专利名称：沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及沙苑子黄酮在治疗疾病中的应用，具体涉及沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用。
背景技术：
沙苑子为豆科植物扁茎黄芪的干燥成熟种子，据相关文献报道沙苑子具有抗炎、镇痛、调脂、增强免疫能力及影响心脑血管活动等多种药理作用。沙苑子黄酮是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保护肝细胞、抑制肝纤维化形成的作用。如中国专利(申请号CN200310106429，申请日2003-11-6)公开了沙苑子及沙苑子黄酮在制备抗肝纤维化及抗癌药物中的应用，同时公开了从沙苑子中提取沙苑子黄酮的工艺以及沙苑子黄酮含量的测定方法。
本发明人在科研及教学研究过程中发现沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物也有特殊的效果，因此，业界需要一种有关沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用的研究成果来推动相关疾病诊断和治疗的技术进步。
发明内容
本发明提供了沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用，具有开创性的意义。
本发明解决现有技术问题所采用的技术方案是沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用。
进一步的，所述沙苑子黄酮纯度为≥70％。
进一步的，所述沙苑子黄酮纯度为80％。
进一步的，制备抗衰老药物及抗白血病药物。
进一步的，所述药物为含治疗有效量的沙苑子黄酮和药学上可接受的载体。
实验证明，本发明的有益效果是，能调节免疫能力和提高耐氧能力，能抑制白血病细胞HL-60和L1210的生长。
图1是不同剂量的FAC作用于HL-60不同时间后对细胞的增殖抑制作用。其中X坐标轴中1、2、3、4、5分别表示不同浓度的FAC(0.032mg/ml、0.063mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml)作用6小时、12小时、24小时、36小时、48小时后，对HL-60细胞的增殖抑制作用。
图2用0.25mg/ml FAC处理HL-60不同作用时间后流式细胞分析结果。图2A表示对照组凋亡率4.9％；图2B、图2C、图2D分别在0.63mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml浓度FAC作用后36小时其细胞凋亡率分别为38.3％，49.6％，57.9％。
图3不同剂量FAC对荷瘤小鼠生命延长的影响。图中1、2、3分别表示第一、二、三次重复实验结果；CTX表示阳性对照药环磷酰胺给药组，FAC-1表示小剂量组(50mg.kg-1.d)，FAC-2表示中剂量组(100mg.kg-1.d)，FAC-3表示大剂量组(200mg.kg-1.d)。
图4FAC对CTX所致小鼠骨髓抑制作用的保护。Normal表示正常对照组，Control表示使用荷瘤对照组，CTX表示用环磷酰胺治疗的荷瘤小鼠，FAC+CTX表示用用环磷酰胺和沙苑子提取物同时使用的实验组。
具体实施例方式 下面结合附图详细说明本发明的具体实施方式
。
首先制备是沙苑子黄酮的制备先称取一定量沙苑子，分别加5-9倍沙苑子量的65-75％的乙醇提取，提取液回收乙醇，加水搅拌后静置离心，取离心液，过DM130大孔树脂，洗脱，解析。解析后浓缩、干燥。干膏加85-95％乙醇提取，提取液浓缩干燥的纯度为≥70％的沙苑子黄酮，较佳地纯度为80％。
实施例一沙苑子黄酮对D-半乳糖所致亚急性衰老模型小鼠抗衰老作用研究 1.对SOD、MDA以及胸腺指数、脾指数的影响取ICR小鼠60只，随机分为6组，即正常对照组(NG)，模型对照组(MG，)，阳性药对照组(VE，25mg·kg-1d-1)，FAC高剂量组(FAC-H，200mg·kg-1·d-1)、中剂量组(FAC-M，100mg·kg-1d-1)及低剂量组(FAC-L，50mg·kg-1·d-1)。除正常对照组外，使用D-gal按120mg·kg-1·d-1小鼠背部皮下注射(sc)连续30d，造成亚急性衰老模型。从造模的第21d开始，高、中、低剂量组分别灌服(ig)相应浓度的FAC，连续10d。末次给药后30min眼眶取血，按照测试盒要求检测并比较6组小鼠的超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)；测定小鼠的胸腺指数、脾指数。
结果表明，高、中剂量组FAC对于衰老模型小鼠SOD活力具有明显提高作用，与模型组比较差异具有显著性(**p＜0.01，vs control)；低剂量组FAC对于衰老模型小鼠也具有显著提高SOD活力的作用，与模型组比较差异具有统计学意义(*p＜0.05，vs control)；不难看出，FAC提高衰老模型小鼠SOD活力作用，与其剂量呈依赖关系。高、中、低剂量组FAC作用后，衰老模型小鼠MDA含量明显下降，与模型组比较差异具有显著性(**p＜0.01，*p＜0.05，vs control)；数据还显示，FAC降低衰老模型小鼠MDA含量作用，与其剂量呈依赖关系。提示FAC具有提高衰老模型小鼠的抗氧化能力，其中大剂量FAC组的抗氧化能力与阳性药维生素E组相似(^^p＞0.05，vs Vitamin E group)。另外，高、中、低剂量组FAC能明显提高衰老模型小鼠脾脏指数与胸腺指数，与模型组比较，差异具有显著性(p＜0.01，p＜0.05)。提示FAC对衰老模型小鼠的免疫力具有一定调节作用。见表1。
表1不同剂量FAC对亚急性衰老模型小鼠的相关指标的影响(x±s，n＝27) Tabl the effects of anti-aging on aging model mice induced by D-gal treating with FAC in different concentration(x±s，n＝27)
&p＜0.01，vs normal；**p＜0.01，*p＜0.05，vs control；^^p＞0.05，vs Vitamin E group. 2.FAC对衰老模型小鼠常压耐缺氧能力的影响取ICR小鼠60只，24h后随机分为6组，每组10只。分组方法同前。模型组、阳性药对照组、FAC实验组背部s.c.0.12g/kg.d，D-gal，共30d；正常对照组背部s.c.等体积0.9％NacL溶液共30d；从造模第21d始，对照组与模型组给予等体积0.9％NacL.ig.q.d.；高、中、低剂量组分别以FAC(200，100，50mg·kg-1·d-1)ig.q.d.连续10d。阳性药给予25mg·kg-1·d-1。末次给药30min后，将小鼠放入盛有5g钠石灰的250ml广口瓶中，瓶口涂以凡士林，加盖密封，记录小鼠存活时间。实验重复3次。
结果表明，高、中剂量组FAC能显著延长衰老模型小鼠在缺氧条件下的存活时间，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.01，vs control)；低剂量组FAC也能明显延长衰老模型小鼠在缺氧条件下的存活时间，与对照组比较差异具有统计学意义(p＜0.05，vs control)。提示FAC能提高衰老模型小鼠的耐缺氧能力，其中大剂量FAC组的耐缺氧能力与阳性药维生素E组相似(^^p＞0.05，vsVitamin E group)。见表2。
表2不同剂量FAC对亚急性衰老模型小鼠的抗缺氧能力、应激能力影响(x±s，n＝27) Tab2 the effects of anti-stress on D-gal induced model mice aftertreated with FAC in different concentration(x±s，n＝27)
**p＜0.01，*p＜0.05，vs control.^^p＞0.05，vs Vitamin E group. 3.FAC对衰老模型小鼠常温游泳时间的影响取ICR小鼠60只，分组及处理方法同1。末次给药30min后，将小鼠尾根部系上胶泥(重量为小鼠体重的15％)置于水温28℃、水深50cm的水池内，分别记录各小鼠自入水开始到小鼠疲劳下沉死亡时间。实验重复3次。
结果表明，FAC高、中剂量实验组显著延长衰老模型小鼠常温游泳时间，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.01)，小剂量组FAC也能明显延长衰老模型小鼠常温游泳时间，与对照组比较差异具有显著性(p＜0.05)；提示FAC可以提高衰老模型小鼠的耐疲劳能力。见表2。
实施例二沙苑子黄酮对衰老模型小鼠的自由基代谢及免疫力的影响 取ICR小鼠60只，随机分为6组，即正常对照组(NG)，模型对照组(MG，)，阳性药对照组(VE，25mg·kg-1·d-1)，FAC高剂量组(FAC-H，200mg·kg-1·d-1)、中剂量组(FAC-M，100mg·kg-1·d-1)及低剂量组(FAC-L，50mg·kg-1·d-1)。除正常对照组外，使用D-gal按120mg·kg-1·d-1小鼠背部皮下注射(sc)连续30d，造成亚急性衰老模型。从造模的第21d开始，高、中、低剂量组分别灌服(ig)相应浓度的FAC，连续10d。末次给药后30min眼眶取血，按照测试盒要求检测并比较6组小鼠的自由基代谢〔超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醇(MDA)、一氧化氮(NO)水平〕及免疫力指标〔胸腺指数(SI)、脾脏指数(TI)、碳廓清指数(K)及淋巴细胞转化率(用570nm测得OD值A)〕。实验重复3次，取统计学结果。结果表明，FAC作用后能明显提高衰老小鼠血中SOD活性，降低MDA和NO含量，与模型对照组比较差异具有显著性(P＜0.01)；其大剂量组与阳性药维生素E作用相近(P＞0.05)。见表3。FAC作用后衰老模型鼠的免疫器官湿重指数明显增加，与模型对照组比较差异具有显著性(P＜0.01)；与阳性药VE组比较作用差异无显著性(P＞0.05)。FAC能提高巨噬细胞吞噬功能、淋巴细胞转化率，与模型对照组比较差异具有显著性(P＜0.05)，与阳性药VE组比较差异具有显著性(P＜0.05)。见表4。
表36组小鼠血清SOD活力及MDA、NO水平比较(x±s) Table 1 Comparison of six groups mice in serum SOD activity and MDA，NO levels(x±s)
经方差分析，组间比较与NG组比较，aP＞0.05，bP＜0.01；与MG组比较，cP＜0.01；与VE组比较，dP＞0.05. 表46组小鼠免疫力指标比较(x±s) Table 2 Comparison of six indicators of immunity in mice(x±s)
注SI＝脾脏指数，TI＝胸腺指数，K＝碳廓清指数，A＝570nm处的OD值， 代替淋巴细胞转移率；与NG组比较，aP＜0.01，bP＞0.05；与MG比较，cP＜0.05；与VE组比较，dP＞0.05，eP＜0.05. 实施例三沙苑子黄酮对白血病细胞K562体外生长的抑制作用四噻唑蓝(MTT)法 取对数生长期K562细胞离心后，用培养基调整细胞浓度为2×105/ml，接种于96孔培养板中，并进行分组给药组加入FAC(终浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.0625mg/ml)，正常对照组加入等体积培养基，阳性对照组加5-Fu，每组均设4个平行孔，1个对照孔。分别培养12h、24h、48h、72h。实验终止培养前4h加入MTT(5mg/ml，PBS配制，过滤除菌)，10μl/孔，培养结束后每孔加入酸化的10％SDS 100μl，放置12小时后，于酶标仪检测波长为570nm处测定OD值为A。重复3次。测定FAC对白血病细胞的生长抑制作用。肿瘤细胞生长抑制率(Inhibition Rate，IR)按以下公式计算 IR(％)＝[(A对照组-A实验组)/A对照组]×100％ 实施例四沙苑子黄酮对白血病细胞HL-60体外生长的抑制作用 1.SRB法测定沙苑子黄酮对HL-60的增殖抑制作用取对数生长期细胞离心后，调整细胞浓度为2×105/ml，接种于96孔培养板中，并进行分组给药组加入FAC(终浓度分别为0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.063mg/ml、0.031mg/ml)，阴性对照组加入等体积培养液，阳性对照组加5-Fu，每组均设4个平行孔，分别培养6h、12h、24h、36h、48h后每孔加入预冷的80％三氯醋酸(TCA)50μl使TCA终浓度为10％，固定半小时，加TCA时必须轻轻地加在培养液的表面，静置5分钟后再将平板移至4℃放置1小时，倒掉固定液，去离子水洗5遍后，晾干；每孔加入100μl的SRB，室温放置15分钟，1％醋酸洗5次，晾干；加入10mmol/L Tris液150μl，振荡2分钟以溶解SRB。用酶标仪在波长531nm处测定A值。计算肿瘤细胞增殖抑制率(IR)。
Inhibitory Rate(％)＝[(A对照组-A实验组)/A对照组]×100％ 研究结果表明FAC在0.032mg/ml浓度时，作用6小时、12小时、24小时、36小时后其作用与对照组相比，差异无显著性(p＞0.05)，只有在作用48小时后，与对照组相比差异有显著性(p＜0.05)；FAC在0.25mg/ml浓度时，作用6小时后其作用与对照组比较，差异无显著性(p＞0.05)，作用12小时、24小时后，与对照组相比有差异(p＜0.05)，作用36小时、48小时后，与对照组相比，差异有显著性(p＜0.01)。不同浓度的FAC(0.063mg/ml、0.125mg/ml、0.25mg/ml)FAC对HL-60细胞增殖有一定抑制作用，且在一定的范围内有呈剂量和时间依赖趋势。前面我们已经用MTT法研究了FAC对HL-60的作用[3]，本文又通过SRB法进一步确认了FAC对HL-60的增殖抑制作用。如表1；图1。
表1不同剂量的FAC作用于HL-60不同时间后对细胞的增殖作用的影响(x±SD，n＝4)
**p＜0001；*p＜0.05与对照组比较；△p＞0.05与阳性药对照组(5-Fu)比较。
2.流式细胞术检测FAC对HL-60的致凋亡作用取不同浓度FAC(0.25mg/ml、0.125mg/ml、0.063mg/ml、0.031mg/ml)处理36小时HL-60细胞，以及经过SRB法确认的对HL-60细胞增殖抑制作用最强的浓度0.25mg/mlFAC作用6小时、12小时、24小时、36小时、48小时后收集细胞，每个样本至少收集1×106个细胞，用PBS(磷酸盐缓冲液)洗2次，再用冷(4℃)70％乙醇1ml固定细胞悬液，过夜；离心去除上清，细胞重悬在0.4ml的PBS中，加10μl 5mg/ml RNaseA(Sigma公司产品)，37℃水浴处理1h；然后加50μL的溴化丙啶染色液(Propidium Iodide，PI，Sigma公司产品)，4℃染色过夜，上机检测。数据由Mulficyde软件分析处理。
研究结果显示，HL-60细胞经FAC 0.25mg/ml，0.125mg/kg，0.063mg/kg，0.031mg/ml作用36小时后，在流式细胞仪直方图上呈现明显不同的表现。阴性对照组HL-60细胞增殖活跃，S期细胞比率高(如图Fig.3-3A)，0.25mg/ml FAC作用36小时后，HL-60细胞都呈现出典型凋亡特征的亚二倍体(Ao)峰，凋亡率分别达到49.6％，57.9％，同时G2/M期细胞数量明显增多，说明FAC作用后可以引起HL-60细胞阻滞于G2/M。如表2；图2。
表2不同浓度FAC对HL-60作用36h后对细胞增殖周期的影响(x±S，n＝4)
**p＜0001；*p＜0.05与对照组比较。
表3FAC(0.25mg/ml)对HL-60作用不同时间后对细胞增殖周期的影响(x±SD，n＝4)
**p＜0001；*p＜0.05与对照组比较。
3.Hoechst染色检测FAC对HL-60的致凋亡作用离心收集对数生长期细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，可4℃过夜固定。离心去固定液，用PBS洗两遍，每次3分钟。洗涤期间用摇床晃动数次。离心后吸去大部分液体保留约50μL液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。均匀滴上0.5ml Hoechst33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，晾干。去染色液，用PBS洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时用摇床晃动。滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。激发波长350nm左右，发射波长460nm左右。结果表明，对照组染色质均匀，无浓缩、边集现象。而FAC处理组细胞核染色质明显的固缩、浓染、边集，符合发生凋亡的细胞形态学改变。
4.沙苑子黄酮对p53表达的影响取对数生长期HL-60细胞，接种于6孔细胞培养板中，使其终浓度为0.5mg/ml，在12h，24h，36h时间点分别收取细胞(1500rpm，5min)，加入1ml冰PBS(PH＝7.25)洗2次；4℃预冷的4％多聚甲醛固定10min；冰PBS洗3次(2000rpm，5min)；加1％BSA封闭1h；用含0.1％Triten X-100的PBS洗3次，每次5min；加一抗p53(1∶50)过夜；再用含0.1％Triten X-100的PBS洗3次，每次5min；加二抗(绿FITC1800)4℃放置1.5h；PBS洗3×5min；滴一滴于清洁的载玻片上，用荧光显微镜观察、摄片并计数。
免疫荧光法结果显示阴性对照组绿色荧光很少表达；与阴性对照组相比，给药组在12h、24h时绿色荧光有所增加，以在胞浆中较多；给药组在36h时后绿色荧光在核内表达明显增加。提示FAC给药后细胞核内p53蛋白表达增加，而且在一定的范围内其作用与时间有依赖性。
实例五沙苑子黄酮对白血病细胞L1210体内生长的抑制作用 1.沙苑子黄酮能抑制小鼠体内L1210生长小鼠淋巴性白血病细胞L1210；DBA/2(荷L1210)小鼠10只。随机分为5组，每组10只对照组、阳性药对照组、沙苑子黄酮高、中、低剂量组。饲养并给药10天，10天后，测定其腹围，每只测3次，求出平均值，作为一组数据，每组10只再求平均值。实验结果表明高剂量组与中剂量组FAC可以明显抑制小鼠L1210肿瘤的增殖，抑瘤率为51.93％～41.33％。与对照组相比，FAC高、中剂量组有显著抑制L1210小鼠腹水生长的作用，差异显著(p＜0.01)。其中大剂量组FAC的抑瘤作用接近CTX。两者抗肿瘤作用差异无显著性(p＞0.05)。见表4。
表4FAC对L1210荷瘤小鼠的肿瘤抑制率及生命延长率的影响(x±SD n＝30)
*p＜0.05，与对照组比较；**p＜0.01，与对照组比较。
2.FAC能明显延长白血病小鼠的预期寿命。分组方法同前，给药10天后停止给药，正常饲养，直至自然死亡，逐日观察并记录荷瘤小鼠存活状况，中午12点前死亡者记0.5天，中午12点后死亡者加记1天。求出各组小鼠的平均生存期(Mean Life-span)，并按下式计算生命延长率。实验结果表明，与正常组比较，FAC高、中剂量组预期寿命明显延长(p＜0.01)，高剂量组与中剂量组的寿命延长率明显高于阳性药物对照组(p＜0.01)。FAC对荷瘤小鼠寿命的延长显著高于环磷酰胺CTX组。见表4，图3。
3.沙苑子黄酮使荷瘤小鼠巨噬细胞吞噬能力加强。在抑制肿瘤生长实验小鼠处死前，尾iv1∶5的印度墨汁(1ml用生理盐水稀释至5ml)0.05mg/10g，分别在注射后2分钟(t1)和10分钟(t2)从眼球后静脉丛取血20μL，溶于0.1％的碳酸钠溶液2μL中摇匀，用721分光光度计于680nm处，测吸光度值OD1和OD2，计算碳廓清指数K值。结果表明，高剂量组FAC与对照组相比差异具有显著性(p＜0.01)，中剂量组FAC与对照组相比具有差异性(p＜0.05)，而小剂量FAC与对照组相比差异无显著性。高、中剂量组FAC与环磷酰胺组相比差异具有显著性，环磷酰胺组不能增加荷瘤小鼠的巨噬细胞吞噬能力，相反却有一定的抑制能力。见表4。
4.沙苑子黄酮能增强经PHA诱导的荷瘤小鼠淋巴细胞转化。取抑瘤实验小鼠脾脏，制成5×106/mL的小鼠脾细胞悬液。将该脾细胞悬液加入96孔培养板，每孔100μL再加入含PHA(10μg/mL)RPMI1640培养液100μL，每个样品设3个复孔，37℃、5％CO2培养箱中孵育。27h后每孔加入MTT(5mg/μL)10μL振荡器振荡1min，放入37℃、5％CO2培养箱反应3h。取出反应物，离心，弃上清，每孔加入二甲亚砜200μL，混匀，振荡器振荡5min，在酶标仪500nm下读取OD值。结果表明，FAC高、中剂量组与空白对照组比较，差异有显著性(P＜0.01)；小剂量组与对照组相比也有差异(p＜0.05)；环磷酰胺组与对照组相比差异无显著性(p＞0.05)。见表4。
5.沙苑子黄酮对CTX所致骨髓抑制具有一定保护作用。取小鼠40只，分为4组正常对照组(normal control)，生理盐水荷瘤小鼠组(tumor control)、CTX组(CTX 25mg/kg)及CTX加FAC组(FAC150mg/kg与25mg/kg合用)。取小鼠右侧股骨(femur)，除净软组织，用5mmol/L的CaCl210ml将骨髓冲入离心管中，置4℃冰箱30min，2500rpm离心15min，弃上清，将沉淀物加0.2mol/L的HClO45ml充分混匀，90℃加热15min，冷却过滤，滤液在260nm处测定紫外吸收值(OD260＝50μg/ml双链DNA)。取同一小鼠左侧股骨，除净软组织。用3％的醋酸10ml冲出全部骨髓，计数有核骨髓细胞。所得的结果乘以2.5×104即为一根股骨中的骨髓有核细胞数。结果表明，CTX可引起小鼠骨髓DNA含量以及有核细胞数明显减少，与正常对照组相比呈显著的骨髓抑制作用(p＜0.01)；FAC与CTX联合用药组小鼠骨髓的DNA含量及有核细胞计数明显高于正常对照组(p＜0.01)以及肿瘤对照组(p＜0.05)，提示FAC对CTX所致的骨髓损伤有一定的保护作用。见表5，图4。
表5FAC对CTX引起的骨髓抑制的影响(x±S，n＝18)
**p＜0.01，与正常对照组比较；##p＜0.01，与肿瘤对照组比较；△△p＜0.01，与CTX组比较 以上所述仅为本发明的较佳实施方式，本发明的保护范围并不以上述实施方式为限，但凡本领域普通技术人员根据本发明所揭示内容所作的等效修饰或变化，皆应纳入权利要求书中记载的保护范围内。
权利要求
1.沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用。
2.根据权利要求1所述的沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用，其特征在于所述沙苑子黄酮纯度为≥70％。
3.根据权利要求2所述的沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用，其特征在于所述沙苑子黄酮纯度为80％。
4.根据权利要求1所述的沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用，其特征在于制备抗衰老药物及抗白血病药物。
5.根据权利要求1所述的沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用，其特征在于所述药物为含治疗有效量的沙苑子黄酮和药学上可接受的载体。
全文摘要
本发明公开了沙苑子黄酮在制备抗衰老药物及抗白血病药物方面的应用，其药物为含治疗有效量的沙苑子黄酮和药学上可接受的载体。实验证明，本发明的有益效果是，能调节免疫能力和提高耐氧能力，能抑制白血病细胞HL-60和L1210的生长。
文档编号A61K31/352GK101766679SQ20101010221
公开日2010年7月7日 申请日期2010年1月27日 优先权日2010年1月27日
发明者韦翠萍 申请人:苏州卫生职业技术学院