专利名称：重组人hnp基因脂质体复合物、制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因治疗领域，具体涉及a-防御素(HNP)成熟肽编码序列的重组载体、脂 质体复合物，及其制备方法与用途。
技术背景人alpha防御素(a-防御素)是来源于人嗜中性粒细胞的嗜苯胺蓝颗粒内的阳离子活性 多月太(Human neutrophil p印tides， HNPs)，分子量为4 5KD，含保守的6个半胱氨酸残基 ，形成3个典型的分子内二硫键(Ganz and Lehrer 1995)。目前发现的a-防御素(丽Ps)有 四种，但发挥主要功能的主要有三种丽P1、丽P2、丽P3，基因结构可以大致分为三部分， 分别编码信号肽、前体肽以及成熟肽。以HNP1为例，首先合成94个氨基酸残基的多肽( pr印ro-HNPl)，信号肽被切除之后获得45个氨基酸的前体肽段，被来源于髓系细胞的切割 酶切除，最终生成30个氨基酸构成的具有活性的阳离子成熟肽(Valore and Ganz 1992)。在体外，丽Ps有广谱的抗菌性，其中包括细菌，真菌，以及一些病毒(Selsted and Ouellette 2005)。近年来的研究表明，在体外HNPs对多种肿瘤细胞表现出细胞毒性 (Xichtenstein， Ganz et al. 1988; Aarbiou， Tjabringa et al. 2006)， HNPs可破坏细胞 膜进而导致细胞不可逆的损伤，当细胞膜的通透性改变后，HNPs随即进入细胞内，在胞内发 挥其二次损伤的作用，HNPs在细胞内的损伤作用对于肿瘤细胞的裂解甚至更为重要 (Lichtenstein 1991)。而正常细胞与肿瘤细胞之间存在着许多差别，肿瘤细胞的细胞膜表 面比正常细胞的细胞膜表面有更多的负电荷，而且在肿瘤细胞表面存在大量的微绒毛，增加 了肿瘤细胞的表面积，使更多的防御素可以结合到肿瘤细胞的细胞膜，相对特异的发挥抗肿 瘤作用(Zwaal and Schroit 1997)。但是，这些体外研究发现，HNPs容易受到血清蛋白及 Ca离子浓度影响而失活，因而认为，HNPs难以在体内用于肿瘤的治疗(Lichtenstein 1991; Aarbiou, Tjabringa et al. 2006)。作为抗菌肽，HNPs不仅在先天性免疫中发挥作用，同样地它还能调节机体的获得性免疫 (Selsted and Ouellette 2005)。除了直接的杀伤活性外，HNP1可以趋化人类的单核细胞， T细胞，和未成熟的树突状细胞(Territo， Ganz et al. 1989; Yang， Chen et al. 2000)， 而这些细胞与肿瘤免疫密切相关。丽Pl-3还可以增加肿瘤坏死因子alpha(TNF-a)，减少单 核细胞产生的白介素10(IL-10) (Chaly， Paleolog et al. 2000)，上调的TNF-a可以诱导肿瘤细胞的凋亡，而下调的IL-10减少了IL-10介导的免疫抑制。最近的研究表明，HNPs在病 毒感染的肿瘤中可能发挥作用(Hubert, Herman et al. 2007)，也可能影响肾癌细胞的增殖 (Muller， Markovic-Li沐ovski et al. 2002)，但目前尚没有证据表明HNPs能够介导抗肿瘤 免疫。纤维结合蛋白(FN)及受体整合素a5f3 1 (integrin a5{3 1)是血管生成的胞外机制 相关的重要蛋白。目前有研究表明丽Ps可以通过影响FN与integrin a5f3 1的结合，进而影 响内皮细胞粘附以及内皮细胞增殖来调节血管生成，并能抑制糖尿病所致的视网膜血管增生 (Economopoulou， Bdeir et al. 2005)。但目前尚没有研究报道HNPs能够抑制肿瘤血管生成 进而抑制肿瘤生长。事实上，上述的研究采用的HNPs主要直接从人的中性粒细胞提取，人工提取HNPs不仅受 到细胞来源的限制，所提取的丽Ps也是丽Pl-3的混合物，难以将三种主要有效成分分开，获 得活性较强单体。体外人工合成的丽Ps不仅成本昂贵，而且多肽的活性也有待证实。并由于 HNPs多肽的作用呈现浓度依赖，并存在容易受到血清蛋白及Ca离子浓度影响的不稳定性，使 HNPs多肽难以作为药物被开发用于临床治疗。由于HNPl的成熟涉及到多肽的剪切修饰等过程 ，要使用载体装载基因片段进入体内进行表达并发挥其作用具有很大的不确定性。目前也没 有利用HNPl基因设计基因药物用于肿瘤治疗的报道。癌症基因治疗目前主要策略集中于三个方面， 一是引入肿瘤凋亡调节基因，如p53， 二 是引入抑制肿瘤血管生长的基因，如endostatin，三是引入免疫基因，如IL-2。引入凋亡基 因及血管生长抑制基因的有效性已被多数研究所证实，但其效应的发挥必须依赖于高效的转 染效率和抑制作用的持续发挥，而采用免疫基因的优势在于只需要部分转染肿瘤细胞即可诱 发肿瘤免疫，但在肿瘤负荷较大的情况下收效甚微，因此，目前基因治疗的一个理想的策略 是获得具有双重或多重作用的理想候选基因。发明内容本发明要解决的第一个技术问题是提供一种真核表达载体。该真核表达载体含有并能表 达人a -防御素成熟肽编码基因。其中，上述真核表达载体为重组噬菌体载体、腺病毒载体或质粒载体。由于人a-防御 素(HNP)成熟肽存在一定抗病毒作用，故优选使用质粒载体。进一步的，上述的质粒载体为pSecTag2B或pcDNA3. 1。其中，上述人a-防御素成熟肽的编码序列如SEQ ID NO. 1 (为HNP1成熟肽的编码序列) 或SEQ ID NO. 2 (为丽P3成熟肽的编码序列)所示。进一步的，上述表达载体中的a -防御素成熟肽编码基因的5'端连接有免疫球蛋白信号 肽编码基因或细胞因子信号肽编码基因。其中，上述的免疫球蛋白信号肽编码基因优选为人IL-2分泌信号肽的编码基因、上述的 细胞因子信号肽编码基因优选为免疫球蛋白ka卯a链(以下均简称IgK)信号肽的编码基因连接了IgK信号肽编码序列的丽Pl融合基因序列为(SEQ ID NO. 3):TGCTGA其中，下划线部分为IgK信号肽编码序列连接了IL-2信号肽编码序列的HNP1融合基因序列为(SEQ ID NO. 4):AACCTGCATCTACCAGGGAAGACTCTGGGCATTCTGCTGCTGA其中，下划线部分为IL-2信号肽编码序列。更进一步的，上述真核表达载体具有SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。 本发明所要解决的第二个技术问题是提供制备上述真核表达载体的方法。该方法包括以 下步骤a、从人淋巴细胞的总RNA中扩增得到人a-防御素成熟肽编码基因片段；b、将人a -防御素成熟肽编码基因片段转入真核表达载体中并置于表达启动元件之后。本发明所要解决的第三个技术问题是提供上述真核表达载体的脂质体复合物。优选使用 阳离子脂质体。进一步的，上述脂质体复合物中的脂质体由摩尔比为l:l的DOTAP及Chol组成，脂质体与 真核表达载体的质量比优选为3 5:1 。本发明所要解决的第四个技术问题是提供制备上述脂质体复合物的方法。该方法包括以 下步骤将离子脂质体与重组载体混合；置于液氮中迅速冷却，然后取出放入4摄氏度冰箱 中待其融化，反复冻融1 6次；冻融完毕后，放入冷冻干燥机中冻干，即得。本发明所要解决的第五个技术问题是提供上述真核表达载体或着脂质体复合物在制备抗 肿瘤药物组合物中的用途。本发明所要解决的第六个技术问题是提供一种药物组合物。该药物组合物是由上述的真核表达载体或着脂质体复合物添加药学上可接受的辅助性成分制备而成。该药物组合物主要 通过注射给药，能够通过促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤血管生长并诱导肿瘤免疫，起抗肿瘤 的作用。需要说明的是，本发明中生产和操作重组基因、重组载体和抗肿瘤注射剂的相关技术是 本领域技术人员可以根据公开的操作指南和手册完成的描述的技术完成的。本发明采用具有分泌功能的信号肽基因序列与具有肿瘤细胞毒性的人a -防御素成熟肽 编码基因构建融合基因，并用融合基因构建重组质粒，实施基因治疗，直接将融合的人a-防御素成熟肽基因引入肿瘤细胞内部，证实了可在肿瘤内部表达并分泌具有杀伤活性的人a -防御素成熟肽，表达的人a-防御素成熟肽产生了明显的抗肿瘤作用，避开了人a-防御素 成熟肽活性易受血清蛋白及Ca离子浓度影响的缺点，降低了治疗成本，突破了之前本领域认 为不能采用HNPs多肽实施肿瘤体内治疗的论断。并为在此基础上结合其他的肿瘤治疗手段进 行综合治疗提供了基础。本发明还优选出了a-防御素成熟肽基l (丽P1)基因是能够发挥促 进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤血管生成并介导肿瘤免疫的多重作用的理想效应基因。本发明利 用HNP1成熟肽编码序列重组载体的脂质体复合物对不同类型的肿瘤进行基因治疗，证实 HNP1能在肿瘤细胞内表达并分泌到肿瘤细胞外，表达的HNP1能在体内外有效促进肿瘤细胞凋 亡，并能在体内抑制肿瘤血管生长，更重要的是，本发明获得的DNA脂质体复合物，能够在 体内诱导产生特异的抗肿瘤免疫，增强并延长了治疗疗效。同时本发明HNP1成熟肽编码序列 重组载体的脂质体复合物，提高了基因药物的转染率，能够反复使用，避免了普通病毒载体 的毒性及不能长期反复使用的缺点，方便了进一步临床应用，并由于其治疗的多重效应，尤 其是其免疫效应，使其在肿瘤治疗中只需转染部分肿瘤细胞即能产生治疗作用，因而为癌症 的治疗提供了理想的基因药物。
图l HNP1全长及成熟片段的PCR产物。M， marker; 1，全长HNP1 PCR产物，全长片段约 280bps; 2，成熟HNP1 PCR产物，片段加上引物引入的信号肽约120bps。图2目的基因连接到pSecTag2B， PCR验证的电泳图谱(1% Agarose电泳)，其中M为 marker ， 1为从重组质粒扩增的人的丽P 1基因片段。图3验证重组质粒在RNA水平的表达以及转染重组质粒后分泌到细胞上清中HNP1的表达 量。A: RNA水平的表达。B: ELISA检测细胞上清中丽P1的表达量。Untreated组指未对改组 实施干预。图4 免疫组化检测HNP1在A549细胞内的表达及对A549细胞的影响。A:转染pSec-HNPl24小时后，部分细胞表现HNP1阳性，并清晰可见一部分死亡的细胞。B:转染pSec-HNPl 48 小时后，丽P1表达阳性的细胞较24小时少，但是死亡的细胞却明显增多。C，D:转染 pSecTag以及未处理的细胞(untreated)没有HNP1阳性，且细胞生长状态良好。图5 体外丽P1诱导肿瘤细胞凋亡。Hoechst 33258染色结果显示，转染了pSec-丽P1的 细胞表现出核固縮以及含有核碎片的凋亡小体(A-a)，而转染了pSecTag (A-b)， lipofectAMINE 2000 (B-c)，以及未处理的(untreated组，B-d)细胞则几乎没有凋亡细胞。 流式细胞检测结果进一步显示，细胞转染了pSec-HNP1 (C-a)， pSecTag (C-b)， LipofectAMINE 2000 (C-c)，以及不做处理(untreated) (C-d)后，凋亡率分别为45. 7%， 18. 2%， 4. 1%，及3. 6%。图6丽P1体内的抗肿瘤效应。A为A549裸鼠模型，B为4Tl乳腺癌Balb/c模型。结果显示 ，pSec-丽Pl处理组与pSecTag和PBS组裸鼠相比表现出明显的肿瘤生长抑制。图7组织学分析与凋亡检测。H&E染色结果显示，对照组(pSecTag和PBS)肿瘤细胞 生长状态良好，很少有坏死和淋巴细胞浸润。而在治疗组(pSec-HNPl)肿瘤组织内则有明 显的淋巴细胞浸润和坏死；免疫组化染色结果显示治疗组(pSec-HNPl)肿瘤细胞内HNP1表 达阳性，而对照组则无丽P1的表达。TUNEL结果显示给与pSec-丽Pl治疗的肿瘤细胞凋亡明显 增加。图8 肿瘤组织内微血管免疫组化观察。A， pSec-HNP1; B， pSecTag; C， PBS; D，微 血管计数，pSecc-HNPl治疗裸鼠来源的肿瘤组织微血管密度明显下降。图9 pSecc-HNPl在Balb/c小鼠4Tl模型诱导产生特异的细胞免疫。51&释放实验显示， 来源于HNP1治疗小鼠的T细胞与载体组及生理盐水处理组比较，具有增强的特异的杀伤活性图10 pSecc-HNPl诱导宿主产生针对4Tl肿瘤细胞的抗体反应。l为载体处理组作为对照 ，2为pSecc-HNPl处理后出现肿瘤生长受到明显抑制的小鼠血清，2为pSecc-HNPl处理后出现 肿瘤消退的小鼠血清，结果表明，pSecc-HNPl治疗小鼠4Tl肿瘤后可以产生抗体。以下结合附图通过具体实施方式
的描述对本发明作进一步说明，但这并非对本发明的限 制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明 的基本思想，均在本发明的范围之内。
具体实施方式
实施例一 本发明重组载体的构建本实施例用RT-PCR方法从人淋巴细胞总RNA中扩增丽Ps片段，采用分子克隆手段将融合 基因克隆到目标载体，由于HNP1与HNP2具有高度相似性，目前NCBI的Gene Bank指定为同一 基因，即HNP1，故本发明克隆了并构建了HNP1成熟肽及HNP3成熟肽融合基因重组质粒，以 HNP1为例根据人HNP1基因序列设计并合成RT-PCR引物，将PCR产物直接插入克隆载体-T载体(购 自Promega公司)，采用引物序列如下全长HNP1上游引物(SEQ ID NO. 6) (full-HNP1-forward): 5'-ATAGGATCCGCCATGAGGACCCTCGC CATCCTTG-3'。 全长HNP1下游引物(SEQ ID NO. 7) (full-HNP1-reverse): 5'-GAGATATCAGCAGCAG AATGCCCAGAGTC-3'。 成熟HNP1上游引物(SEQ ID NO. 8) (mHNPl-forward)为 5'-GCGGCCCAGCCGGCCgcctgct attgcagaata-3'。 成熟HNPl下游引物(SEQ ID NO. 9) (mHNPl-reverse)为 5'-GAGATATCAGCAG CAGAATGCCCAGAGTC-3'。RT-PCR反应条件50°C 30 min; 94°C4 min; 94°C 30 s， 52°C 30 s， 72°C 30 s， 30 个循环，72。C 5 min。 PCR反应条件94。C 4 min; 94。C 30 s， 58。C 30 s， 72。C 30 s， 30个循环，72°C 5 min。扩增成熟肽基因片段的上，下游引物分别引入Sfi I和EcoRV酶切 位点。扩增出的丽Pl成熟肽编码基因序列为SEQ ID NO. l所示。反应完成后，1X琼脂糖凝胶电泳检测RT-PCR产物，结果表明扩增出与预期片段大小一 致的100+bps左右的DNA片段(图l)。随后将上述片段酶切后克隆到pSecTag2B，先利用上述 成熟肽引物PCR验证，结果能够扩增出目的片段(图2)，再经Invitrogen公司测序证实，表 明所得到重组质粒中的融合的HNP1成熟肽基因序列与预期一致，并且连在pSecTag2B自带的 IgK分泌信号肽之后，获得重组质粒pSecTag2B-HNPl，以下简称pSec-HNPl ，其全序列如SEQ ID NO. 5所示。本发明以类似方法采用表达载体pcDNA3. l构建了融合IL-2分泌信号肽与a -防 御素成熟肽的融合基因表达载体。采用与此相似的方法，获得HNP3成熟肽的基因，其序列如SEQ ID N0.2所示。并将其连 接在pSecTag2B自带的Igk分泌信号肽之后，获得了HNP3的重组质粒pSecTag2B-丽P3，以下简 称pSec-HNP3。然后，通过比较pSec-丽Pl及pSec-丽P3对不同肿瘤细胞的抑制活性，利用MTT法筛选pSec-HNPl及pSec-HNP3中活性较强的重组融合基因。实验方法将获得的重组质粒采用可以去内毒素的QIAGEN质粒抽提试剂盒小规模制备质 粒，将获得的质粒定量。分别采用A549细胞、小鼠CT26及4T1细胞铺被96孔板，每孔细胞l X 104个，细胞贴壁生长8小时后，利用商售的Invitrogen公司lipofectine2000转染试剂盒分 别转染pSec-HNPl或pSec-HNP3，每孔转入质粒5ng、 10ng及20ng，每个浓度三复孔，每种质 粒均转染三种肿瘤细胞，转染后分别于24小时、48小时采用MTT法检测肿瘤生长情况。实验结果MTT实验结果显示pSec-丽Pl对肿瘤的抑制活性优于pSec-丽P3，故本发明在 下面的实施例中主要采用pSec-HNPl来制备脂质体复合物并进行效果验证。实施例二 制备本发明重组载体的脂质体复合物首先利用QIAGEN公司去内毒素的大量质粒的提取试剂盒抽提pSec-HNPl及pSecTag2B载体 质粒并定量。然后通过如下方法制备HNP1成熟肽重组载体的脂质体复合物。获得脂质体精确称取DOTAP 58mg，胆固醇Chol 32mg (mol/mol=l: 1)，于100ml旋蒸 瓶中，加入20ml氯仿溶解，之后在旋转蒸发器上旋转蒸发45分钟以除去氯仿，置于真空干燥 机中干燥12小时后，取出，加入一定量5%葡萄糖溶液，60摄氏度下探头超声(功率为400W) IO分钟，将所得液体继续在60摄氏度下孵化1小时，即得。制备冻干粉针剂将阳离子脂质体与HNP1重组质粒按照质量比2 10:1于冻融管中混合 ，之后将冻融管置于液氮中迅速冷却，IO秒后取出，立刻将其放入4摄氏度冰箱中待其融化 ，如此反复冻融4次。最后一次冻融完毕后，将液体全部移入西林瓶中，再向其中加入20%甘 露醇注射液(保证最终体系中甘露醇质量不超过总质量的5%)，最后将液体放入冷冻干燥机 中冻干，即得pSec-HNPl脂质体DNA复合物，采用相同的方法制备pSecTag2B载体的脂质体复 合物作为后期实验的对照品使用。质粒DNA包封率的测定并计算质粒浓度冻干粉采用5%的葡萄糖复溶后移入离心管中， 10000rpm离心，取上清，测260nm下吸收值，g卩包封率=00260 (上清液)/ OD260 (包裹前 )X100%，在此基础上计算重组质粒的量进行下一步动物实验。在脂质体复合物的制备中，本发明通过包封率，脂质体复合物在溶液状态下的稳定性， 以及转染效率三个方面来评价脂质体与重组载体的比例。得出脂质体与重组载体的较优比例 为重量比3 5:1，最佳比例为3:1。鉴于在体内实验中本发明均采取了该脂质体复合物，在 下述实例中，若非特别说明，仍以pSec-丽Pl及pSecTag指代相应的脂质体复合物，其中脂质 体与重组载体的比例均为重量比3:1。实验例三.本发明重组载体在体外的表达能力及抗肿瘤活性1、 本发明重组载体表达的检测将重组质粒转染A549细胞，48小时后收集细胞提取RNA做RT-PCR，只有转染了 pSec-丽Pl质粒的细胞可以扩增出丽Pl成熟肽基因片段，而转染单纯的pSecTag质粒，以及未 转染的A549细胞的RNA不能扩增出目的条带(图3A)。为了检测HNP1的分泌以及上清中HNP1的表达量，于转染后24、 48小时分别收集细胞上清 ，通过ELISA进行检测。结果显示，转染后24小时上清中HNPl的量约为102ng/ml，转染后48 小时丽Pl成熟肽的量约为120ng/ml，对照组细胞则无丽P1成熟肽的表达(图3B)。2、 本发明重组载体的抗肿瘤活性检测首先通过免疫组化方法检测了HNP1成熟肽在胞内的表达，结果发现在转染后24小时 HNP1成熟肽即有明显表达，在48小时即观察到阳性细胞的明显凋亡(图4， A-B)。进一步通 过Hoechst 33258染色，从形态学角度发现转染了pSec-HNPl的肿瘤细胞有明显的凋亡特征， 即核固縮，形成含核碎片的凋亡小体(图5， A-a)，流式细胞仪检测到凋亡明显增加(图5 ，B-eO实验例四本发明脂质体复合物的体内表达活性及抗肿瘤活性1、 实验方法首先建立人肺癌细胞A549裸鼠肿瘤模型。然后采用pSec-HNPl及pSecTag单次治疗肿瘤， 剂量为20yg， 50yg， 100yg，治疗后第三天收获肿瘤，检测丽P1的表达，在证实瘤内有 丽P1的表达后，分别构建人肺癌细胞A549裸鼠肿瘤模型及小鼠乳腺癌4T1的Balb/c肿瘤模型 ，分别分为3组PBS或生理盐水(n. s)处理组、空载体组(pSecTag)以及丽P1基因组，每 组10只，在肿瘤直径约3-5mm时予以治疗，瘤内注射100mg载体质粒或HNPl基因脂质体，2天 治疗一次，共治疗5次，观察肿瘤大小。2、 实验结果在瘤内注射pSec-丽Pl后24小时即有丽Pl的表达，丽P1的局部表达不仅高度富集在肿瘤 细胞内，还能有效分泌到细胞间隙，并能渗透到肿瘤血管内，结合到肿瘤血管壁上，在48小 时即能观察到肿瘤细胞的凋亡，并能观察到瘤周有淋巴细胞浸润，HNP1的表达呈现一定的剂 量依赖。实验期间各组均未观察到明显的毒副反应。pSec-HNPl治疗组肿瘤生长速度明显慢于空质粒组、PBS或n. s组，治疗中出现部分肿瘤 在治疗后肿瘤完全消退，部分小鼠肿瘤生长明显抑制(图6， A为A549模型，B为4T1模型)实验例五本发明脂质体复合物在体内抗肿瘤实验。1、 实验方法按实验例四的方法建立肿瘤模型，实施治疗，治疗结束后一周，收获肿瘤组织，检测注 射的脂质体复合物表达的HNP1成熟肽促进肿瘤凋亡的作用，HE染色检测治疗后肿瘤内肿瘤细 胞的形态、坏死或凋亡情况，免疫组化检测HNP1成熟肽的表达，进一步采用TUNEL法检测凋 亡水平。检测血管生成的抑制作用收获肿瘤组织，分别利用CD31抗体检测肿瘤内血管生成情况 ，计算肿瘤血管密度，比较瘤内血管密度差异。在Balb/c小鼠4Tl肿瘤模型中检测丽Pl治疗后的免疫作用，收获治疗后Balb/c小鼠的脾 细胞作为效应细胞，以4T1作为耙细胞，51&释放实验体外检测脾细胞对肿瘤细胞的特异的 杀伤活性。收获小鼠血清作为一抗，其中分别收取肿瘤消退的小鼠血清及肿瘤抑制小鼠血清 ，检测血清中是否产生针对4T1膜蛋白的特异抗体。2、 实验结果HE染色显示，脂质体复合物处理组小鼠瘤内坏死及凋亡明显，肿瘤内可见淋巴细胞浸润 ，TUNEL法检测证实，脂质体复合物治疗促进肿瘤细胞的凋亡(图7) 。 CD31染色发现， HNP1处理组肿瘤内的微血管密度明显下降，证明脂质体复合物在体内表达HNP1成熟肽能够抑 制肿瘤血管生成(图8) 。 ^Cr释放实验证实丽Pl成熟肽能够诱导小鼠产生特异的毒性CTL ( 图9)，而肿瘤消退的小鼠及肿瘤明显抑制的小鼠血清中均存在针对4T1膜蛋白的特异抗体( 图IO)。由本实例可知，本发明构建HNP1成熟肽脂质体复合物能够通过促进肿瘤细胞凋亡，抑制 肿瘤血管生成及诱导抗肿瘤免疫，在体内有效地抑制肿瘤生长。具有其它的肿瘤基因治疗药 物难以比拟的优势。以上的较优的具体实施方式
是对本发明作进一步的举例说明，但并非对本发明范围的限 制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以作出各种变型或改进，只要不脱离本发明 的基本思想，均在本发明的精神及所附上的权利要求书定义的范围之内。如由本领域常识可 知，若有不同的要求，本发明的抗肿瘤药物中重组丽P1成熟肽基因的载体的用量可以在一个 较大范围内变动。本领域技术人员可以根据一些已知的因素，诸如疾病的种类，病情严重程 度，病人体重，剂型，所选用药途径等很容易地加以确定。SEQUENCE LISTING〈110> 四川大学〈120>重组人HNP基因脂质体复合物、制备方法及用途 〈130> A080136k 〈160> 9〈170> Patentln version 3. 4〈210> 1〈211> 93〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial 〈400> 1gcctgctatt gcagaatacc agcgtgcatt gcaggagaac gtcgctatgg aacctgcatc 60 taccagggaa gactctgggc attctgctgc tga 93〈210> 2〈211> 90〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial 〈400> 2gactgctatt gcagaatacc agcgtgcatt gcaggagaac gtcgctatgg aacctgcatc 60 taccagggaa gactctgggc attctgctgc 90〈210> 3〈211> 171〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial 〈400> 3atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60 gacgcggccc agccggccgc ctgctattgc agaataccag cgtgcattgc aggagaacgt 120 cgctatggaa cctgcatcta ccagggaaga ctctgggcat tctgctgctg a 171〈210> 4〈211> 156〈212> DNA〈213> artificial〈220>
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ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac 1800
actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgggga tttcggccta I860
ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattaattct gtggaatgtg 1920
tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg 1980
catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga aagtccccag gctccccagc aggcagaagt 2040
atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc 2100ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact aatttttttt 2160
atttatgcag aggccgaggc cgcctctgcc tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc 2220
ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag ctcccgggag cttgtatatc cattttcgga 2280
tctgatcagc acgtgttgac aattaatcat cggcatagta tatcggcata gtataatacg 2340
acaaggtgag gaactaaacc atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc 2400
gcgacgtcgc cggagcggtc gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg 2柳
tggaggacga cttcgccggt gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc 2520
aggaccaggt ggtgccggac肌caccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc ，0
tgtacgccga gtggtcggag gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca
tgaccg卿t cggcgagcag ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca ，0
actgcgtgca cttcgtggcc gaggagcagg actgacacgt gctacgagat ttcgattcca 2760
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cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctgtatac 3000cgtcgacctc tagctagagc ttggcgtaat catggtcata gctgtttcct gtgtgaaatt 3060
gttatccgct cacaattcca cacaacatac gagccggaag cataaagtgt aaagcctggg 3120
gtgcctaatg agtgagctaa ctcacattaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt 3180
cgggaaacct gtcgtgccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt 3240
tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc 3300
tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg 3360
ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg 3420
ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac 3480
gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg 3540
gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct 3600
ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg 3660
tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct 3720
gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac 3780
tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt 3840
tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt atctgcgctc 3900tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca 3%0
ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat 4020
ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4080
gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt 4140
aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc 4200
aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg 4260
cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg 4320
ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc 4380
cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta 4440
ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg 4500
ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct 4560
ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 4620
gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 4680
ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 4了40
ctggtgagta ctc肌cc肌g tcattctgag肌tagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 4800gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 4860ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 4920cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 4980ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 5040aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 5100gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 5160gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc5192〈210> 6 〈211> 34 〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial〈400> 6ataggatccg ccatgaggaccctcgccatc cttg 34〈210> 7 〈211> 29 〈212> DNA〈213> artificial 〈220>〈223> artificial<400> 7gaga.tatcag cagcagaatg cccagagtc 29<210> 8〈211> 33〈212> DNA〈213> artificial〈220>〈223> artificial<400> 8gcggcccagc cggccgcctg ctattgcaga. a.ta 33<210> 9〈211> 29〈212> DNA〈213> artificial<220>〈223> artificial<400> 9gagatatcag cagcagaatg cccagagtc 29
权利要求
1. 含有并能表达人α-防御素成熟肽编码基因的真核表达载体。
2.根据权利要求l所述的真核表达载体，其特征在于所述的真核表达 载体为重组噬菌体载体、腺病毒载体或质粒载体。
3.根据权利要求2所述的真核表达载体，其特征在于所述的质粒载体 为pSecTag2B或pcDNA3. 1。
4.根据权利要求1 3任一项所述的真核表达载体，其特征在于所述 的人a-防御素成熟肽的编码核苷酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
5.根据权利要求1 4任一项所述的真核表达载体，其特征在于所述 的a -防御素成熟肽编码基因的5'端连接有免疫球蛋白信号肽编码基因或细胞因子信号肽编 码基因。
6.根据权利要求1 5任一项所述的真核表达载体，其特征在于所述 的免疫球蛋白信号肽编码基因为人IL-2分泌信号肽的编码基因、所述的细胞因子信号肽编码 基因为人免疫球蛋白IgK链信号肽的编码基因。
7.根据权利要求1 6任一项所述的真核表达载体，其特征在于具有 SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。
8.制备权利要求1 7任一项所述的真核表达载体的方法，其特征在 于包括以下步骤a、从人淋巴细胞的总RNA中扩增得到人a-防御素成熟肽编码基因片段；b 、将人a-防御素成熟肽编码基因片段转入真核表达载体中并置于表达启动元件之后。
9.权利要求1 7任一项所述的真核表达载体的脂质体复合物。
10.根据权利要求9所述的脂质体复合物，其特征在于脂质体由摩尔 比为l:l的DOTAP及Chol组成，脂质体与真核表达载体的质量比为3 5:1 。
11.制备权利要求9或10所述的脂质体复合物的方法，其特征在于包 括以下步骤冻将阳离子脂质体与重组载体混合；置于液氮中迅速冷却，然后取出放入4摄 氏度冰箱中待其融化，如此反复冻融1 6次；最后一次冻融完毕后，将液体放入冷冻干燥机中冻干，即得。
12，权利要求1 7任一项所述的真核表达载体或着权利要求9或10所 述的脂质体复合物在制备抗肿瘤药物组合物中的用途。
13， 一种药物组合物，其特征在于是由权利要求1 7任一项所述的真 核表达载体或着权利要求9或10所述的脂质体复合物添加药学上可接受的辅助性成分制备而 成。
全文摘要
本发明涉及重组人HNP基因脂质体复合物、制备方法及用途，属于基因治疗领域，所解决的技术问题是提供了一种新的肿瘤基因治疗的药物。该真核表达载体含有并能表达人α-防御素成熟肽编码基因，还能制备成脂质体复合物。本发明真核表达载体及其脂质体复合物能在肿瘤内部表达并分泌具有杀伤活性的人α-防御素成熟肽，产生了明显的抗肿瘤作用，避开了人α-防御素成熟肽活性易受血清蛋白及Ca离子浓度影响的缺点，为肿瘤的基因治疗提供了新的选择。
文档编号A61P35/00GK101280318SQ20081030184
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月30日 优先权日2008年5月30日
发明者莉 杨, 王永生, 魏于全 申请人:四川大学