专利名称：应用生物反应器制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法
技术领域：
常规的用旋转瓶单层培养细胞制备疫苗的方法，有占用洁净空间大，所用操作人 员多，易污染微生物等缺点，而常规方法制备的乙型脑炎疫苗纯度不够，残余宿主蛋白和宿 主DNA等不容易达到较低水平；而本发明涉及的应用生物反应器制备乙型脑炎纯化疫苗的 方法，达到了较高纯度。
背景技术：
由于传统的转瓶单细胞层培养有着占用空间大，劳动量大，所需瓶数量多，容易污 染微生物，耗能大，产生污物多等缺点，而常规方法制备的乙型脑炎疫苗纯度不够，残余宿 主蛋白和宿主DNA等不容易达到较低水平；而本发明涉及的应用生物反应器制备乙型脑炎 纯化疫苗的方法，达到了较高纯度。
发明内容
一种应用生物反应器培养细胞，培养乙型脑炎病毒，经浓缩，灭活，纯化后制备高 纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法。应用微载体生物反应器培养细胞制备病毒，可用浓度为10 25g/L球状微载体， 也可应用浓度为10 60g/L片状微载体。病毒收获期可达到5 15天，所收获的病毒液 为病毒收获液。病毒收获液先经过30 100倍超滤浓缩后制备成病毒浓缩液，再加入灭 活剂灭活后制备后制备成灭活病毒浓缩液。灭活病毒浓缩液，经加入终浓度最高可为大于 2. Omg/ml至小于等于4. Omg/ml的硫酸鱼精蛋白处理后lOOOOg离心5 lOmin收集病毒上 清液。病毒上清液，应用区带转头，蔗糖密度梯度，28001 35000rpm区带离心4 8h，经 紫外检测仪检测280nm紫外吸收值，收集抗原蛋白峰。抗原蛋白峰位于40% 46%的蔗糖 浓度范围，且和杂蛋白峰分开良好。所收集的抗原蛋白峰的蔗糖溶液经超滤除糖后，配制成 高纯度的乙型脑炎纯化疫苗。根据本制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，制备的高纯度的乙型脑炎纯化疫 苗，其宿主DNA残留量达到不高于10pg/剂，总蛋白含量可达到0. 5 3 y g/剂，宿主蛋白 含量可达到20 50ng/剂。并且在整个制备工艺中不添加任何的防腐剂，抗生素，佐剂。
图1应用生物反应器制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的工艺图 具体实施方案本发明为一种应用生物反应器培养细胞，培养乙型脑炎病毒，经浓缩，灭活，纯化 后制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法。应用微载体生物反应器培养细胞制备病毒，可用浓度为10 25g/L球状微载体， 也可应用浓度为10 60g/L片状微载体。病毒收获期可达到5 15天，所收获的病毒液为病毒收获液。病毒收获液先经过30 100倍超滤浓缩后制备成病毒浓缩液，再加入灭 活剂灭活后制备后制备成灭活病毒浓缩液。灭活病毒浓缩液，经加入终浓度最高可为大于 2. Omg/ml至小于等于4. Omg/ml的硫酸鱼精蛋白处理后lOOOOg离心5 lOmin收集病毒上 清液。病毒上清液，应用区带转头，蔗糖密度梯度，28001 35000rpm区带离心4 8h，经 紫外检测仪检测280nm紫外吸收值，收集抗原蛋白峰。抗原蛋白峰位于40% 46%的蔗糖 浓度范围，且和杂蛋白峰分开良好。所收集的抗原蛋白峰的蔗糖溶液经超滤除糖后，配制成 高纯度的乙型脑炎纯化疫苗。
根据本制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，制备的高纯度的乙型脑炎纯化疫 苗，其宿主DNA残留量达到不高于10pg/剂，总蛋白含量可达到0. 5 3 y g/剂，宿主蛋白 含量可达到20 50ng/剂。并且在整个制备工艺中不添加任何的防腐剂，抗生素，佐剂。
权利要求
一种应用生物反应器培养细胞，培养乙型脑炎病毒，经浓缩，灭活，纯化方法高度纯化乙型脑炎纯化疫苗的方法。
2.根据权利要求1所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，其所用的微载体可为 浓度为10 30g/L球状微载体，也可为浓度为10 60g/L片状微载体。
3.根据权利要求1所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，其病毒收获期可达到 5 15天，所收获的病毒液为病毒收获液。
4.根据权利要求3所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，其病毒收获液先经过 30 100倍超滤浓缩后制备成病毒浓缩液，再加入灭活剂灭活后制备成灭活病毒浓缩液。
5.根据权利要求4所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，其灭活病毒浓缩液， 经加入终浓度可为大于2. Omg/ml至小于等于4. Omg/ml的硫酸鱼精蛋白处理后lOOOOg离 心5min收集病毒上清液。
6.根据权利要求5述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，其病毒上清液，应用区 带转头，铺设30% 36%和50% 60%两个蔗糖密度梯度，28001 35000rpm区带离心 4 8h，经紫外检测仪检测280nm紫外吸收值，收集抗原蛋白峰。抗原蛋白峰位于40% 46 %的蔗糖浓度范围，且和杂蛋白峰分开良好。
7.根据权利要求6所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，所收集的抗原蛋白峰 的蔗糖溶液经超滤除糖后，配制成高纯度的乙型脑炎纯化疫苗。
8.根据权利要求1 7中任意一项所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，制备 的高纯度的乙型脑炎纯化疫苗，其宿主DNA残留量达到不高于10pg/剂，总蛋白含量可达到 0. 5 3 ii g/剂，宿主蛋白含量可达到20 50ng/剂。
9.根据权利要求1 7中任意一项所述的制备高纯度乙型脑炎纯化疫苗的方法，在整 个制备工艺中不添加任何的防腐剂，抗生素和佐剂。
全文摘要
应用生物反应器制备高纯度乙型脑炎疫苗。应用微载体生物反应器培养细胞制备病毒，连续收获5～15天，病毒收获液先经过30～100倍超滤浓缩，灭活，加入硫酸鱼精蛋白处理后10000g离心5min，上清液再用两个蔗糖密度梯度，28001～35000rpm超速区带离心4～8h，收集抗原蛋白峰，经超滤除糖后，配制成高纯度的乙型脑炎纯化疫苗。本方法制备的高纯度的乙型脑炎纯化疫苗，其宿主DNA残留量达到≤10pg/剂，总蛋白含量可达到0.5～3μg/剂，宿主蛋白含量可达到20～50ng/剂。并且在整个制备工艺中不添加任何的防腐剂，抗生素和佐剂。
文档编号A61K39/12GK101804201SQ20101010258
公开日2010年8月18日 申请日期2010年1月29日 优先权日2010年1月29日
发明者杨国松 申请人:福尔生物制药股份有限公司