专利名称：：重组人fus1和人il-12的双基因表达载体、脂质体复合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，具体涉及人FUSl和人hlL-12的双基因真核共表达重组质粒载体构建，其阳离子脂质体复合物的制备方法和用途。
背景技术：
：肺癌是当今世界各国常见的恶性肿瘤。也是全世界发病率和死亡率增长最快，对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤。目前，肺癌发病率和死亡率在男性均占第一位，在女性发病率占第2位，而死亡率占第一位，肺癌已成为人类的第一杀手。据WH0最新统计，每年全世界估计有超过200万新肺癌患者，死亡约180万人[1]。我国形势更为严峻。20世纪70年代以来的30年间，我国肿瘤死亡率呈明显上升趋势，70-90年代的20年间，肿瘤总的死亡率上升约30%，而肺癌死亡率上升幅度最为显著，达到111.85%，进入21世纪，肺癌已成为我国城市人口恶性肿瘤死亡原因的第一位。肺癌给患者本人及家庭造成极大痛苦，也占用了大量的社会资源和财富，肺癌已经成为人类面临的日益严重的公共卫生问题。各国政府都投入了大量的人力和物力，以期在肺癌研究领域有所突破。FUS1是在肺癌中新近发现的一种肿瘤抑癌基因，位于人类染色体3p21.3区，基因序列长3.3kb，含有3个外显子，编码110个氨基酸[2]。野生型FUSl是一种N-十四烷酰化的蛋白，FUSl基因的抑癌活性与蛋白质的N-十四烷酰化有关，FUS1蛋白的豆蔻酰化缺失突变使它丧失了抑制肺癌细胞生长、诱导肺癌细胞凋亡和抑制肺癌转移的作用[3]。最近的研究发现在100。/。的小细胞肺癌和82。/。的非小细胞病人中存在FUSl基因的表达异常W。体外实验证明FUS1基因转染肺癌细胞能明显诱导肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的生长，通过瘤内注入脂质体包裹FUS1基因复合物，在动物体内能明显抑制肺癌H1299和A549细胞皮下移植瘤；通过静脉注射脂质体包裹的FUS1基因复合物至A549转移模型的小鼠能够明显减少肺部肿瘤转移灶的数量[5]。美国AndersonCancer近期研究结果报道^，脂质体包裹FUS1基因复合物的I期临床实验取得了很好的结果，在I期临床试验中处理了十三个病人，并未发现任何与药物相关的明显毒性。所有治疗的病人的中位生存期达到14.6月，而那些接受肺癌二线化疗药物治疗的肺癌病人，其中位生存期仅为7个月。在I期临床试验中未发现脂质体包裹FUS1基因的最大耐受剂量，进一步的临床试验尚在进行中。这些研究表明FUS1基因是一种很好的肿瘤转移抑制基因。此外，研究发现FUS1基因是肺癌发生过程中的早期基因，对于早期肺癌的发生和转移均具有很好的治疗前景。因此，FUS1基因在肺癌的发生和治疗中具有非常重要的作用，FUS1基因的异常有可能成为肺癌分子治疗的新突破点[7]。众所周知，白细胞介素12(又名NK细胞刺激因子和CTL成熟因子)，是诱导细胞免疫的关键细胞因子，能显著促进NK细胞、T细胞增殖，促进细胞毒T细胞(CTL)细胞的应答能力，诱导T细胞和NK细胞分泌IFN-y，促使Th细胞向Thl细胞分化等多种生物学活性W。近年来，大量的动物实验证明IL-12具有强大的抗瘤活性、抗转移作用以及延长荷瘤动物的生存时间[9]。鉴于IL-12的直接应用给机体带来了不同程度的毒副作用(发热、寒颤、恶心、呕吐等)，人们尝试着通过基因转染技术增强机体抗瘤免疫功能，以达到治疗肿瘤的目的。IL-12抗肿瘤的研究在美国已进入临床1期实验[1<)'11]。目前，IL-12基因治疗概括起来主要有两种方案体外免疫基因治疗方案和体内基因治疗方案。在体内基因治疗方案中，将携带IL-12基因的载体直接注射到肿瘤部位，以达到抑制肿瘤生长或使肿瘤完全消退、阻止恶性转移、抑制远处肿瘤生长的目的.将携带IL212基因的载体直接注射到肿瘤部位，以达到抑制肿瘤生长或使肿瘤完全消退、阻止恶性转移、抑制远处肿瘤生长的目的。目前面临的主要问题是如何选用合适的载体将治疗基因有效地导入体内或肿瘤内，在此方面很多学者先后进行多种尝试，研究使用的载体主要有质粒载体、病毒载体、非病毒载体等。常规疗法之下肺癌可怜的生存率要求有新的治疗方法的出现。因而，人们积极寻找手术、放疗、化疗以外的治疗肺部肿瘤的新方法。近年来，肺癌的基因治疗(包括替代缺陷的抑癌基因、灭活癌基因、引入自杀基因、免疫基因治疗、多药耐药基因治疗、肿瘤血管基因治疗等)取得了长足的进步，有的研究已进入临床实验阶段[12'13]。虽然这些疗法都能不同程度地抑制肺癌的恶性增殖，但临床效果不佳，原因颇多，其中之一在于肺癌的发生、发展是一个极为复杂的生物学过程，在这一进程中涉及到多基因(10到20个基因)的异常以及各种其他因素的作用[14]，其中包括抑癌基因的失活和癌基因的激活，即在肿瘤发生、发展的各个阶段，涉及到多个基因的变化，功能失常的癌基因发挥各自不同的作用，在时间和空间上互相配合、协同作用，激活细胞增殖或抑制细胞凋亡，使细胞发生癌变。而单一基因治疗只能作用于肿瘤发生、发展过程中的某一个环节，并且一种抗肿瘤基因的作用不够强大、作用又有限，无法抑制住肿瘤细胞增殖，因此，单一因素的纠正往往不能达到理想的抑制肺癌的效应，只有向肿瘤细胞内导入多种相关基因，最大限度的利用各个基因的优点，通过基因间的相互协同作用，以求优势互补，才能提高治疗效果，使肺癌得以抑制。此外，肺癌中已经取得成效的基因治疗途径多是局限在固体肿瘤，即通过瘤内注射的方式进行治疗，但是对于象肺癌这种全身性扩散的肿瘤，由于缺乏既能通过静脉较好地将基因传送到目的器官，同时又安全低毒的基因治疗的载体，这方面的研究进展还受到一定的限制。癌症基因治疗目前主要策略集中于三个方面，一是引入肿瘤凋亡调节基因，如p53，二是引入抑制肿瘤血管生长的基因，如endostatin，三是引入免疫基因，如IL-2。引入凋亡基因及血管生长抑制基因的有效性已被多数研究所证实，但其效应的发挥必须依赖于高效的转染效率和抑制作用的持续发挥，而采用免疫基因的优势在于只需要部分转染肿瘤细胞即可诱发肿瘤免疫，但在肿瘤负荷较大的情况下收效甚微。因此，目前基因治疗的一个理想的策略是采用多基因的联合治疗。肿瘤联合基因治疗就是联合应用几种不同机制的目的基因以求获得更佳的抗肿瘤效果。肿瘤的发生与发展的复杂性决定了基因治疗策略的多样性，在肿瘤的治疗中，可联合使用多个外源目的基因，使之发挥各自的作用，以达到协同治疗的目的，比采用单一基因进行治疗效果更加显著[15]。多基因联合治疗具有更大的合理性与优越性，将极大地提高肿瘤基因治疗的效果，将是肿瘤基因治疗发展的必然方向。目前在联合基因治疗中，一般基因联合的方式有两种一是多个携带不同基因的独立载体系统同时转染靶细胞[16'17]。这种方式虽然可以自由调节各表达载体的比例，但载体的选择、构建工作繁琐，影响因素较多，比如针对不同的基因要选择不同的载体，需要完成多轮构建过程[18]。为了实现治疗目的，还需要多个载体共同转染靶细胞，这样就大大降低了实现效率[19]。此外，多个目的基因转染至靶细胞时，由于转染过程存在一定的随机性，使得靶细胞中存在基因拷贝并不均一，有些过多，而有些正相反，这一方面不利于目的基因的表达及后续治疗，另一方面也导致实验结果难于评估分析[2<)'21]。因此，这些缺点限制了多载体系统的进一步应用。二是将两个或两个以上的基因由一个载体携带表达[22—24]。这种策略可以通过多启动子载体、融合基因或多顺反子载体等多种载体形式及调控手段提高基因转移效率，增加表达强度，维持相对的表达比例，从而克服了前者的不足。因为具备这些优点，近来利用多基因载体进行基因治疗得到了研究者的日益重视。在基因治疗研究中，多基因表达载体同样分为病毒载体和非病毒载体。在前者中，单纯疱疹病毒、逆转录病毒以及慢病毒等都可用于构建多基因表达载体。ShusukeMoriuchi等[22]报道利用单纯疱疹病毒分别构建了共表达胸苷激酶(TK)和TNF-a以及TK和IicBa的载体，均得到了显著提高肿瘤细胞杀伤疗效的结果。Gonzalez-Nicolini等。^以逆转录病毒为基础，构建了可在哺乳动物细胞中同时表达三种基因的载体，此外，JAKOBREISER等。^也成功构建出基于慢病毒的多基因表达载体用于艾滋病的治疗。非病毒载体主要以质粒载体为主，尽管质粒载体在转移效率上逊色于病毒载体，在靶细胞内的表达时间也不尽如人意，但其结构简单、易于制备、能携带较大片段的外源基因以及较病毒载体更为安全，这些优点为质粒载体赢得诸多研究者青睐。据统计，截至2007年，美国业已批准的基因治疗临床试验当中，以质粒为载体的研究仅次于逆转录病毒和腺病毒载体[27]。基于质粒的多基因表达载体，不少研究者也进行了这方面的尝试。如YuanZhang等。"以pcDNA3为基础，构建了CD-TK双自杀基因共表达系统，用于多要耐药的神经胶质瘤细胞的治疗研究，取得了满意的结果。腺病毒具有亲肺的特性，可感染分裂和非分裂细胞，在肺内转化的效率较高;不整合到染色体中，安全性较好。因Adv不会整合到宿主染色体中特点使其成为体内基因治疗和肺癌基因治疗最常用的一种方法[28]。其缺陷主要是因其不整合到染色体上，因而随细胞分裂会丢失，不能获得稳定而持久地表达;腺病毒编码蛋白可以激发机体的免疫反应，使病毒载体很快清除，同时由于全身用药可能产生致命的过敏反应，只能用于局部注射的肿瘤治疗.影响稳定的治疗效果，缺乏特异性[29]。通过腺病毒介到基因的局部肿瘤治疗虽然已经取得了一些成绩，但是由于病毒载体的毒性和不能有效将目的基因传送到耙器官，使用这种治疗方式用于治疗如肺癌，乳腺癌，结肠癌等这些全身扩散的肿瘤疾病显然存在一定的局限。因此，急需发展有效但不能激发机体免疫反应，能够全身给药的安全的基因治疗的载药系统.虽然，目前将治疗基因导入作用耙点的方式主要是病毒载体仍占主流，但由于非病毒载体主要是DNA的生物安全性和易于大规模制备，并且能够诱导良好的免疫反应，从而得到越来越广泛的重视和应用。脂质体是一种定向药物非病毒载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。利用其独有的特性，它可以将毒副作用大、在血液中稳定性差、降解快的药物包埋在直径为纳米级的脂质体微粒中，这种微粒具有类细胞结构，可以透过人体病灶部位血管内皮细胞间隙到达病灶部位，进入人体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低药物的毒性，以达到定向给药的目的。近年美国FDA已经批准上市的脂质体药物品种有两性霉素、多柔比星和柔红霉素，而阿霉素脂质体TLCD99、两性霉素B脂质体、庆大霉素脂质体和丁胺卡钠霉素等几个脂质体产品也已经进入临床试验。国内开发申报的注射用紫杉醇脂质体和注射用两性霉素B脂质体也已获准上市，还有十余种脂质体药物处于临床研究或技术审评阶段，但都是包裹化学合成药或蛋白制剂。由于脂质体的缓释作用和能够显著增强DNA的稳定性，同时，脂质体作为载体还可同时增强机体的体液免疫和细胞免疫能力，大大减少DNA的用量，因此，用脂质体包裹DNA用于疾病研究的报道越来越多，其中使用最广泛的是阳离子脂质体[3<)'31]。阳离子脂质体是近年发展起来的最有前途的非病毒载体，免疫原性低、毒性小、适合大批量生产，对其所转移的基因大小无限制，在实际应用中安全经济，已经进入I期临床实验"」'"」。阳离子脂质体与DNA除通过静电作用吸附外，还可能有效地中和带负电荷的DNA，从而导致DNA的结构上的相应"倒塌"，"倒塌"的DNA由于裸露的表面积变小，所以能够被脂质体有效地包住，从而更有利于防止核酸酶对DNA的降解以及复合物进入细胞。有研究表明阳离子脂质体特别适宜一些组织如肺肿瘤的基因转移。当静脉给予脂质复合物时，肺部肿瘤组织是目的基因表达水平最高的器官，这主要与呼吸道细胞对阳离子脂质的亲和性高有关。阳离子脂质体(liposomes)可通过膜融合作用或细胞吞噬作用将外源DNA转导入肿瘤细胞，这种方法在肺癌基因治疗中已显示了特殊效果，并且全身注射使用阳离子脂质体没有发现明显的器官相关毒性[34'35]。1.ParkinDM，BrayF，Ferlay丄etal.Globalcancerstatistic,2002.CA-CancerJClin.2005;55:74-1072.M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发明内容本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种能同时表达人FUS1蛋白与人IL-12蛋白的双基因表达载体。该载体为重组质粒载体，装载有编码人FUS1蛋白的基因与人IL-12蛋白的基因，能在真核细胞中同时表达人FUS1蛋白与人IL-12蛋白。其中，上述编码人FUS1蛋白的基因与编码人IL-12蛋白的基因分别处于不同启动子的控制之下表达。其中，上述人FUS1蛋白的编码基因具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，所述人IL-12的编码基因具有SeqIDNo.6所示的核苷酸序列。其中，上述编码FUSl的基因处于hFerHProm启动子的控制之下表达。其中，上述编码FUS1蛋白的基因所在表达框的构成是从5'到3'方向依次为hFerHProm启动子、编码人FUS1蛋白的基因序列、EFlpAn加尾信号。其中，上述编码人IL-12蛋白的基因处于hFerLprom启动子的控制之下表达。其中，上述编码人IL-12蛋白的基因所在表达框的构成是从5'到3'方向依次为hFerLprom启动子、编码人IL-12蛋白的基因、SV40pAn加尾信号。进一步的，上述重组质粒载体具有SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。本发明所要解决的第二个技术问题是提供上述的重组质粒载体的脂质体复合物。该脂质体复合物中脂质体和重组质粒载体的重量比为56:1。其中，上述脂质体是DOTAP和CH0L制成，用量配比为摩尔比l:l。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述的重组质粒载体或脂质体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物是上述的重组质粒载体或脂质体复合物作为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。根据本发明的第一个方面，提供了一种含有上述的FUS1和IL-12基因的真核共表达重组载体。这些能携带本发明重组FUSl和hlL-12基因的各种载体是本领域已知的，如腺病毒、质粒和其他的经加工后可以含有本发明FUS1和IL-12双基因序列的原核和真核载体。由于腺病毒载体其不整合到染色体上，因而随细胞分裂会丢失，不能获得稳定而持久地表达；腺病毒编码蛋白可以激发机体的免疫反应，使病毒载体很快被清除，同时由于静脉全身用药可能产生致命的过敏反应，只能用于局部注射的肿瘤治疗，影响稳定的治疗效果，缺乏特异性。通过腺病毒介导基因的局部肿瘤治疗虽然已经取得了一些成绩，但是由于病毒载体的毒性和不能有效将目的基因传送到耙器官，使用这种治疗方式用于治疗如肺癌、乳腺癌、结肠癌等这些全身扩散的肿瘤疾病显然存在一定的局限。因此，需要选择有效但不能激发机体免疫反应，能够全身给药的安全的基因治疗的载药系统。优选的，所述载体为DNA质粒载体。由于要实现双基因在同一个载体上的同时表达，同时还要转染真核细胞，因此，进一步优选的，质粒载体为PVITR02-neo-mcs。以RT-PCR方法从人肺成纤维细胞MRC-5的总RNA中扩增FUS1基因片段，然后将本发明提供的FUS1基因片段克隆到载体PVITR02上，获得PVITR02-FUS1表达载体。以P0RF-hlL-12的质粒为模板，PC財广增hlL-12基因片段，然后将本发明提供的hlL-12基因片段克隆到载体PVITR02上，获得PVITR02-hlL-12表达载体。然后以PVITR02-FUS1的质粒为模板，PC財广增FUS1基因片段，FUS1基因经过双酶切后，定向插入用相同限制性内切酶切成线性的PVITR02-hIL-12真核表达载体上，获得PVITR02-hIL-12-FUS1双基因真核共表达载体。本发明另一个方面是提供一种抗肿瘤药物。该抗肿瘤药物是由上述的重组质粒载体或者其脂质体复合物添加药学上可以接受的辅助性成分制备而成。优选的，所述的抗肿瘤基因药物为双基因脂质体复合物(Lipo-PVITR02-FUSl-hIL-12，以下简称P-I-F)。脂质体的成分及制备方法可以采用是本领域已知的方案。另外，本发明还提供了一种优选的脂质体方案，为DOTAP及胆固醇(Choi)组成脂质体，优选的配比为mol/mohl:l，优选的脂质体与DNA的比例为6:1。本发明脂质体配方独特，通过在阳离子脂质中添加适当比列的胆固醇，很好地提高了脂质体的稳定性，并且出人意料的是与常用的阳离子脂质体(D0PE/D0TAP)相比，其稳定性和包封质粒载体后的转染效率均同时得到了提高。添加药学上可接受的辅助性成分制备成的FUSl和hlL-12双基因阳离子脂质体药物注射剂能够通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生长产生抗肺肿瘤转移的作用。特别需要说明的是，以上生产和操作本发明公开的重组载体和抗肿瘤复合物注射剂的具体技术方法是本领域技术人员已知的，并可按照已描述的技术完成。本发明采用构建双基因真核共表达质粒实施基因治疗，通过静脉注射将双基因双基因阳离子脂质体药物导入体内，证实了可在体内减少肺部转移灶的数目和抑制肿瘤的生长，这主要是由于导入基因在体内的表达导致产生了明显的抗肿瘤作用，并且双基因药物的抗肿瘤的作用优于单基因药物的治疗。通过载体介导的hlL-12的基因治疗，克服了hlL-12重组蛋白全身应用所导致的毒性反应缺点，为肺癌联合基因治疗提供了新的基因联合应用方式，并为在此基础上结合其他的肿瘤治疗手段进行肺癌的综合治疗提供了基础。本发明利用FUSl和hlL-12双基因脂质体复合物用于肺癌的治疗，表达的FUSl和hlL-12能在体内外有效促进肿瘤细胞凋亡，并能在体内抑制肿瘤血管生长，首次证实了FUS1基因和hlL-12的联合应用能够发挥促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生成的多重作用。更重要的是，本发明获得的DNA脂质体复合物，可能能够在体内诱导产生特异的抗肿瘤免疫，增强并延长治疗疗效。此外，本发明的阳离子脂质体具有特别适宜在一些组织如肺肿瘤的基因转移中的应用。当静脉给予双基因脂质体复合物时，肺部肿瘤组织是目的基因表达水平最高的器官，这主要与呼吸道细胞对阳离子脂质的亲和性高有关。并且动物组织HE染色发现全身注射使用双基因阳离子脂质体复合物没有发现明显的器官相关毒性。提高了基因药物的转染率，同时能够连续反复多次使用，避免了病毒载体的毒性及不能长期反复使用的缺点，方便了进一步临床应用，并由于其双基因治疗的多重效应，大大提高了抗肿瘤的作用，尤其是为肺癌的治疗提供了极有前景的基因治疗药物。图l人FUS1基因全长片段的PCR产物电泳图谱(1%Agarose电泳)。M:marker;l:全长FUS1PCR产物，全长片段约356bps，与理论预测值一致。图2:重组PVITR02-FUS1质粒载体构建酶切电泳图M:Marker;1:Agel和Clal双酶切片段用限制性内切酶Agel和Clal切成6100bp的线性PVITR02真核表达载体和356bp的FUSl，结果与预期相符。图3人hlL-12基因全长片段的PCR产物电泳图谱(1%Agarose电泳)。M:marker;1:全长IL-12PCR产物，全长片段约1611bp，片段与预期一致.图4:重组PVITR02-hIL-12质粒载体构建酶切电泳图.M:Marker;1:SgrAl和Nhel双酶切片段；限制性内切酶SgrAl和Nhel切成6100bp的线性的PVITR02真核表达载体和1611bp的hIL-12，结果与预期一致。图5.PVITR02-IL12-FUS1双基因真核共表达载体的构建酶切电泳图M:Marker;1:SgrAl和Nhel双酶切片段.2:Agel和Clal双酶切片段；用限制性内切酶Agel和Clal切成6100bp的线性PVITR02真核表达载体和356bp的FUSl，用限制性内切酶SgrAl和Nhel切成61OObp的线性PVITR02真核表达载体和161lbp的hIL-12。图6.双基因真核共表达质粒DNA脂质体复合物粒径测定.制备好的阳离子脂质体用马尔文粒度仪检测，其粒度曲线显示粒径在114nm-212nm左右。图7验证双基因真核共表达质粒中hlL-12基因在RNA水平的表达(24h).M:marker;1:A549;2:PVITR02;3:PVITR02-hIL-12;4:PVITR02-hIL-12-FUS1，500bp处为P—action。图8:验证转染双基因真核共表达质粒后分泌到细胞上清中hlL-12的表达量.用PVITR02-hIL-12、PVITR02-hlL-12-FUSl转染A549细胞后24、48小时，收获细胞，用PBS洗细胞2次。分别提取转染细胞及未转染的A549细胞总RNA进行RT-PCR，结果显示(图8)，P-I、P-I-F转染A549细胞后24小时即可检测到hlL-12蛋白的表达，RT-PC財广增产物位于426bp附近，只转染了空载体P和未转染的A549细胞则没有该基因的蛋白表达。图9双基因真核共表达质粒转染A549细胞后FUS1表达的WESTERNBLOT分析.M:Marker;1:control;2:纯化的FUS1重组蛋白；3.P-F;4:P-1-F用P-1，P-1-F转染A549细胞48小时后，收获细胞对其表达产物进行WesternBlot分析，结果显示转染P-I-F和P-F的细胞裂解液可与抗FUS1蛋白多克隆抗体结合，条带位置与FUS1预期蛋白的大小的相符合，而未转染基因的A549细胞无特异性条带出现。图10免疫组化检测双基因真核共表达质粒转染A549细胞后FUS1在细胞内的表达A:未转染基因的细胞没有FUS1阳性，且细胞生长状态良好。B:转染P-I-F48小时后，部分细胞表现FUS1阳性，并清晰可见FUS1蛋白分布在胞质和核膜。图ll体外双基因真核共表达质粒转染A549细胞后诱导肿瘤细胞凋亡((200X)Hochest染色荧光显微镜下观察转染48小时后A549细胞变化，P-F组(D)和P-I-F组(E组)可见A549细胞核浓縮、碎片、体积变小及凋亡小体形成，双基因组(E)中出现的凋亡小体明显多余单基因组；P-I组(C)和空载体组(B)有少量凋亡小体出现；对照组(A)细胞没有明显的改变。图12.双基因真核共表达质粒体内抗肺转移效应(A549裸鼠模型)图依次为A:对照组(GLu)B:PVITR02组；C:P-F组；D:P-1-F组.结果显示，P-1-F组(D)与空载体PVITR02组(B)和葡萄糖组(A)相比，裸鼠肺部转移灶明显减少，显出明显的肿瘤生长抑制，与P-F(C)相比，P-I-F处理组抑制肿瘤转移灶的效果也好于单基因处理组图13本发明双基因载体构建路线图。图14:双基因真核共表达质粒体内抗肺转移凋亡检测(200X):原位TUNEL检测试剂盒分析A549肿瘤组织中的凋亡水平，可见在P-I-F治疗组(C)中显示强的绿色荧光，表明治疗后的残存肿瘤中存在大量凋亡细胞，而对照组(葡萄糖)(A)和PVITRO空载体组(B)荧光较少。TUNEL结果显示给与P-I-F治疗的肿瘤细胞凋亡明显增加。图15PVITRo2真核表达载体的结构图，全长6125bp。具体实施例方式以下结合附图通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。实施例一构建人FUS1和IL-12双基因真核共表达载体本发明双基因真核共表达载体的构建路线如图13所示。通过引物可以扩增人FUS1和IL-12基因1):人FUS1基因的引物合成以FUSl在GenBank中的序列NM—007275为模板设计引物。从人肺成纤维细胞MRC-5细胞总RNA反转录之后扩增该基因的0RF区。上游引物(SEQIDNo.l):5'TATACCGGTAAGATGGGCGCCAGCGGGTCCAAAG3'下游弓l物(SEQIDNo.2):5'GCGATCGATTCACACCTCATAGAGGATCACAG3'上游添加Age頂每切位点，下游添加CIa位点扩增得到的人FUS1基因的序列为SEQIDNo.3所示。2):人hlL-12基因的引物合成以p0RF-hlL-12的质粒为模板设计以下引物扩增hlL-12上游序列(SEQIDNo.4):5'TTACACCGGTGAAGATGGGTCACCAGCAGTTGGTC3'下游序列(SEQIDNo.5):5'GCGGCTAGCTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATC3'上游添加SgrAl酶切位点，下游添加Nhel酶切位点扩增得到的hlL-12基因的序列为EQIDNo.6所示。将上述基因产物构建成双基因真核共表达重组载体。从人正常肺细胞中提取RNA，通过上述设计的引物RT-PC財广增FUS1(图l)，酶切后，定向插入用相同限制性内切酶Agel和Clal切成线性的PVITR02真核表达载体(购自invivogen，USA，全长6125bp，其结构见图15)，以T4DNA连接酶16。C水浴16-20h，将目的基因片段与载体相连，转化大肠杆菌JM109，在卡那霉素抗性平板上随机挑选数个白色菌落提取质粒DNA，通过凝胶电泳初步筛选出可能的重组子，进一步做Agel与Clal双酶切反应进行鉴定，酶切结果得到了一条约356bp的片段和一条约6100bp左右片段，与预期结果相一致，同时用PCR鉴定也得到了目的条带，证明FUS1质粒载体正确构建，命名PVITR02-FUS1(图2)，并进一步送上海英俊生物公司测序鉴定，结果正确。以P0RF-hlL-12的质粒为模板，以上述设计的引物PC財广增hlL-12(图3)，酶切后定向插入用相同限制性内切酶SgrAl和Nhel切成线性的PVITR02真核表达载体，以T4DNA连接酶16。C水浴16-20h，将目的基因片段与载体相连，转化大肠杆菌JM109，在卡那霉素抗性平板上随机挑选数个白色菌落提取质粒DNA，通过凝胶电泳初步筛选出可能的重组子，进一步做限制性内切酶SgrA1和Nhe1双酶切反应进行鉴定，酶切结果得到了一条约1611bp的片段和一条约6100bp左右片段，与预期结果相一致，同时用PCR鉴定也得到了目的条带，证明hlL-12质粒载体正确构建，命名PVITR02-hlL12(图4)，并进一步送上海英俊生物公司测序鉴定，结果正确。以PVIT02-FUS1的质粒为模板，以上述设计的引物PC財广增FUS1，酶切后定向插入用相同限制性内切酶Agel和Clal切成线性的PVITR02-hlL-12真核表达载体，以T4DNA连接酶16。C水浴16-20h，将目的基因片段与载体相连，转化大肠杆菌JM109，在卡那霉素抗性平板上随机挑选数个白色菌落提取质粒DNA，通过凝胶电泳初步筛选出可能的重组子，进一步做SgrAl和Nhel及Agel和Clal双酶切反应进行鉴定，结果如(图5)所示，酶切结果得到了一条约1611bp的片段和一条约6100bp左右片段，一条约356bp的片段和一条约6100bp左右片段，与预期结果相一致，证明双基因质粒载体正确构建，命名PVITR02-hlL-12-FUSl，并进一步送上海英骏生物公司测序鉴定，与预期结果一致。最后确定PVITR02-hlL-12-FUSl的序列如SEQIDNo.7所示。实施例二人FUS1和IL-12双基因真核共表达载体的脂质体复合物的制备利用QIAGEN公司去内毒素的大量质粒的提取试剂盒抽提P-1-F(PVITR02-hIL-12-FUS1)，P(PVITR02)，P-1(PVITR02-hIL-12)，P-F(PVITR02-FUS1)载体质粒并定量。通过如下方法获得双基因阳离子脂质体复合物。1、阳离子脂质体的制备精确称取DOTAP58mg，胆固醇Chol32mg(mol/mol=l:1)，于100ml旋蒸瓶中，加入20ml氯仿溶解，之后在旋转蒸发器上旋转蒸发45分钟以除去氯仿，置于真空干燥机中干燥12小时后，取出，加入一定量5%葡萄糖溶液，60摄氏度下探头超声(功率为400W)IO分钟，将所得液体继续在60摄氏度下孵化1小时，即得阳离子脂质体。分装后置于4-8摄氏度条件下保存。2、DOTAP:CHOL与双基因质粒复合物制备及粒径测定制备过程如下1.4mMDOTAP:CHOL溶液制备取两个l.5ml的EP管各加入800y15%葡萄糖，从4度冰箱中取出一管20mM的脂质体溶液分别吸取200yl加入前述EP管中即稀释至4mM，混匀备用。2.lug/yl质粒溶液制备从-7(TC冰箱中取质粒稀释至lyg/ul，混匀备用。3.质粒与DOTAP:CHOL复合物的配制如配制质粒P-F为IOyg终体系200yl的复合物。取两个EP管标注为A和B，A中加入90yl5%葡萄糖，B中加入81.5yl5%葡萄糖，将配制好的lug/uI的P-F质粒溶液IOy1加入A中轻轻混匀三次，将配制好的4mM的D0TAP:CH0L18.5yl加入B轻轻混匀三次，最后将A中质粒溶液全部吸出加入B中，加入时应在液面处轻轻加入并混匀三次，混匀时动作一定要轻柔避免沉淀出现。整个配制过程尽量迅速，最后置于4度过夜。4.粒径和电位的测定及动物治疗第二天早晨从冰箱取出所配复合物室温静置l小时后，用于动物治疗实验和复合物的粒径与电位测定。在DNA脂质体复合物的制备中，本发明通过对DNA脂质体复合物粒径和电位的测定以及转染效率三个方面来评价脂质体与DNA的比例，我们得出的优势比例为脂质体和质粒的重量比为5-6:l，最佳比例为6:1。在体内实验中本发明均采取了该比例配制的脂质体复合物。用马尔文粒度仪检测脂质体复合物粒径，测定结果表明用于多次连续治疗的脂质体复合物粒度均一，粒径范围在114nm-185nm之间，符合脂质体在体内基因治疗中的粒径要求(见图6)。实验例一人FUS1和IL-12双基因真核共表达载体在体外的表达及抗肿瘤活性1、hlL-12基因表达的检测用PVITR02-hIL-12(P-1)、PVITR02-hIL-12-FUS1(P-1-F)转染A549细24、48，72小时后，收获细胞，用PBS洗细胞2次。提取转染及未转染的A549细胞总RNA进行RT-PCR，结果显示(图7)，PVITR02-hIL-12、PVITR02-hIL-12-FUS1转染A549细胞后24小时即可检测到hlL-12基因特异片段的表达，RT-PC財广增产物位于426bp附近，未转染的A549细胞则未表达该基因.用分别用PVTR02，PVITR02-hIL-12、PVITR02-hIL-12-FUS1转染A549细胞24、48小时后，收获细胞上清检测hlL-12的浓度，结果发现转染24h后，即可在P-I-F组和P-I组检测到IL-12的表达，而且表达量很高，而在空载体P组和未转染组，几乎检测不到IL-12的表达(见图8)。各组IL-12表达量见表1。表1.转染双基因真核共表达质粒后分泌到细胞上情中hIL-12的表达量.hlL-12(pg/ml)24h犯h4.1994.798P11.15211.893P-I4362.4919767.215P-I-F2865.Sll8554.1752.FUS1表达的检测用P-F、P-I-F转染A549细胞48小时后，收获细胞对其表达产物进行WesternBlot分析，结果显示转染P-I-F.和P-F的细胞裂解液可与抗FUS1蛋白多克隆抗体结合，条带位置与预期的相符合，而未转染的A549细胞无特异性条带出现(图9)。用P-I-F转染A549细胞48小时后，用细胞免疫组化检测FUS1在A549细胞内的表达。结果发现转染P-F-I24小时后，部分细胞表现FUS1阳性，并清晰可见FUS1蛋白分布在胞质和核膜(A)，而未转染和仅转染了PVITR0(B和C)的细胞中没有FUS1蛋白阳性，且细胞生长状态良好(图IO)。3、双基因联合表达的抗肿瘤活性检测我们通过Hoechst33258染色，从形态学角度发现，转染了P-I-F，P-F的肿瘤细胞有明显的凋亡特征，即核固縮，形成含核碎片的凋亡小体，但双基因组(E)中出现的凋亡小体明显多余单基因组(D);P-I组(C)和空载体组(B)有少量凋亡小体出现；对照葡萄糖组(A)细胞没有明显的改变(图ll)。实验例二双基因真核共表达质粒脂质体复合物在体内抗肿瘤活性检测1、实验方法
技术领域：
：本发明首先建立人肺癌细胞A549裸鼠肺转移肿瘤模型，采用P-I-F，P-F，P-I及P的阳离子脂质体复合物连续8次尾静脉给药治疗肿瘤，剂量为10ug/mice，治疗后第三周解剖老鼠，计数肺部肿瘤转移灶的数目，计算转移抑制率。实验结果证实了双基因真核共表达质粒DNA脂质体复合物在体内的抗肿瘤活性。2、实验结果A、实验期间各组均未观察到明显的毒副反应，HE染色发现治疗组和对照组各组织间无明显差异。B、P-I-F治疗组肿瘤转移灶明显少于空质粒组、葡萄糖组或单基因组，治疗中出现部分肿瘤转移灶在治疗后完全基本消退，部分小鼠肿瘤转移灶生长明显抑制(图12)。实验例三双基因真核共表达质粒脂质体复合物的体内抗肿瘤实验1、实验方法按上述方法建立肿瘤模型，实施治疗，治疗结束后三周，收获肺组织，检测P-I-F的脂质体复合物促进肿瘤凋亡的作用，HE染色检测治疗后肺部转移灶中肿瘤细胞的形态、坏死或凋亡情况，进一步采用TUNEL法检测凋亡水平。检测血管生成的抑制作用收获肺组织，分别利用CD31抗体检测肺部转移灶中血管生成情况，比较各组瘤内血管密度差异。2、实验结果HE染色显示(200X)，双基因P-I-F的脂质体复合物处理组小鼠肺转移灶中瘤内坏死及凋亡明显，肿瘤内可见淋巴细胞浸润，对照组和PVITRO空载体组肿瘤细胞生长状态良好，很少有坏死和淋巴细胞浸润。而在P-I-F的脂质体复合物处理组肿瘤转移灶明显减小，组织内则有明显的淋巴细胞浸润和坏死。TUNEL法检测证实，双基因P-I-F的脂质体复合物治疗组明显促进肿瘤细胞的凋亡(图14)。CD31染色发现，与空载体比较双基因P-I-F处理组肺转移灶中肿瘤内的微血管密度明显下降，转移灶也明显减小，证明P-I-F的脂质体复合物能够抑制肿瘤血管生成。综上，由本发明构建的重组FUSl和hlL-12双基因真核共表达DNA脂质体复合物能够通过促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成，在体内有效地抑制肿瘤生长。同时由本领域常识可知，若有不同的要求，本发明的抗肿瘤注射剂中重组P-I-F基因的用量可以在一个较大范围内变动。本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程度，病人体重，剂型，所选用药途径等很容易地加以确定。以上的较优的具体实施方式是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。SEQUENCELISTING〈110>四川大学〈120>重组人FUS1和人IL-12的双基因表达载体、脂质体复合物及其制备方法和用途〈130>A080307k〈160>7〈170>Patentlnversion3.4〈210>1〈211>34〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>1tataccggtaagatgggcgccagcgggtccaaag34〈210>2〈211>32〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>2gcgatcgattcacacctcatagaggatcacag32〈210>3〈211>333〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>3atgggcgccagcgggtccaaagctcggggcctgtggcccttcgcctcggcggccggaggc60ggcggctcagaggcagcaggagctgagcaagctttggtgcggcctcggggccgagctgtg120ccccccttcgtattcacgcgccgcggctctatgttctatgatgaggatggggatctggct180cacgagttctatgagg卿caatcgtcacca卿acgggc卿agcgggccaagctgagg240cgagtgcataagaatctgattcctcagggcatcgtgaagctggatcacccccgcatccac300gtggatttccctgtgatcctctatgaggtgtga333〈210>4〈211>35〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>4ttacaccggtgaagatgggtcaccagcagttggtc35〈210>5〈211>34〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>5gcggctagcttaggaagcattcagatagctcatc34〈210>6〈211>1611〈212>DNA〈213>artificial〈220>〈223>artificial〈400>6atgggtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctc60gtggccatatggg肌ctg肌gaaagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggat120gcccctggaga肌tggtggtcctcacctgtgacacccctgtatcacctgg180accttggacc卿gcagtgaggtcttaggcccctgaccat240gagtttggagatgctggccagtacacctgtC3C肌3gg3ggcgaggttctaagccattcg300ctcctgctgcgga卿tggaatttggtccactgatatttt肌3gg3CC3g360ctttctaagatgcgaggccatggacgtttc420acctgctggtggctgacgac肌tcagtactgatttgacattcagtgtcaa肌gC3gC3g3■ggctcttctgacccccaaggggtgacgtgccactctctgc卿g卿gtc540卿gg卿catgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgccca600gctgctgaggagagtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtat660g肌肌ctacaccagcagcttcttcatcaggaacctgaccc3CCC肌g肌C720ttgcagctgagaattctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgac780acctggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggc肌g840tagagtcttc3Cgg3C肌g3cctcagccacggtcatctgc■ccagcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagc960g肌tgggcatctgtgccctgcagtgttcctggagtaggggtacctggggtgggcgcc卿1020aacctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactccc肌肌c1080ctgctgagggccgtcagcaacatgctccagaaggccagac1140tgcacttctg肌gagattg3tcatg肌gatcacagtggag1200gcctgtttaccattggaattg卿gttgccagagacctct1260atgggagttgcctggcctcccttttatgatggccctgtgc1320cttagtagtactcgaagatgtaccaggtggagttc肌gac1380aagcttctgatggatcctaagaggc卿tctttctagatcggcagttatt1440gatgagctgatgcaggccctg肌tttc肌cagtg卿ctgatcctccctt1500g肌g肌ccggaactaaaatcaagctctgcatacttcttcatgctttcaga1560attcgggcagtgactattgat卿gtgatgagctatctgaatgcttccta1611〈210〉7〈211〉8216〈212〉DNA〈213〉artificial〈220〉〈223〉artificial〈400〉7cctgcaggcgtacggta肌tggcccgcctggctgaccgccc肌cgacccc60cgcccattgacgtc肌t肌tgacgtatgttcgccaatagggactttccat120tgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtat180catatgcc肌gtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattat240gcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatc300gctattaccatgatgatgcggttttggcagtacatc肌tgggcgtggatagcggtttgac360tcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttgactagtc420agggccccaaccccccc肌gcccccatttcac肌cacgctggcgctacaggcgcgtgact■tccccttgctttggggcggggggctg卿ctcctatgtgctccggattggtcaggcacgg540ccttcggccccgcctcctgccaccgcagattggccgctaggcctccccgagcgccctgcc600tccgagggccggcgcaccat肌肌g肌gccgccctagccacgtcccctcgcagttcggcg660gtcccgcgggtctgtctcaagcttgccgcc3g肌C3C3ggtaagtgccgtgtgtggttcc720cgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccatgccc780ctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttgg肌gtgggtggg卿gttc840gaggccttgcgctt肌ggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcttgggcg■ctggggccgccgcgtgctaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgctaa960gtctctagccat11aaaatttttgataaccagctgcgacgctttttttctggcg卿tag1020tcttgtaaatgcgggccaggatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcgg1080cgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggcc11403CCg3g肌tC卿cgggggt3gtctca肌ctggccggcctgctctggtgcctggcctcgc1200gccgccgtgtatcgccccgccctgggcggc肌ggctggcccggtcggcaccagttgcgtg1260tggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcg1320cccggg卿gcgggcgggtgagtcacccacagggcctttccttcctcatc1380cgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttgtc1440gagcttttggagtacgtcgtctttaggttgggg卿ggggttttatgcgatggagtttcc1500ccacactgagtgggtgg卿ctgaagagttaggccagcttggcacttgatgtaattctcc1560ttggaatttgccctttttgagtttggatcttgcctcattctcaagcctcagacagtggtt1620caaagtttttttcttccatttcaggtgtcgccctaaaagccaccggcatg1680ggtcaccagcagttggtcatctcttggttttccctggtttttctggcatctcccctcgtg1740gccatatgggagatgtttatgtcgtagaattggattggtatccggatgcc1800cctggagaaatggtggtcctcacctgtgacacccctgaagaagatggtatcacctggacc1860ttggaccagagcagtgaggtcttaggctctggc肌肌ccctgaccatccaagtcaaagag1920tttgg卿tgctggccagtacacctgtcaca肌ggaggcgaggttctaagccattcgctc1980ctgctgcttcagatggaatttggtccactgggaccagaaa2040g肌ccc肌肌at肌gacctttctaagatgcgaggcca卿attattctggacgtttcacc2100tgctggtggctgacgac肌tcagtactgatttgacattcagtgtcaaaagcagc卿ggc2160tcttctgaccccc肌ggggtgacgtgcggagctgctacactctctgcagag卿gtc卿2220ggggac肌caaggagtatgagtactcagtggagtgccaggaggacagtgcctgcccagct2280gctgagg卿gtctgcccattgaggtcatggtggatgccgttcacaagctcaagtatgaa2340gcagcttcttcatcagggacatcatcaaacctgacccacccaagaacttg2400cagctgaagcttctcggcaggtggaggtcagctgggagtaccctgacacc2460tggagtactccacattcctacttctccctgacattctgcgttcaggtccagggca卿gc2520agtcttcacggacaagacctcagccacggtcatctgccgc2580gcattagcgtgcgggcccaggaccgctactatagctcatcttggagcgaa2640tgggcatctgtgccctgcagtgttcctggagtaggggtacctggggtgggcgccagaaac2700ctccccgtggccactccagacccaggaatgttcccatgccttcaccactcccaaaacctg2760ctgagggccgtcagc肌catgctccagaaggccagacaaactctagaattttacccttgc2820acttctgaagtg肌gatatc肌3CC3gC3Cagt卿ggcc2880tgtttaccatagttgcctaagacctctttc2940卿gttgcctggcctccagaaagacctcttttatgatggccctgtgcctt3000atg肌gactcgaagatgtaccaggtggagttc肌gaccat3060cttctgatggatcct肌gaggcagatctttacatgctggc3120gagctgatgcaggccctgaatttcaacagtg卿ctgtgccacaaaaatcctcccttgaa3180gaaccggatttttataaaacctctgcatacttcttcatgctttcagaatt3240cgggcagtgactattgatagagtgatgagctatctgaatgcttcctaagctagctggcca3300gatacattgatgagtttggactag肌tgca3360tgctttatttgtgaaatttggctttatttg3420ttgcattcattttatgtttcaggttcaggg卿ggtgtgg3480gaggtttttt3肌cctctacaaatgtggtatggaaatgtt3540CC3tg3CC肌cgtgagttttcgttccactgagcgtcagacCCCgt3g肌33600atcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgc3660gctaccagcggtggtttgtttgccggatcaactctttttc3720cgaaggtaactggcttcagc卿gcgc卿tgttcttctagtgtagccgt3780agttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcc3840tgttaccagtggctgctgccagtcgtgtcttaccgggttggactc肌gac3900gatagttaccggat肌ggcgcagcggtcgggctg肌cggggggttcgtgc3C3C3gCCC33960gcttggagcg肌cgacctac3CCg肌Ctg3gatacctacagcgtgagctatg卿肌gcg4020ccacgcttcccg肌ggg卿肌ggcggacaggtatccggt肌gcggcagggtcgg肌cag4080g卿gcgcacgagggagcttccaggggg肌acgcctggtatctttatagtcctgtcgggt4140ttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctat4200gg肌肌3CgCcagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctc4260acatgttctt肌tt肌cctgcagggcctgacttggttagg4320taccttctgaggctg肌卿accagctgtgg肌tgtgtgtcagttagggtgtgga肌gtc4380cccaggctccccagcaggcagaagtatgca肌gcatgcatctcaattagtC3gC肌CC3g4440gtgtgga肌gtccccaggctccccagcaggcagaagtatgC肌3gC3tgC4500gtcagcaaccatagtcccactagttccgcc卿gcgcgcgagggcctccagcggccgccc4560CtCCCCC3C3gcaggggcggggtcccgcgcccaccggaaggagcgggctcggggcgggcg4620<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula>,ggggactagcttctatgcctgaatagg6480tgaccggaggtcggcacctttcctttgcaattactgacccactgactgtt6540tcatcggcatagtatatcggtacgactcactataggaggg6600CC3CC3tg肌Ctg3C3gC肌cttctgttgagaagtttctc6660ttgattctgtttctgatctcatgcagctgtctg肌ggtgagccttttctt6720ttgatgttggagga卿ggttatgttctgagggtcaattcttgtgctgatggtttttaca6780tgtttacagacactttgcctctgctgctctgccaattccag肌gttctgg6840acattggagaattttctgaatctctcacctactgcatcagC3g肌g3gC3caaggagtca6900ctctccaggatctccctgaaactgagctgccagctgttctgcaacctgttgctgaagcaa6960tggatgccattgcagcagctgatctgagccaaacctctggatttggtccttttggtcccc7020肌ggcattggtcagtacaccacttggagggatttcatttgtgccattgctgatcctcatg7080tctatcactggc卿ctgtgatggatgacacagtttctgcttctgttgctcaggcactgg7140atg肌ctcatgctgtgggcagaagattgtcctgaagtcagacacctggtccatgctgatt7200ttggaagcaacaatgttctggC3g肌tC3Ctgcagtcattgactggtctg7260aagccatgtttggagattctcaatatgaggttgccaacatttttttttggagaccttggc7320tggcttgcatgg肌c肌c肌3C3CCC3g肌ctggctggtt7380cccccagactgagagcctacatgctcag肌ttggcctggaccaactgtatcaatctctgg7440ttgatggaaactttgatgatgctgcttgggC3C肌gg肌gatgtgatgccattgtgaggt7500ctggtgctggaactgttggattgcaagaaggtctgctgctgtttggactg7560atggatgtgttgaagttctggctgactctg3CCCtCC3C3agacccagag7620ccaaggaatgagattatccctaatacctgcC3CCCC3CtCttaatcagtg7680gtgga卿acggtctcagaactgtttgtttcaattggccatttaagttta7740actggttaatccttcagaagtgttttgtgg7800accactttggttttcttttttgcgtgtggctattagtttt7860tttgtcacagcccatt7920gtgttcctttggtcaacaccggtgaa卿c7980ggttttacga3tctgga肌cttcttg肌肌tgtaattcttgagttaacac8040ttctgggtgg卿atagggttgttttccccg,gggg肌ggaatatcat8100g卿gggttgctttgattacaacactggagcatgttgctg8160attgcctgtcgcca肌肌ctgagtccttgggttgcatagaaagctg821权利要求1.重组质粒载体，其特征在于装载有编码人FUS1蛋白的基因与人IL-12蛋白的基因，能在真核细胞中同时表达人FUS1蛋白与人IL-12蛋白。2、根据权利要求l所述的重组质粒载体，其特征在于所述编码人FUS1蛋白的基因与编码人IL-12蛋白的基因分别处于不同启动子的控制之下表达。3、根据权利要求2所述的重组质粒载体，其特征在于所述人FUS1蛋白的编码基因具有SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，所述人IL-12的编码基因具有SeqIDNo.6所示的核苷酸序列。4、根据权利要求2所述的重组质粒载体，其特征在于所述编码FUS1的基因处于hFerHProm启动子的控制之下表达。5、根据权利要求4所述的重组质粒载体，其特征在于所述编码FUS1蛋白的基因所在表达框的构成是从5'到3'方向依次为hFerHProm启动子、编码人FUS1蛋白的基因序列、EFlpAn加尾信号。6、根据权利要求3所述的重组质粒载体，其特征在于所述编码人IL-12蛋白的基因处于hFerLprom启动子的控制之下表达。7、根据权利要求6所述的重组质粒载体，其特征在于所述编码IL-12蛋白的基因所在表达框的构成是从5'到3'方向依次为hFerLprom启动子、编码人IL-12蛋白的基因、SV40pAn加尾信号。8、根据权利要求l所述的重组质粒载体，其特征在于具有SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。9、权利要求18任一项所述的重组质粒载体的脂质体复合物，特征在于脂质体和质粒的重量比为56:1。10、根据权利要求9所述的脂质体复合物，特征在于所述脂质体由D0TAP和CH0L组成，其用量配比为摩尔比l:l。11、权利要求18任一项所述的重组质粒载体或权利要求9或10所述的脂质体复合物在制备抗肿瘤药物中的用途。12、抗肿瘤药物，由权利要求18任一项所述的重组质粒载体或权利要求9或10所述的脂质体复合物作为主要活性成分添加药学上可接受的辅助性成分制备而成全文摘要本发明属于基因治疗领域，要解决的技术问题是提供新的双基因治疗产品。具体涉及重组人FUS1和人IL-12的双基因表达载体、脂质体复合物及其制备方法和用途。该双基因表达载体含有编码人FUS1蛋白的基因与编码人IL-12蛋白的基因，能在真核细胞中同时表达人FUS1蛋白与人IL-12蛋白。优选的方案是将编码人FUS1蛋白与人IL-12蛋白的基因分别处于不同的启动子的控制之下表达。实验表明，本发明重组载体的脂质体复合物由于其双基因治疗的多重效应，大大提高了抗肿瘤的作用，因而为肿癌的治疗提供了一种新的选择。文档编号A61K48/00GK101368187SQ20081030480公开日2009年2月18日申请日期2008年10月9日优先权日2008年10月9日发明者文朱,邓洪新,陈俐娟,魏于全申请人:四川大学