合物腹膜内免疫的BALB/c小鼠的体液应答。以10日的时间间隔三次注射HEL-MB-ODN 4531(0)-脂质体复合物。然后分析IgG(图la)、Ig Gl (图lb)和Ig G2a(图lc)的生产，以证实总IgG的生产和与Thl免疫应答相关的IgGh的生产增加。我们将包胶在DOPE CHEMS 复合物中的 MB-ODN 4531 (0)定义为 Lipoplex(O)。图显示了考虑到亲水性、疏水性、二级结构、抗原性和两亲性，从甲型禽流感(H5N1)/Vietnam/2004毒株的HA(血细胞凝集素)选择用于制备肽-PO-DNA(MB-0DN4531 (0))_脂质体复合物的表位。将所选的10个候选表位(hH5m HA58、 hH5Nl HA113、hH5Nl HA233、hH5Nl HA336、hH5Nl HA363、hH5Nl HA370、hH5Nl HA377、hH5Nl HA384,hH5Nl HA387 禾Π hH5Nl HA394)制备成肽-PO-DNA (MB-0DN4531 (0))-脂质体复合物， 然后三次腹膜内给药于BALB/c小鼠，并收集血清。作为分析IgG量的结果，证实了每种肽特异性总IgG的量(图2a)和每种肽特异性总IgG的滴度(图2d)以及与Thl免疫应答相关的IgGh的生产(图2c)增加了。此外，我们还检查到在二次和三次应答中产生了更大量的 hH5m HA370 肽特异性 IgG(IgG2a)(图加)。A/Vietnam/1203/2004 hH5Nl HA 蛋白的氨基酸序列根据与人类H3序列(A/Aichi/2/68)的比对进行编号。图3a_;3b显示了从收集到的血清得到的结果，所述血清通过向BLAB/c小鼠三次腹膜内给药与各种脂质体(DOPE CHEMS (比例为6 4) ,DOPE CHEMS (比例为1 1)、 DOPE CHEMS(比例为 1 0) ,DOPE CHEMS(比例为 0 1)、lipofectin、lipofectamine、 DOTAP或泊洛沙姆407)复合的PO-DNA(MB-0DN4531(0))和肽(H5N1 HA233)来获得。结果表明，当DOPE CHEMS的摩尔比为1 1时，抗H5m HA233肽的总IgG的量(图3a)和总 IgG的滴度(图3b)最高。图4显示了从收集到的血清得到的结果，所述血清通过向BLAB/c小鼠三次腹膜内给药与PO-DNA、PS-DNA或各种非CpG-DNA复合的肽(H5N1 HA233)和脂质体 (DOPE CHEMSd 1))来获得。结果表明，与非CpG-DNA相比，当与PO-DNA 4531(0)或 PS-DNA 4531 (S)复合时，抗H5m HA 233肽的总 IgG 的量最高。MB-ODN 4531 在H5m HA233 肽特异性IgG生产中的佐剂效应是CG序列依赖性和骨架修饰不依赖性的。图5显示了对应于Hmi毒株和H5m毒株中的hH5Nl HA370表位的保守序列，以及保守序列特异性IgG的生产。按照表3和表4中的描述合成了 Hmi毒株和H5m毒株中对应于A/Vietnam/1203/2004毒株的hH5Nl HA370表位的长为17个氨基酸的保守序列。 用共包胶在DOPE CHEMS(比例为1 1)复合物中的50 μ g每种肽(hHmi-NY HA370、 hHlNl-0H HA370、hHlNl-ffSN HA370、A/H1N1-TX HA370、hH5Nl HA370 和 hH5Nl_HK HA370) 禾口 50 μ g MB-ODN 4531 (0)(用Lipoplex (0) +肽表示)，以10日的时间间隔对5只BALB/c 小鼠进行三次腹膜内免疫接种。在最后一次免疫后10天收集抗血清，然后通过ELISA测定抗每种肽的特异性总IgG的量(图5a)、抗每种肽的特异性IgGl的量(图5b)、抗每种肽的特异性IgGh的量(图5c)以及抗每种肽的特异性IgG的滴度(图5d)。图6显示了使用Lipoplex(O)与对应于hH5Nl HA233表位的保守序列的复合物的免疫接种对IgG生产的影响。合成了甲型流感病毒H5W毒株(表幻和各种甲型流感病毒亚型(表6)中对应于A/Viet Nam/1203/2004毒株的hH5Nl HA233表位的长为14个氨基酸的保守序列。用共包胶在DOPE CHEMS (比例为1 1)复合物中的50 μ g每种肽和50 μ g MB-ODN 4531 (0)(用Lipoplex (0) +肽表示)，以10日的时间间隔对3只BALB/c小鼠进行三次腹膜内免疫接种。在最后一次免疫后10天收集抗血清，然后通过ELISA测定抗每种肽的特异性总IgG的量(图6a，图6d)、抗每种肽的特异性IgGl的量(图6b)、抗每种肽的特异性IgG2a的量(图6c)。图7显示了共包胶在DOPE CHEMS复合物中的对应于hH5Nl HA370 (或hH5Nl HA233)的保守序列和MB-ODN 4531(0)对IgG生产的影响。合成了甲型流感病毒亚型(H7 和! )(表 6，表 9)中对应于 A/Viet Nam/1203/2004 毒株的 hH5m HA370(或 hH5m HA233)表位的长为17个氨基酸的保守序列。用共包胶在DOPE CHEMS(比例为1 1)复合物中的50 μ g每种肽和50 μ g MB-ODN 4531 (0)(用Lipoplex (0) +肽表示)，以10日的时间间隔对3只BALB/c小鼠进行三次腹膜内免疫接种。在最后一次免疫后10天收集抗血清，然后通过ELISA测定抗每种肽的特异性总IgG的量。图8a_8f显示了血凝抑制和病毒中和的分析，证实了 H5mHA蛋白和Hmi HA 蛋白被通过 PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5Nl HA233, hH5Nl HA370, hHlNl-ffSN HA233, hHlNl-HK HA233)-DOPE CHEMS复合物所产生的抗血清的特异性识别。图8a显示，由 PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5Nl HA233, hH5Nl HA370, hHlNl-ffSN HA233、 hHlNl-HK HA233) -DOPE CHEMS复合物所产生的每种抗血清抑制由重组H5m病毒 (rH5Nl病毒PR8/H5LO)和A/WSN/1993病毒诱导的鸡红细胞的血凝。图8b_f显示，由 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-月太(hH5Nl HA233、hH5Nl HA370、hHlNl-WSN HA233、hHlNl-HK HA233) -DOPE CHEMS复合物所产生的每种抗血清抑制rH5m病毒PR8/H5Lo和A/WSN/1993 病毒对MDCK细胞的感染。图9a-9d显示了在rH5m病毒激惹的小鼠中用PO-DNA (MB-0DN4531 (0))-肽 (hH5Nl HA370)-D0PE CHEMS复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后鼻部给药10LD50rH5m病毒(PR8/H5Lo)。图9a显示，用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后存活。图9b表明，用P0-DNA(MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后体重重新增加。图9c显示，用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后具有正常的肺部组织。图9d显示，在用P0-DNA(MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠中，在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后3日内和6日内肺部组织中的病毒减少。图IOa-IOd显示了在小鼠适应性A/WSN/1933 HlNl病毒(maA/WSN/1933病毒)激惹的小鼠中用 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA370) -DOPE CHEMS 复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5Nl HA370)-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒。 图IOa显示，用P0-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药 10LD50maA/WSN/l"3 病毒后存活。图 IOb 表明，用 P0-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽 (hH5mHA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1993病毒后体重重新增加。图IOc显示，用P0-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5mHA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1993病毒后具有正常的肺部组织。图IOd显示，在用 PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠中，在鼻部给药 10LD50maA/WSN/1993病毒后3日内和6日内肺部组织中的病毒减少。图Ila-Ilc显示了在rH5m病毒激惹的小鼠中用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽 (hH5Nl HA233)-D0PE CHEMS复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA233)-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后鼻部给药10LD50rH5m病毒(PR8/H5Lo)。图Ila显示，用PO-DNA(MB-0DN4531(0))-肽(hH5m HA23;3)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后存活。图lib表明，用P0-DNA(MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA233)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后恢复其体重。图Ilc显示，用P0_DNA(MB_0DN 4531(0))-肽(hH5m HA23;3)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50 rH5m病毒后具有正常的肺部组织。
图12a-12b显示了在maA/WSN/1933病毒激惹的小鼠中用PO-DNA (MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA233)-D0PE CHEMS复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA233)-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒。图1 显示，用PO-DNA (MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA233)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1993 病毒后存活。图12b表明，用PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA233)-脂质体给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1993病毒后恢复其体重。图13a-13c显示了在maA/WSN/1933病毒或rH5m病毒(PR8/H5Lo)激惹的小鼠中用 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hHmi-WSN HA233) -DOPE CHEMS 复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hHlNl-ffSN HA233)-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒或 10LD50rH5m 病毒 PR8/H5Lo。图 13a 显示，用 PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hHlNl-ffSN HA23;3)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒或10LD50rH5m病毒后存活。图1 表明，用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hHmi-WSN HA233)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒或10LD50rH5m病毒后恢复其体重。图 13c显示，用PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-肽(hHmi-WSN HA233)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒或10LD50rH5m病毒后具有正常的肺部组织。图14a-14c显示了在maA/WSN/1933病毒激惹的小鼠中用PO-DNA (MB-0DN 4531(0))-肽(hHlNl-HKN HA233)-D0PE CHEMS复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hHlNl-HK HA233)-脂质体复合物对BALB/ c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒。图1 显示，用 PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hHmi_HK HA233)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药 10LD50maA/WSN/1933 病毒后存活。图 14b 表明，用 PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hHlNl-HK HA23;3)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒后恢复其体重。图 13c显示，用PO-DNA (MB-0DN 4531(0))-肽(hHmi-HK HA233)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50maA/WSN/1933病毒后具有正常的肺部组织。图 15a-15b 显示了在 PO-DNA(MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5NlHA233、hH5NlHA370、 hHlNl-WSN HA233,hHlNl-HK HA233) -DOPE CHEMS复合物给药的小鼠中，通过在鼻部给药 10LD50rH5Nl 病毒(PR8/H5Lo)(图 15a)和 10LD50maA/WSN/1993 病毒(图 15b)后产生的抗血清进行的血凝抑制。图 16a-16f■显示，在用 P0-DNA(MB_0DN 4531(0))-肽(hH5NlHA233, hH5Nl HA370, hHlNl-WSN HA233, hHlNl-HK HA233) -DOPE CHEMS 复合物给药、然后鼻部给药 10LD50rH5Nl病毒或10LD50maA/WSN/1993病毒的小鼠的血清和BALF (支气管肺泡灌洗液) 中，针对每种表位的IgG和IgA抗体的生产显著增加。
图17a-17d显示了在rH5m病毒激惹的小鼠中用P0-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽 (hH5NlHA370)-D0PE CHEMS复合物预防接种的预防效能。以10日的时间间隔两次用 PO-DNA (MB-0DN 4531(0))-肽(hH5mHA370)-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后在接种后2个月内鼻部给药10LD50rH5m病毒。图17a显示，用PO-DNA(MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50rH5m病毒后存活。图17b表明，用P0-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50rH5m病毒后恢复其体重。图17c显示，用PO-DNA(MB-0DN 4531(0))-肽 (hH5Nl HA370)-脂质体复合物给药的小鼠在鼻部给药10LD50rH5m病毒后具有正常的肺部组织。图17d显示，在用P0-DNA(MB-0DN 4531 (0))-肽(hH5m HA370)-脂质体复合物给药的小鼠中，在鼻部给药10LD50rH5m病毒后3日或6日内肺部组织中的病毒减少。图 18a-18d表明，使用 P0-DNA(MB-0DN 4531 (0))-表位-DOPE CHEMS 复合物进行表位特异性抗体生产比使用病毒更有效。图18a显示，在以10日的时间间隔三次腹膜内给药 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0)) -UV 灭活的 rH5Nl 病毒-DOPE CHEMS 复合物(Lipoplex (0) + 灭活的PR8/H5LO)的小鼠中，与病毒特异性结合的总IgG和与Thl免疫应答相关的IgGh的生产增加。图18b显示，在以10日的时间间隔三次腹膜内给药PO-DNA (MB-0DN 4531 (0)) -UV 灭活的rH5m病毒-DOPE CHEMS复合物的小鼠中，总IgG的滴度增加。图18c_18d显示， 在使用 PO-DNA (MB-0DN 4531 (0))-表位(hH5m HA233 或 hH5m HA370) -DOPE CHEMS 复合物预防接种的血清中，与每种肽结合的总IgG的滴度增加。图19a_19d显示了考虑到亲水性、疏水性、二级结构、抗原性和两亲性，从HCV-El 蛋白的三个候选表位(表10)中选择用于开发基于PO-DNA(MB-0DN4531(0))_肽-DOPE CHE MS复合物的疫苗的表位。将所选的3个候选表位(HCV-E157、HCV-E1202、HCV-E1269)制备成PO-DNA (MB-0DN4531 (0))-每种肽-脂质体复合物，然后三次腹膜内给药于BALB/c小鼠， 并收集血清。证实了 HCV-E157肽特异性总IgG的生产(图19a)增加。此外，在用HCV-El 202肽预防接种的血清中，总IgG的量(图19a)以及与Thl免疫应答相关的IgGh的量和滴度(图19b和19c)增加。此外，本发明人还从用与各种脂质体复合的MB-0DN4531(0)和肽(HCV-E1 20 三次腹膜内给药的BALB/c小鼠收集血清。当DOPE CHEMS的摩尔比为 1 1时(图19d)，HCV-El 202肽特异性总IgG的滴度最高。图20a-20c显示了考虑到亲水性、疏水性、二级结构、抗原性和两亲性，从HSRV (人类呼吸道合胞病毒)G和F蛋白中的3个候选表位(表10)中选择用于开发基于PO-DNA(M B-0DN4531(0))_肽-DOPE CHEMS复合物的疫苗的表位。将所选的3个候选表位(HSRV-G1、 HSRV-G150、HSRV-F99)制备成MB-0DN4531 (0)-每种肽-脂质体复合物，然后三次腹膜内给药于BALB/c小鼠，并收集血清。证实了 HSRV-Gl肽特异性总IgG(图20a)和IgGh(图20b) 的生产增加。此外，在用HSRV-Gl肽肽预防接种的血清中，HSRV-Gl肽特异性总IgG的滴度 (图20c)和与Thl免疫应答相关的IgG2a的生产(图20b和20c)增加。图2la-2Id显示了考虑到亲水性、疏水性、二级结构、抗原性和两亲性，从HSRV (人类呼吸道合胞病毒)F蛋白中的17个候选表位(表11和12)中选择用于开发基于 PO-DNA-肽-脂质体复合物的疫苗的表位。将每种所选的17个候选表位制备成MB-ODN 4531 (0)-每种肽-脂质体复合物，然后三或四次腹膜内给药于BALB/c小鼠，并收集血清。 证实了与4个候选(HSRV-F3a、HSRV-F3a-2、HSRV-F7、HSRV-F9)肽特异性结合的总IgG(图21a、21b、21c 和 21d)和 IgG2a(图 21b,21c 和 21d)的生产增加。图2h-22b显示了考虑到亲水性、疏水性、二级结构、抗原性和两亲性，从人类整合蛋白β 4(在大多数癌细胞中表达)中的6个候选表位(表13)中选择用于开发基于PO-DNA-肽-脂质体复合物的疫苗的表位。将每个所选的6个候选表位制备成MB-ODN 4531(0)-每种肽-脂质体复合物，然后四次腹膜内给药于BALB/c小鼠，并收集血清。证实了与 4 个候选表位(hIB4-VWA-l-2、hIB4_VWA-l_3、hIB4_VWA_2、hIB4_VWA_3、hIB4_EGF_l) 肽特异性结合的总IgG的量(图22a)和总IgG的滴度(图22b)增加。图23a_23f显示了考虑到亲水性、疏水性、二级结构、抗原性和两亲性，从已知在肝癌中特异性表达的hTM4SF5(人类四次跨膜蛋白4超家族成员幻蛋白中的6个候选表位(表10)中选择表位。将所选的6个候选表位(hTM4SF5Rl、hTM4SF5R2-l、hTM4SF5R2-2、 hTM4SF5R2-3、hTM4SF5R2-4、hTM4SF5R2-5)制备成 MB-0DN4531 (0)-每种肽-脂质体复合物， 然后三次腹膜内给药于BALB/c小鼠，并收集血清。证实了 hTM4SF5R2-3和hTM4SF5R2_5肽特异性总IgG(图22a)以及IgG2a(图22b)的生产增加。此外，在用hTM4SF5R2_3肽预防接种的血清中，总IgG的滴度(图22b)和与Thl免疫应答相关的IgGh的生产(图22b) 增加。此外，本发明人还从用与各种脂质体复合的MB-0DN4531(0)和肽(hTM4SF5R2_3)三次腹膜内给药的BALB/c小鼠收集血清。当DOPE CHEMS的摩尔比为1 1时(图22c)， hTM4SF5R2-3肽特异性总IgG的滴度最高。本发明人从用与脂质体(DOPE CHEMS(1 1)) 复合的 hTM4SF5R2-3-CpG-DNA(MB-0DN 4531 (0)、MB-0DN 453IGC(0)或 MB-0DN 4531 (S)) 给药的小鼠收集血清(图22d)。在MB-ODN 4531 (0)中hTM4SF5R2_3肽特异性总IgG的滴度最高。本发明人从用 PO-DNA(MB-0DN 4531 (0))_hTM4SFR2_3 肽-DOPE CHEMS 复合物三次腹膜内给药的TLR9敲除的BALB/c小鼠收集血清(图22e_22f)。TLR9敲除的BALB/ c小鼠没有显示出总hTM4SF5R2-3肽特异性I gG的任何滴度，表明通过PO-DNA (MB-0DN 4531 (0)) -hTM4SFR2-3 肽-DOPE CHEMS 复合物产生抗体依赖于 TLR9。图Ma-Mf显示了 II类MHC介导的呈递和Thl分化对通过用共包胶在 DOPE CHEMS复合物中的表位和MB-ODN 4531 (0)免疫接种引起的IgG生产的影响。图 Ma显示了对共包胶在DOPE CHEMS复合物中的hTM4SF5R2-3肽和MB-ODN 4531(0)做出响应的IgG生产的动力学。以10日的时间间隔三次用共包胶在DOPE CHEMS复合物中的 hTM4SF5R2-3肽和MB-ODN 4531 (0)对3只BALB/c小鼠进行腹膜内注射。在相对于免疫接种时间的第1天四次腹膜内收集血清，并通过ELISA测定肽特异性总IgG、IgGU IgGh和 IgM的量。图24b显示，⑶4+细胞的瞬时贫化阻止了由共包胶在DOPE CHEMS复合物中的 hTM4SF5R2-3肽和MB-ODN 4531(0)的免疫接种所引起的IgG生产。在相对于免疫接种时间的第_3、-1、1和3日，四次向每只小鼠腹膜内注射100 μ g GKl. 5 (抗⑶4抗体)。从第0 日起，以10日的间隔时间三次向3只小鼠腹膜内注射共包胶在DOPE CHEMS复合物中的 hTM4SF5R2-3 肽和 MB-0DN 4531 (0)(用 Lipoplex (0) +TM4SF5R2-3 表示)。收集血清并通过 ELISA测定肽特异性总IgG的量。使用正常IgG作为对照。(图2 和Md)。由共包胶在 DOPE CHEMS复合物中的HCVE2-202肽和MB-ODN 4531(0)的免疫接种所引起的IgG生产需要II类MHC和II类MHC限制的T细胞活化。以10日的时间间隔，用共包胶在DOPE CHEMS 复合物中的 50 μ g HCVE2-202 肽和 50 μ g MB-ODN 4531 (0)(用 Lipoplex (0) +HCVE2-202 表示)三次腹膜内注射C57BL/6小鼠、C57BL/6II类MHC敲除小鼠(MHC-II K0)(图23c)或C57BL/60T-II转基因小鼠(0Τ-ΙΙ TG)(图23d) (η = 3)。收集血清并通过ELISA测定 HCVE2-202 肽特异性总 IgG、IgGl、IgG^i 的量(图 Me and 24f)。由共包胶在 DOPE CHEMS 复合物中的50 μ ghTM4SF5R2-3肽和50 μ g MB-ODN 4531 (0)的免疫接种所引起的IgG生产需要STA1M而不是STAT6。以10日的时间间隔，用共包胶在DOPE CHEMS (比例为1 1) 复合物中的 50yg hTM4SF5R2-3 肽和 50 μ g MB-ODN 4531 (0)(用 Lipoplex (0)+TM4SF5R2-3 表示)三次腹膜内注射BALB/c小鼠、BALB/c STAT4敲除小鼠(STAT4K0)(图23e)或BALB/ c STAT6敲除小鼠(STAT6K0)(图23f) (η = 3)。收集血清并使用ELISA测定hTM4SF5 R2-3 肽特异性总IgG、IgGU IgG2a的量。这些实验执行了 2或3次，获得相同的结果。图25a_2k显示出hTM4SF5R2_3肽特异性抗体识别肝癌细胞的TM4SF5蛋白并调节肝癌细胞的功能。在Huh-7和SNU-761中通过RT-PCR观察到TM4SF5的表达(图25a)。 通过FACS证实了 hTM4SF5R2-3肽特异性单克隆抗体识别Huh_7和SNU-761细胞的TM4SF5 蛋白(图25b)。图25c通过MTT测定法显示，当用hTM4SF5R2-3肽特异性单克隆抗体处理肝癌细胞时，表达TM4SF5的Huh-7细胞的生长被抑制。图25d显示，通过hTM4SF5R2_3肽特异性单克隆抗体的处理，Huh-7细胞的S-期减少。图2 显示，当用hTM4SF5R2-3肽特异性单克隆抗体处理表达TM4SF5的肝癌细胞(Huh-7)时，肌动蛋白具有独特的应力纤维外形，支撑着与不表达TM4SF5的细胞中相同的外延的多边形形状。尽管已知在表达TM4SF5 的肝癌细胞中能够观察到肌动蛋白的异常集束，但通过肌动蛋白染色在不表达TM4SF5的细胞中检测到了具有支撑外延的多边形形状的独特外形的应力纤维。用抗hTM4SF5R2-3抗体处理的表达TM4SF5的细胞(Huh-7)，强烈诱导与不表达TM4SF5的细胞的肌动蛋白类似的外形独特的应力纤维。这些结果表明抗体靶向表达hTM4SF5的细胞。图显示出hTM4SF5R2_3肽特异性抗体在体内抑制人类肝癌细胞生长。从肿瘤移植后第7日起，以3日的时间间隔5次给药10mg/Kg hTM4SF5R2_3肽特异性抗体，对带有Huh-7细胞异体移植物的无胸腺裸鼠进行处理(图^a)。当肿瘤尺寸达到士2000mm3 的体积时，将小鼠处死并评估肿瘤的重量(图26b)。图27a_27b显示了在用BNL-HCC细胞激惹的同种异体移植肝癌模型中，用 PO-DNA(MB-0DN 4531 (0))_hTM4SF5R2_3 肽-DOPE CHEMS 复合物进行预防接种的预防效能。以10日的时间间隔三次用PO-DNA (MB-0DN 4531 (0)) _hTM4SF5R2_3肽-脂质体复合物对BALB/c小鼠进行腹膜内免疫接种，然后将含有50%基质胶的切106个BNL-HCC细胞皮下接种到背部右侧中。在肿瘤细胞抑制后7周将小鼠处死，并评估肿瘤的重量。发明详述在本发明的一个方面，提供了用于增强免疫应答的组合物，所述组合物作为活性成分包含包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中的(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)表位。本发明人为了开发能够预防和治疗各种癌症和传染病的的新免疫佐剂已进行了深入研究。结果，它们鉴定了蛋白抗原的肽表位，并发现包胶在特定组成的脂质体中的表位和寡核苷酸提供了极大增强的免疫刺激活性。当在本文中使用时，术语“阴离子型表面活性剂”是指由具有疏水和亲水两部分并在整个分子上带有负电荷的两亲分子构成的试剂。优选情况下，本发明的阴离子型表面活性剂包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰丝氨酸、磷酸二鲸蜡酯、磷脂酸、二酰基磷脂酸、油酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、NSPE (N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺),NGPE (N-戊二酰磷脂酰乙醇胺)、LPG(赖氨酰磷脂酰甘油)和CHEMS (胆留醇半琥珀酸酯)。更优选情况下，本发明的阴离子型表面活性剂是CHEMS。当在本文中使用时，术语“中性磷脂”是指类似两性离子，在即使在一部分原子上带电荷，但在整个分子上具有零正电荷的磷脂，以及其中每个原子都不带电荷的磷脂。优选情况下，本发明的中性磷脂包括但不限于磷脂酰胆碱、DPPC( 二棕榈酰磷脂酰胆碱)、 DSPC(1, 2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、胆甾醇、 PEG-PE (聚乙二醇磷脂酰乙醇胺)、D0PC(二油酰磷脂酰胆碱)和DOPE (二油烯基磷脂酰乙醇胺)。更优选情况下，本发明的中性磷脂是DOPE。当在本文中使用时，术语“脂质体”是指通过形成脂双层而制备的脂类载体。脂质体通常是生物相容的，并且由于其两亲性能够通过疏水质膜。取决于制备方法和所递送的核苷酸的长度，脂质体的直径一般为20-2000nm。根据优选实施方案，本发明的脂质体是CHEMS与DOPE的混合物。本发明的DOPE CHEMS的摩尔比优选为7 3-3 7，更优选为 4.5 5.5-5.5 4. 5，最优选为 5.0 5.0。本发明的脂质体的制备可以通过本技术领域的专业人员已知的各种方法来进行， 并优选通过有机溶液混合法或去污剂混合法(US 5705385 ；US08/660, 025)来制备。更优选情况下，可以通过将DOPE与CHEMS混合，用氮气蒸发成无溶剂脂质膜的形式，溶解在醇溶液中，最后与水溶性核苷酸混合物混合，来制造脂质体。在通过混合有机溶剂制备本发明的脂质体的情况下，所述有机溶剂包括氯仿、甲醇、乙醇、正丙醇或丁醇。优选情况下，所述有机溶剂是乙醇。当在本文中使用时，术语“包胶”是指将待递送材料包封在相对稳定的壳中，用于在体内高效递送。当在本文中使用时，术语“免疫刺激性”是指以可测量的程度诱导针对抗原的初始免疫应答或增加已有免疫应答。本发明的免疫刺激性寡核苷酸包含本技术领域的专业人员已知的任何免疫刺激性寡核苷酸。例如，所述免疫刺激性寡核苷酸可以是形成发夹结构的回文序列、CpG基序、 CpT基序、多个G的结构域或其他已知ISS (免疫刺激性序列)。例如，本发明的免疫刺激性寡核苷酸包含在US20080045473、W0 2006/063152或WO 1998/18810中公开的寡核苷酸。所述CpG寡核苷酸包括在WO 2006/080596中公开的由本发明人开发的那些CpG 寡核苷酸。例如，可以使用由下式表示的CpG寡核苷酸HKCGTTCRTGCSGM (其中R是A或G ； S是C或G;H是A、T或C;K是G或T;M是C或A)。本发明的免疫刺激性寡核苷酸包括天然存在的核苷酸、骨架修饰的核苷酸(例如肽核酸(PNA) (M. Egholm 等，Nature, 365 :566-568 (199 )、硫代磷酸酯 DNA、二硫代磷酸酯 DNA、氨基磷酸酯DNA、酰胺连接的DNA、匪I连接的DNA、2，-0_甲基RNA、α -DNA和膦酸甲酯 DNA)、糖修饰的核苷酸(例如2’ -0-甲基RNA、2 ‘-氟代RNA、2 ‘-氨基RNA、2 ‘ -0-烷基DNA、2 ‘ -0-烯丙基DNA、2 ‘ -0-炔基DNA、己糖DNA、吡喃糖基RNA和失水己糖醇DNA) 以及碱基修饰的核苷酸(例如C-5取代的嘧啶(取代基包括氟_、溴_、氯_、碘_、甲基_、 乙基_、乙烯基_、甲酰基_、乙炔基_、丙炔基_、炔基_、噻唑基_、咪唑基-和吡啶基)、具有 C-7取代基的7-脱氮杂嘌呤(取代基包括氟_、溴_、氯_、碘_、甲基_、乙基_、乙烯基_、甲酰基_、炔基_、烯基_、噻唑基_、咪唑基-和吡啶基)、次黄苷和二氨基嘌呤)。优选情况下， 本发明的寡核苷酸是天然存在的核苷酸。根据优选实施方案，本发明的免疫刺激性寡核苷酸具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨架。本发明的免疫刺激性寡核苷酸的长度是优选为8-100个核苷酸，更优选为15-50 个核苷酸，最优选为13-25个核苷酸，但不限于此。优选情况下，本发明的免疫刺激性寡核苷酸选自SEQ ID NO 14至SEQ ID NO 18。 更优选情况下，本发明的免疫刺激性寡核苷酸是SEQ ID N0:14。本发明人以前的实验分析证实了源于牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)基因组 DNA的潜在的CpG-DNA作为Thl应答性佐剂发挥效力，并且它激活转录因子NF- κ B (31)。具体来说，本发明的寡核苷酸是位于牛分枝杆菌基因组DNA上4531位的20bp的寡核苷酸MB-ODN 4531 (SEQ ID NO 14) ,MB-ODN 4531上的一个CG 二核苷酸被GC 二核苷酸代替的MB-ODN 4531 (GCO) (SEQ ID NO 15) ,MB-ODN 4531的3，-末端的7个碱基被删除并且骨架中的桥接氧原子被硫原子代替的MB-ODN 4531(S)T13(SEQ ID NO 16)、一个CG 二核苷酸被CT 二核苷酸代替并且骨架中的桥接氧原子被硫原子代替的MB-ODN 4531 (S) CT寡核苷酸(SEQ ID NO 17)和具有与MB-ODN 4531互补的序列并且骨架中的桥接氧原子被硫原子代替的MB-ODN 4531 (S)CS寡核苷酸(SEQ ID N0:18)。本发明人的实验分析揭示，在各具有不同寡核苷酸的所有复合物中，给药MB-ODN 4531寡核苷酸/肽/脂质体复合物诱导最高的总IgG水平。当在本文中使用时，术语“表位”是指抗原与抗体相互作用的部分。更具体来说， 术语表位包括能够与免疫球蛋白或T-细胞受体特异性结合的任何蛋白决定簇。此外，本发明的表位包括能够增强免疫应答的任何分子或材料。例如，本发明的表位包括但不限于肽、 编码所述肽的核酸和糖蛋白。当在本文中使用时，术语“肽”是指通过氨基酸残基之间的肽键形成的线性分子， 术语“肽表位”是指包含能够诱导B细胞和/或T细胞的特异性应答的表位的肽。本发明的肽表位的长度优选为7-30个氨基酸，更优选为10-25个氨基酸，最优选为10-17个氨基酸，但不限于此。根据优选实施方案，本发明的表位是具有选自SEQ ID NO :1至SEQ ID N0:13和 SEQ ID NO 19至SEQ ID NO 46的氨基酸序列的肽表位。本发明人合成了源于甲型禽流感病毒的HA蛋白、甲型猪流感病毒的HA蛋白、HlNl 甲型流感病毒的HA蛋白、H7甲型流感病毒的HA蛋白、H9甲型流感病毒的HA蛋白、肝癌的 hTM4SF5(人类四次跨膜蛋白4超家族成员幻蛋白、人类整合蛋白i3 4(hIB4)、丙肝病毒的包膜蛋白、RSV(呼吸道合胞病毒)的黏附(G)糖蛋白(HRSV-G)和RSV的融合蛋白(HRSV-F) 的肽。然后通过筛选在给药时增加免疫应答的肽，获得了 SEQ ID NO :1至SEQ ID N0:13和 SEQ ID NO 19 M SEQ ID NO :46。因此，包含 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 19至SEQ ID NO :37的任一氨基酸序列的肽都具有针对甲型流感病毒的免疫刺激效应，包含SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11的氨基酸序列的肽都具有针对肝癌的免疫刺激效应，包含SEQ ID N0:42至SEQ ID NO 46的氨基酸序列的肽都具有对人类整合蛋白β 4的免疫刺激效应，包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列的肽具有针对丙肝病毒的免疫刺激效应，包含SEQID N0:13和SEQ ID NO 38至SEQ ID NO 41的氨基酸序列的肽都具有针对RSV的免疫刺
激效应。本发明的组合物可以包含其他药物或免疫佐剂以提供附加的免疫刺激效应。免疫佐剂的类型对于本技术领域的专业人员来说是已知的(“疫苗设计——亚基和佐剂方
(Vaccine Design—The Subunit and Adjuvant Approach)，1995，《！^ · L *》 (Pharmaceutical Biotechnology),第 6 卷，Powell, Μ. F.禾口 Newman, Μ. J.主编，Plenum Press,New York and London, ISBN 0-306-44867-X)。优选情况下，本发明的免疫佐剂包括铝盐或钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)。优选的免疫佐剂的实例包括但不限于铝盐，钙盐(例如氢氧化物或磷酸盐)，颗粒载体(W0 96/33739)如水包油乳液(W0 95/17210，EP 0 399 843)或脂质体，源于石碱木 (Quillaja Saponaria Molina)的免疫活性皂角苷提取物(例如Quil A)，3_0_脱乙酰单磷酰脂A，胞壁酰二肽，3D-MPL (3-0-脱酰基单磷酰脂A)。可以使用本发明的组合物作为治疗方法的病症或疾病的实例包括但不限于(i)癌症(例如胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、支气管癌、鼻咽癌、喉癌、胰腺癌、膀胱癌、结肠直肠癌、结肠癌、宫颈癌、脑癌、前列腺癌、骨癌、皮肤癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌和输尿管癌)；(ii)病毒性疾病，例如由下列病毒的感染所引起的疾病腺病毒、疱疹病毒(例如 HSV-I、HSV-II、CMV或VZV)、痘病毒(例如正痘病毒，如天花或牛痘或传染性软疣)、细小核糖核酸病毒(例如鼻病毒或肠道病毒)、正粘病毒(例如流感病毒包括H5W禽流感病毒)、 副粘病毒(例如5-副流感病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道合胞病毒(RSV))、冠状病毒(例如SARS)、乳多空病毒(例如乳头状瘤病毒，例如引起生殖器疣、寻常疣或跖疣的乳头状瘤病毒)、嗜肝DNA病毒(例如乙肝病毒)、黄病毒(例如丙肝病毒或登革病毒)或反转录病毒(例如慢病毒如HIV)；(iii)细菌性疾病，例如由例如下列细菌的感染引起的疾病埃希式杆菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺菌属(Shigella)、李其j 特菌属(Listeria)、气杆菌属 (Aerobacter)、螺旋杆菌属(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(I^seudomonas)、奈瑟菌属(Neisseria)、梭状芽胞杆菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、分枝杆胃属(Mycobacterium)、胃 ffi ff 胃 M (Campylobacter)、Μ 胃 M (Vibrio) > ^ W K ^ M (Serratia)、普罗威登斯菌属(Providencia)、色杆菌属(Chromobacterium)、布鲁氏杆菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)或包特菌属 (Bordetella)；(iv)其他传染病，例如衣原体、真菌性疾病包括但不限于念珠菌病、曲霉病、组织胞浆菌病、隐球菌脑膜炎，或寄生性疾病包括但不限于疟疾、卡氏肺囊虫肺炎、利什曼原虫病、隐孢子虫病、弓形体病和锥虫感染；(V)Th2介导的特异反应性疾病，例如特异反应性皮炎或湿疹、嗜酸性细胞增多症、 哮喘、过敏症、过敏性鼻炎和Ommen综合征；(vi)某些自体免疫疾病，例如alopecia greata、关节强硬性脊椎炎、抗磷脂综合征、自体免疫性阿狄森病、自体免疫性肾上腺炎、自体免疫性溶血性贫血、自体免疫性肝炎、自体免疫性卵巢炎和睾丸炎、自体免疫性血小板减少症、Behset病、大疱性类天疱疮、 心肌病、乳糜泻-皮肤炎、慢性疲劳免疫功能障碍综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、Churg-Mrauss综合征、瘢痕性类天疱疮、CREST综合征、冷血凝素病、克罗恩病、盘状红斑狼疮、原发性混合型冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、肾小球肾炎、突眼性甲状腺肿、 Guillain-Barre综合征并发桥本甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜、 IgA神经病、溃疡性结肠炎引起的幼年型关节炎、扁平苔癣、红斑狼疮、美尼尔氏病、混合型结缔组织病、多发性硬化症、I型或免疫介导的糖尿病、重症肌无力、寻常性天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、自身免疫性多内分泌腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬变、牛皮癣、牛皮癣关节炎、雷诺现象、 赖特综合征、类风湿性关节炎、肉样瘤病、硬皮病、僵人综合征、系统性红斑狼疮、红斑狼疮、 多发性大动脉炎、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、眼色素层炎、白癜风和韦格纳肉芽肿；(vii)炎性疾病包括哮喘、脑炎、炎性结肠炎、慢性阻塞性肺病、过敏症、脓毒性休克、肺纤维变性、未分化脊柱关节病、未分化关节病、关节炎、炎性骨质溶解和由慢性病毒或细菌感染引起的慢性炎症；以及(viii)与伤口修复相关的疾病，例如瘢痕瘤形成和其他瘢痕类型的抑制，以及增强伤口愈合、包括慢性伤口。优选情况下，本发明的组合物用于癌症、病毒性疾病、细菌性疾病、传染病或自体免疫疾病。本发明的组合物可以提供成药物组合物。本发明的药物组合物除了活性成分化合物之外还包括可药用载体。本发明的药物组合物中包含的常用于药物制剂的可药用载体，包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钾、藻酸盐、明胶、硅酸钾、微晶体纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。本发明的药物组合物还可以包含润滑剂、保湿剂、 甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。适合的可药用载体和制剂的详细情况，可以在 《Remington 药物学》(Remington' s Pharmaceutical Sciences)(第 19 版，1995)中发现。本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给药，并且优选通过肠胃外给药。对于肠胃外给药来说，它可以静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内或透皮给药。本发明的药物组合物的适合剂量，可以随着药物制剂方法、给药方法、患者的年龄、体重、性别、病原体状态、饮食、给药时间、给药路线、排泄率和对所使用的药物组合物的敏感性而变。优选情况下，本发明的药物组合物可以以0.001-10000mg/kg(体重)的每日
剂量给药。可以按照本技术领域的专业人员已知的常规技术，用如上所述的可药用载体和/ 或介质配制本发明的药物组合物，最终提供几种形式，包括单位药剂形式和多剂形式。制剂的非限制性实例包括但不限于在油性或水性介质中的溶液、悬液或乳液、酏剂、粉剂、颗粒剂、片剂和胶囊，并且还可以包含分散剂或稳定剂。在本发明的另一方面，提供了用于具有免疫原性的表位的筛选方法，所述方法包含下列步骤
(a)将⑴免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中；(b)用所述包胶有⑴免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽的脂质体免疫非人类动物；(c)分析所述被免疫非人类动物的免疫应答。由于本发明的表位、肽、免疫刺激性寡核苷酸和脂质体已在上文描述，因此在这里为了避免过度重复而将其省略。脂质体包胶的免疫刺激性寡核苷酸或肽的免疫接种方法包括本技术领域的专业人员已知的方法，优选为肠胃外给药。对于肠胃外给药来说，它可以静脉内、皮下、肌肉内、 腹膜内或透皮给药。在本发明中使用的“非人类动物”包括通常在本技术领域中使用的各种动物，优选为哺乳动物，最优选为小鼠、兔或大鼠。被免疫动物中免疫应答的测量，通过分析用所选脂质体包胶的肽给药的对象动物的血清中抗肽抗体(总IgG、IgGl和IgG2a)的滴度来进行。优选情况下，用于测量抗体滴度的方法包括但不限于ELISA (酶联免疫吸附测定法)、侧向流试验、MIA (磁免疫测定法)、 免疫沉淀。更优选情况下，可以使用ELISA分析。当特定肽序列增加抗肽抗体的滴度时，所述特定肽被确定为表位或肽疫苗。在本发明的另一方面，提供了针对蛋白抗原的抗体的筛选方法，所述方法包含下列步骤(a)将⑴免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的蛋白抗原的肽包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中；(b)用所述包胶有⑴免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽的脂质体免疫非人类动物；以及(c)通过分析所述被免疫非人类动物的免疫应答来筛选具有免疫原性的肽表位；(d)将所述筛选到的肽表位与待分析的目标抗体相接触；(e)将步骤(d)的结果与所述蛋白抗原相接触；以及(f)分析所述蛋白抗原与目标抗体的结合。本发明的筛选方法可以通过各种方法来执行，特别是通过本技术领域的专业人员已知的各种结合测定法进行的高通量方法。本发明的蛋白抗原或候选抗体可以用可检测标记物标记。例如，所述可检测标记物包括但不限于化学标记物(例如生物素)、酶标记物(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、 过氧化物酶、萤光素酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶)、放射活性标记物(例如C14、 ι1Μ、ρ32和S35)、荧光标记物(例如香豆素、荧光素、FITC(荧光素异硫氰酸酯)、罗丹明6G、罗丹明B、TAMRA(6-羧基-四甲基-罗丹明)、Cy-3、Cy-5、德克萨斯红、Alexa Fluor,DAPI (4, 6- 二咪基-2-苯基吲哚)、HEX、ΤΕΤ、Dabsyl和FAM)、发光标记物、化学发光标记物、FRET (荧光共振能量转移)标记物或金属标记物(例如金和银)。为了使用可检测标记的蛋白抗原或候选抗体，可以通过由标记物产生的信号来分析蛋白抗原与抗体的结合。当使用碱性磷酸酶时，可以使用溴氯吲哚磷酸(BCIP)、硝基四氮唑蓝(NBT)、萘酚-AS-Bl-磷酸盐和ECF (增强化学发光物)作为底物；在使用辣根过氧化物酶的情况下，可以使用氯萘酚、氨基乙基咔唑、二氨基联苯胺、D-萤光素、光泽精(双-N-甲基吖啶硝酸酯)、试卤灵苯甲基醚、发光氨、Amplex红试剂(10-乙酰基_3，7_ 二羟基吩噁嗪，Pierce)、HYR(对苯二胺-HCL和邻苯二酚)、TMB (3，3，5，5-四甲基联苯胺)、ABTS (2， 2-吖嗪-二 [3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯])、OPD (邻苯二胺)和萘酚/派洛宁作为底物。可选地，蛋白抗原与抗体的结合可以不需标记相互作用物来测量。例如，可以使用微生理记录仪来分析抗体与抗原的结合。微生理记录仪是使用LAPS (光可寻址电位测定传感器)测定细胞的环境酸化率的装置。酸化率的改变可用作候选抗体与蛋白抗原结合的指示物(33)。候选抗体与蛋白抗原的结合能力可以通过实时BIA(生物分子相互作用分析) 来测定(34，35)。BIA是不需标记相互作用物的特异性相互作用实时分析技术(例如 BIAcore )。使用SPR(表面等离子体共振)的变化作为分子间实时反应的指示物。在本发明的另一方面，提供了用于制备针对蛋白抗原的抗体的方法，所述方法包含下列步骤(a)将⑴免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的蛋白抗原的肽包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中；(b)用所述包胶有⑴免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽的脂质体免疫非人类动物；以及(c)通过分析所述被免疫非人类动物的免疫应答来筛选具有免疫原性的肽表位；(d)通过用所述筛选到的肽表位免疫非人类动物来生产抗体。根据本发明，从被免疫动物获得抗体的步骤通过本技术领域的专业人员已知的各种不同方法来剂型，所述方法包括乙醇沉淀方法、离子交换吸附层析或蛋白A或蛋白G柱层析。可选地，可以使用结合有特异性抗原的琼脂糖珠通过吸附层析从哺乳动物血浆分离纯的免疫球蛋白。可选地，还可以从具有从外周血淋巴结或B细胞获得的抗体蛋白的遗传信息的cDNA文库获取免疫球蛋白信息。根据所述信息，可以通过遗传工程方式制备免疫球蛋白。通过上述方法制备的遗传重组免疫球蛋白含有哺乳动物免疫球蛋白氨基酸或人源化遗传重组免疫球蛋白的基本序列及其部分突变(Vaughan TJ等，“人类抗体设计”(Human antibodies design)，Nature Biotech 16:535-539(1998))。纯化的抗体在使用前可以储存在冰上。此外，本发明的方法可以另外包含通过从被免疫动物捕获B细胞来产生单克隆抗体、人源化抗体或亲和成熟抗体的步骤。在本发明的另一方面，提供了针对甲型流感病毒的肽类疫苗组合物，其包含选自 SEQ ID NO :1 至 SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 19 M SEQ ID NO 37 的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供了针对人类整合蛋白β 4的肽类疫苗组合物，其包含选自SEQ ID NO 42至SEQ ID NO 46的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供了针对肝癌的肽类疫苗组合物，其包含选自SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供了针对丙肝病毒的肽类疫苗组合物，其包含SEQ ID NO 12的氨基酸序列。在本发明的另一方面，提供了针对RSV (呼吸道合胞病毒)的肽类疫苗组合物，其包含选自SEQ ID NO 13禾口 SEQ ID NO 38至SEQ ID NO 41的氨基酸序列。
由于本发明的肽类疫苗在描述免疫刺激性组合物中已经提到过，因此在这里为了避免过度重复而将其省略。在本发明的另一方面，提供了用于预防或治疗甲型流感病毒传染病、癌症、肝癌、 丙型肝炎或RSV(呼吸道合胞病毒)传染病的方法。本发明的特点和优点概述如下(a)本发明提供了用于增强免疫应答的组合物、具有免疫原性的表位、其筛选和制备方法、针对肽抗原的抗体及其筛选和制备方法。(b)本发明可以有效用于通过增强免疫应答来预防或治疗各种免疫缺陷疾病，例如癌症、流感病毒、丙肝病毒和RSV(呼吸道合胞病毒)。现在将通过实施例对本发明进行进一步详细描述。对于本技术领域的专业人员来说，显然这些实施例的目的在于更具体地说明，而在随附的权利要求书中提出的本发明的范围不限于实施例或受实施例所限。
实施例实施例1 寡脱氧核苷酸和试剂ODN(寡脱氧核苷酸)从 Samchully Pharm(Seoul，韩国)合成。MB-ODN 4531 由 20的碱基构成，含有三个CpG基序(下划线)AGCAG￡eTT￡eTGT￡eGCCT。在本研究中使用的MB-ODN 4531序列是磷酸二酯(0)或硫代磷酸酯(S)修饰的。MB-ODN 4531(0)的硫代磷酸酯形式是MB-ODN 4531 (S)。MB-ODN 453IGC是MB-ODN 4531的衍生物，其中一个CG序列被倒置成GC (下划线)AGCAG^eTTCGTGTCGGCCT。将荧光或生物素标签偶联到每个ODN的 3，末端。ODN 的内毒素含量当通过 Limulus amebocyte 测定法(ffhittaker Bioproducts, ffalkersville, MD, USA)测量时，小于 Ing/mgODN。表1.合成的ODN衍生物
ODN__修饰
MB-ODN 4531 (O) AGCAGCGTTCGTGTCGGCCT无
MB-ODN 4531 (GCO) AGCAGGCTTCGTGTCGGCCT无MB-ODN 4531 (S) AGCAGCGTTCGTGTCGGCCTS MB-ODN 4531 (S) T13 AGCAGCGTTCTTGS MB-ODN 4531 (S) CT AGCAGCGTTCTTGTCGGCCTS MB-ODN 4531 (S) CS AGGCCGACAAGAACGCTGCTSCG 二核苷酸向GC或CT的改变用下划线的粗体字母标出。MB-0DN4531 (S)CS是 MB-ODN 4531的互补序列。无，磷酸二酯骨架连接；S，硫代磷酸酯骨架修饰实施例2 候选表位的选择和肽的合成根据亲水性、疏水性、二级结构、抗原性指数、两亲性来选择肽序列。为了鉴定基于表位的肽的效应，我们从几个甲型流感病毒毒株的HA蛋白(表2、3、4、5、6、7、8和9)、肝癌的hTM4SF5(人类四次跨膜蛋白4超家族成员5)蛋白、丙肝病毒的包膜蛋白、RSV(呼吸道合胞病毒)的黏附(G)糖蛋白(G(hRSV-G))(表10)、RSV的融合蛋白(HRSV-F)(表11和 12)和人类整合蛋白i34(hIB4)(表13)合成了长为14或17个氨基酸的肽。甲型流感病毒 HA蛋白的氨基酸序列根据与人类H3序列(A/Aichi/^2/68)的比对进行编号。肽通过Fmoc 固相方法，使用自动肽合成仪(Patron III-R24，Peptron, Daejeon，韩国)来合成。在将合成的肽从树脂上去保护后，通过反相HPLC(Waters 2690 Separations Module, Waters, Milford, USA)，使用Vydac C8分析型RP柱对肽进行纯化和分析，达到纯度> 90%。使用质谱仪(HP 1100 Series LC/MSD, Hewlett-Packard, Roseville, USA)对Jft进行鉴定。表2. A/Viet Nam/1203/2004hH5Nl HA 蛋白的候选表位
毒株__位置缩写_
ILEKKHNGKLC58-68hH5Nl HA58 CYPGDFNDYEELK113-125hH5Nl HAl 13 IATRSKVNGQSGRM233-246hH5Nl HA233 LRNSPQRERRRKKRG336-350hH5Nl HA336 A/Vietnam/1203 VDGWYGYHHSNEQGSGYA363-380hH5Nl HA363 /2004 H5N1 HHSNEQGSGYAADKEST370-386hH5Nl HA370 SGYAADKESTQKAIDGVT377-394hH5Nl HA377 ESTQKAIDGVTNKVNSII384-401hH5Nl HA384 QKAIDGVTNKVNSI387-400hH5Nl HA387 _TNKVNSIIDKMNTQ_394-407hH5Nl HA394根据亲水性、疏水性、二级结构、抗原性指数、两亲性，从A/Vietnam/1203/2004 H5N1 HA蛋白(NCBI数据库AAW80717)中选择用于表位筛选的肽序列(http //tools. immuneepitpoe. org/main/index. html)。 A/Vietnam/1203/2004hH5Nl HA 蛋白的氨基酸序列根据与人类H3序列(A/Aichi/2/68)的比对进行编号。表3.对应于hH5Nl HA370表位的序列在甲型流感病毒H5W和Hmi毒株中的保守性
19
权利要求
1.一种用于增强免疫应答的组合物，所述组合物作为活性成分包含了包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中的(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)表位。
2.权利要求1的组合物，其中阴离子型表面活性剂选自磷脂酰甘油、心磷脂、磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酰丝氨酸、磷酸二鲸蜡酯、磷脂酸、二酰基磷脂酸、油酸、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、NSPE (N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺)、NGPE (N-戊二酰磷脂酰乙醇胺)、LPG (赖氨酰磷脂酰甘油)和CHEMS(胆留醇半琥珀酸酯)。
3.权利要求2的组合物，其中阴离子型表面活性剂是CHEMS(胆留醇半琥珀酸酯)。
4.权利要求1的组合物，其中中性磷脂选自磷脂酰胆碱、DPPC(二棕榈酰磷脂酰胆碱)、 DSPC(1, 2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、DMPC(二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱)、胆甾醇、 PEG-PE (聚乙二醇磷脂酰乙醇胺)、D0PC(二油酰磷脂酰胆碱)和DOPE (二油烯基磷脂酰乙醇胺)。
5.权利要求4的组合物，其中中性磷脂是DOPE(二油烯基磷脂酰乙醇胺)。
6.权利要求1的组合物，其中脂质体是CHEMS和DOPE的混合物。
7.权利要求6的组合物，其中脂质体含有摩尔比为4.5 5. 5至5. 5 4.5的DOPE和 CHEMS。
8.权利要求7的组合物，其中DOPE与CHEMS的摩尔比为5.0 5.0。
9.权利要求1的组合物，其中免疫刺激性寡核苷酸具有磷酸二酯骨架或硫代磷酸酯骨^K O
10.权利要求9的组合物，其中免疫刺激性寡核苷酸含有CpG基序、CpT基序、多个G的结构域或形成发夹二级结构的回文序列。
11.权利要求1的组合物，其中表位是具有选自SEQID NO :1至SEQ ID NO 13和SEQ ID NO 19至SEQ ID NO 46的氨基酸序列的肽表位。
12.一种用于具有免疫原性的表位的筛选方法，所述方法包含下列步骤(a)将(i)免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中；(b)用所述包胶有(i)免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽的脂质体免疫非人类动物；(c)分析所述被免疫非人类动物的免疫应答。
13.一种用于针对蛋白抗原的抗体的筛选方法，所述方法包含下列步骤(a)将(i)免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的蛋白抗原的肽包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中；(b)用所述包胶有(i)免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽的脂质体免疫非人类动物；以及(c)通过分析所述被免疫非人类动物的免疫应答来筛选具有免疫原性的肽表位；(d)将所述筛选到的肽表位与待分析的目标抗体相接触；(e)将步骤(d)的结果与所述蛋白抗原相接触；以及(f)分析所述蛋白抗原与目标抗体的结合。
14.一种用于制备针对蛋白抗原的抗体的方法，所述方法包含下列步骤(a)将(i)免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的蛋白抗原的肽包胶在含有阴离子型表面活性剂和中性磷脂的脂质体中；(b)用所述包胶有(i)免疫刺激性寡核苷酸和(ii)作为表位候选材料的肽的脂质体免疫非人类动物；以及(C)通过分析所述被免疫非人类动物的免疫应答来筛选具有免疫原性的肽表位； (d)通过用所述筛选到的肽表位免疫非人类动物来生产抗体。
15.权利要求12至14任一项的方法，其中阴离子型表面活性剂是CHEMS(胆留醇半琥珀酸酯)。
16.权利要求12至14任一项的方法，其中中性磷脂是DOPE(油烯基磷脂酰乙醇胺)。
17.权利要求12至14任一项的方法，其中脂质体是CHEMS和DOPE的混合物。
18.权利要求12至14任一项的方法，其中脂质体含有摩尔比为4.5 5.5至5.5 4.5 的 DOPE 禾口 CHEMS。
19.权利要求12至14任一项的方法，其中DOPE与CHEMS的摩尔比为5.0 5. 0。
20.权利要求12至14任一项的方法，其中免疫刺激性寡核苷酸含有CpG基序、CpT基序、多个G的结构域或形成发夹二级结构的回文序列。
21.—种针对甲型流感病毒的肽类疫苗组合物，其包含选自SEQ ID NO :1至SEQ ID NO 9 和 SEQ ID NO 19 M SEQ ID NO 37 的氨基酸序列。
22.—种针对人类整合蛋白β 4的肽类疫苗组合物，其包含选自SEQ ID NO :4至SEQ ID NO 46的氨基酸序列。
23.—种针对肝癌的肽类疫苗组合物，其包含SEQ ID Ν0:10和SEQ ID Ν0:11的氨基酸序列。
24.一种针对丙肝病毒的肽类疫苗组合物，其包含SEQ ID NO :12的氨基酸序列。
25.—种针对RSV (呼吸道合胞病毒)的肽类疫苗组合物，其包含SEQ ID Ν0:13和SEQ ID NO 38至SEQ ID NO 41的氨基酸序列。
26.一种用于预防或治疗甲型流感病毒传染病的方法，所述方法包含向对象给药权利要求21的组合物。
27.一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包含向对象给药权利要求22的组合物。
28.一种用于预防或治疗肝癌的方法，所述方法包含向对象给药权利要求23的组合物。
29.一种用于预防或治疗丙型肝炎的方法，所述方法包含向对象给药权利要求M的组合物。
30.一种用于预防或治疗RSV(呼吸道合胞病毒)传染病的方法，所述方法包含向对象给药权利要求25的组合物。
全文摘要
本发明涉及用于增强免疫应答的组合物、具有免疫原性的表位、其筛选和制备方法、针对肽抗原的抗体及其筛选和制备方法。本发明的组合物可用于通过增强免疫应答来预防或治疗各种免疫缺陷疾病，例如癌症、流感病毒、丙肝病毒和RSV(呼吸道合胞病毒)。
文档编号A61P37/00GK102481309SQ201080032046
公开日2012年5月30日 申请日期2010年6月16日 优先权日2009年7月17日
发明者权滢周 申请人:翰林大学校产学协力团