专利名称：针对转铁蛋白受体的抗体以及其用于依赖于铁的肿瘤的免疫疗法的用途的制作方法
针对转铁蛋白受体的抗体以及其用于依赖于铁的肿瘤的免疫疗法的用途本发明的目标在于新的针对转铁蛋白受体的抗体(抗转铁蛋白受体的抗体)家族，所述抗体是完全人的且具有细胞毒性，并且所述抗体诱导人造血癌细胞的死亡。转铁蛋白(Tf)为80kDa的血清蛋白质，其作用是固定可溶性铁。在其与转铁蛋白受体(TfR)结合后，它被内吞入细胞中。内体的酸化引起构象改变，所述构象改变使铁在胞质溶胶中发生盐析。然后，Tf/TfR复合物被重新输出至膜，在那里回复至生理pH而引起Tf/TfR复合物的解离。人转铁蛋白受体(TfR)(细胞增殖的标志物)在铁的细胞吸收中和在细胞生长的调节中发挥着主要作用。长时间以来已经将其考虑作为对于各种不同病理学状态[其中包括，癌症(因为它在许多强烈增殖的细胞上过表达)和脑疾病(因为它在血脑屏障上表达)]来说令人感兴趣的靶标，以用于治疗性或诊断性的方法。因此，在最近25年中，已经借助于杂交瘤技术制作了一定数目的抗转铁蛋白受体(抗-TfR)的鼠类单克隆抗体(mAb)，并且已就其在体外和有时在体内在癌症的鼠类模型上的抑制效应(Daniels 等人，The transferrin receptor part I or part II, ClinImmunol. , 2006)或者作为用于祀向脑的载体(Pardridge, Drug targeting to thebrain, Pharm res 24:1733, 2007)来对它们进行了测试。在理论上，细胞毒性的抗转铁蛋白受体的单克隆抗体(抗-TfR mAb)用于癌症免疫疗法的应用不得不受限于在依赖于铁的细胞(例如强烈增殖的造血谱系)上所诱导的不希望的效应。然而，用诱导铁耗竭的mAb 42/6来进行的I期试验表现得令人鼓舞，因为在施用所述抗体期间未观察到在患者上的任何副作用(Brooks等人，Clin Cancer Res1:1259,1995)。但是，用抗体42/6在患者中未观察到对癌症的任何应答。很可能的是，该临床试验的失败归因于人抗小鼠抗体(HAMA)的对外(鼠类)状态(其在患者中弓丨发免疫应答)，和归因于在反复注射后随之而来的该抗体的快速降解。鼠类抗体A24(其为抑制生长的抗-TfR mAb)在体外对于成人中急性和慢性形式的T细胞白血病/淋巴瘤的样品(Moura等人,Bloodl03:1838, 2004 ；Callens等人,Leukemia22:42, 2008)以及对于小鼠中套细胞淋巴瘤的建立(Lepelletier等人，Cancer Res67:1145，2007)是有活性的。mAb A24干扰TfR的天然配体，带电荷的二铁转铁蛋白或全转铁蛋白(全-Tf)。A24减少全-Tf的内吞和因此减少铁进入细胞。此外，mAb A24通过干扰TfR再循环到细胞表面上而减少了 TfR的表达。在文献中被描述为细胞毒性的抗-TfR mAb单克隆抗体之中，它们都不抑制转铁蛋白与TfR的结合。它们的抗增殖或细胞毒性作用要么由于数个受体之间的桥联(其引 起TfR降解)而产生，要么由于ADCC (依赖抗体的细胞毒性)与⑶C (依赖补体的细胞毒性)的联合而产生(Daniels 等人，The transferrin receptor part I or part II, ClinImmunol.，2006)。由于知道TfR表达在某些静止细胞(红细胞谱系的细胞、脑血管内皮细胞、肝细胞、肾小管细胞)的表面上，因而这些抗体的作用方式可能呈现出一定的对于这些细胞类型的细胞毒性。迄今存在的所有抗-TfR抗体都是产生自动物的免疫接种的抗体。因此，作为治疗性试剂，它们具有不可忽略的潜在的免疫原性，这限制了它们的应用。目前，市场上还不存在有抗-TfR单克隆抗体。但是，存在有正在进行中的临床前研究，用于由MAT Biopharma公司开发的抗-TfR嵌合抗体(其应用于转移性黑素瘤)的发展。然而，该抗体的抗肿瘤活性通过ADCC (依赖抗体的细胞毒性)和CDC (依赖补体的细胞毒性)的募召来表现出来。因此，迄今在恶性血液病中所采用的治疗部分地基于化学疗法和针对某些受体的酪氨酸激酶活性的药理学抑制剂的使用。根据病理学状态以及肿瘤的阶段和等级来调整化学疗法。副作用是重大的，并且与所述治疗的特异性缺乏有关。药理学抑制剂经证实是更特异性的，但还是具有由于其与数个具有酶促活性的受体或细胞内信号传导分子的家族结合而引起的毒性。此外，在某些患者中看到了与突变的获得相关联的在治疗过程中的抗性出现。出版物Dl (“J. Mol. Biol. (2000)，301，1149-1161”)探讨了人单体 scFv 形式的抗体，其来自噬菌体文库，能够被内化到乳腺肿瘤细胞SKBR-3中而不被内化到具有相同细胞特异性的正常细胞中。在Dl中所描述的抗体H7，即更具体地片段scFv H7(scFv 单链可变区片段形式”)，能够抑制转铁蛋白与转铁蛋白受体的结合，以及乳腺肿瘤细胞SKBR-3的生长。片段scFv H7与全转铁蛋白就其与癌细胞SKBR-3的结合而言竞争性地反应。出版物D2 (“Molecular Immunology 44 (2007)，3377-3788”)提及了在本申请中特别地例示的六种抗体，在体外通过噬菌体展示以scFv形式的它们的获得，以及就其特异性地内化到乳腺肿瘤细胞SKBR-3之内的能力来对它们进行的选择。就其与转铁蛋白受体的特异性结合来描述了这六种抗体(参见上面所提及的Dl的结果)，并且假设了这六种抗体在抑制乳腺肿瘤细胞SKBR-3的细胞增殖中的效力。然而，该假设在出版物D3 (“Cancer Research, Vo I. 70，No. 13，2010 年 7 月)中将会被证明是无效的，在该出版物中表明，最后所述抗体不抑制这些细胞的增殖(第5500页，左栏的最后一段)。因此，抗体的确定仅是在寻找用于病理学状态例如癌症的治疗的解决方案中的第一步。这是因为，然后必须能够确定在哪些肿瘤细胞系上，和因此对于哪些治疗应用来说，所获得的抗体将能够是具有活性的，这常常经证明是困难的，因为一方面细胞系的巨大数目和另一方面难以预见的其行为。现在，发明人已经令人惊讶地发现，作为本发明目标的抗体对于淋巴瘤或白血病类型的癌症的治疗来说以及作为用于自身免疫性疾病或预防移植物排斥反应的免疫抑制齐Li，具有闻的潜力。因此，本发明的目的之一为提供新型的治疗性抗体，其靶向人转铁蛋白受体(TfR)并且对于癌症(特别是淋巴瘤或白血病类型的癌症)的治疗来说具有高的潜力。
本发明的另一个目的为提供新型的治疗性抗体，其靶向人转铁蛋白受体并且可以用于治疗自身免疫性疾病或预防移植物排斥反应。本发明的另一个目的为提供新型的抗体，其靶向人转铁蛋白受体并且可以用于将生物学活性分子(更特别地，细胞毒性试剂)定向运载到过表达TfR的肿瘤细胞之内。本发明的另一个目的为提供新型的抗体，其靶向人转铁蛋白受体并且可以用于定向运载诊断性分子，更特别地用于脑成像。由于下面所阐述的原因，作为本发明目标的新型抗体经证实是具有高治疗潜力的分子，并且达到了上面提及的所有目的。这是因为，本发明的发明人调制出了特异于转铁蛋白受体(TfR)的、完全人的且细胞毒性的新型单克隆抗体，其抑制转铁蛋白(Tf)与转铁蛋白受体(TfR)的结合，并因此使细胞丧失铁。更特别地，本发明的抗体诱导细胞的铁耗竭(细胞内铁浓度的下降)，其结果为细胞表面上铁受体(TfR)的增加。
特别有利地，作为本发明目标的人抗体在体外以及在体内对于造血系统来源的癌细胞具有抗增殖和细胞毒性活性。更特别地，本发明的目标在于新型分子构建物，其特征在于，所述分子构建物包含至少一个选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO: USEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15,SEQ ID NO: 16,SEQID NO: 17,SEQ ID NO: 18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20,SEQ ID N0:2USEQ ID NO:22,SEQID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQID NO:29,SEQ ID NO:30,SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:34,SEQID N0:35和SEQ ID N0:36，所述氨基酸序列相应于靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(“CDR” 互补决定区)(CDR-H)或轻链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(CDR-L)。“分子构建物”是指任何构建物(例如，分子、抗体或抗体片段等等)，其可以由本领域技术人员制备并且包含本申请中所定义的氨基酸序列SEQ ID NO: I至36中的任何一个。更具体地，本发明的分子构建物由选自下列的氨基酸序列中的至少一个构成SEQID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:36。更具体地，如此定义的序列相应于位于在靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的每条重链中编号为3的位置处(CDR3-H)或在靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的每条轻链中编号为3的位置处(⑶R3-L)的⑶R。更具体地，序列SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:21, SEQID N0:27 和 SEQ ID NO:33 相应于 “CDR3-H”，和序列 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 12, SEQ IDNO: 18、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 30 和 SEQ ID NO: 36 相应于 “CDR3-L”。根据本发明，所述分子构建物的序列SEQ ID NO: I至SEQ ID NO: 36中的至少一个包含在选自下列的氨基酸序列之一中SEQ ID NO: 37,SEQ ID NO: 38,SEQ ID NO: 39,SEQ IDNO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48，所述序列SEQ ID NO: 37至SEQ ID NO:48中的每一个相应于靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域(VH)或轻链可变结构域(VL)，所述序列SEQ ID N0:37 包含序列 SEQ ID NO: U SEQ ID N0:2 和 SEQ ID N0:3,
所述序列SEQ ID N0:38 包含序列 SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5 和 SEQ ID N0:6,所述序列SEQ ID N0:39 包含序列 SEQ ID NO:7, SEQ ID N0:8 和 SEQ ID N0:9,所述序列SEQ ID N0:40 包含序列 SEQ ID NO: 10,SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO: 12,所述序列SEQ ID NO: 41 包含序列 SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 14 和 SEQ ID NO: 15,所述序列SEQ ID NO: 42 包含序列 SEQ ID NO: 16,SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18,所述序列SEQ ID NO: 43 包含序列 SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20 和 SEQ ID NO: 21，所述序列SEQ ID NO: 44 包含序列 SEQ ID NO: 22,SEQ ID NO: 23 和 SEQ ID NO: 24，所述序列SEQ ID NO: 45 包含序列 SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26 和 SEQ ID NO: 27，
所述序列SEQ ID NO: 46 包含序列 SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29 和 SEQ ID NO: 30,所述序列SEQ ID NO: 47 包含序列 SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 33，所述序列SEQ ID NO: 48 包含序列 SEQ ID NO: 34、SEQ ID NO: 35 和 SEQ ID NO: 36。同样地，根据本发明，序列SEQ ID NO: 37至SEQ ID NO:48中的至少一个包含在选自下列的氨基酸序列之一中SEQ ID NO:49, SEQID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID N0:52、SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54，所述序列SEQ ID N0:49至SEQ ID N0:54中的每一个包含靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)，所述序列SEQ ID NO:49包含通过具有氨基酸序列SEQ ID NO: 109的连接肽彼此相连接的序列SEQ ID N0:37和SEQ ID N0:38,所述序列SEQ ID NO:50包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQID NO:39 和 SEQ ID NO:40，所述序列SEQ ID NO:51包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQID NO:41和 SEQ ID NO:42，所述序列SEQ ID NO:52包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQID NO:43 和 SEQ ID NO:44，所述序列SEQ ID NO:53包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQID NO:45 和 SEQ ID NO:46，所述序列SEQ ID NO: 54包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQID NO:47 和 SEQ ID NO:48。上面提及的不同序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:48也可以通过具有不同于SEQID NO: 109的序列的肽彼此相连接。如果例如减小连接肽的大小，则可获得“双抗体”类型的分子，然而，也可以考虑增加连接肽的大小。序列SEQ ID N0:49至SEQ ID N0:54中的每一个包含靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的整个重链可变结构域和整个轻链可变结构域。序列SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:47中的每一个定义靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的整个重链可变结构域(VH)。序列SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:48中的每一个定义靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的整个轻链可变结构域(VL)。SEQ ID N0:l-3、7-9、13-15、19-21、25-27 和 31-33 中的每一个定义靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(CDR-H)。SEQ ID N0:4-6、10-12、16-18、22-24、28-30 和 34-36 中的每一个定义靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的轻链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(CDR-L)。因此，序列SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:54涉及靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域和/或轻链可变结构域的整体或仅一部分。根据本发明的一个有利的实施方案，如上面所定义的分子构建物以单体的形式存在。
根据本发明的另一个有利的实施方案，如上面所定义的分子构建物以二聚体的形式存在。根据本发明的另外一个有利的实施方案，如上面所定义的分子构建物还包含Fe片段。优选地，根据本发明，如上面所定义的分子构建物更特别地为抗体或抗体片段。更准确地，本申请中所定义的序列SEQ ID N0:49至SEQ ID N0:54定义抗体片段而非“完整的”抗体，因为这些序列不包含在天然抗体(免疫球蛋白)中发现的恒定结构域。一般地，一种抗体以其重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的一级序列而区别于另一种抗体。对于给定类或亚类的抗体，恒定结构域的序列是相同的。因此，为了完全准确，用于定义本发明目标的在上面和下面所使用的术语“抗体”应当更特别地理解为“抗体片段”。本发明的抗体或抗体片段全都特异于TfR，但不具有相同的一级序列(参见SEQ IDN0:49至SEQ ID N0:54)。所述抗体通过其互补位(即抗原(在该情况下，TfR)上的表位的接触区域)而相区别。本发明的目标还在于核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编码如在上面所定义的氨基酸序列SEQ ID NO: I至SEQ ID NO: 36，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQID NO:55 至 SEQ ID NO:90 来表示。因此，SEQ ID NO: 55表示编码氨基酸序列SEQ ID NO: I的核苷酸序列，依此类推(SEQ ID NO: 56编码 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 57编码 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 58编码 SEQID NO: 4，SEQ ID NO: 59 编码 SEQ ID NO: 5，SEQ ID NO: 60 编码 SEQ ID NO: 6，SEQ ID NO: 61编码 SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 62 编码 SEQ ID NO: 8，SEQ ID NO: 63 编码 SEQ ID NO: 9，SEQID NO: 64 编码 SEQ ID NO: 10, SEQ IDNO: 65 编码 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 66 编码 SEQ IDNO: 12，SEQ ID NO: 67 编码 SEQ ID NO: 13，SEQ ID NO: 68 编码 SEQ ID NO: 14，SEQ ID NO: 69编码 SEQ ID NO: 15，SEQ ID NO:70 编码 SEQ IDNO:16, SEQ ID NO:71 编码 SEQ ID NO: 17，SEQ ID NO: 72 编码 SEQ ID NO: 18，SEQ ID NO: 73 编码 SEQ ID NO: 19，SEQ ID NO: 74 编码SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:75 编码 SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:76 编码 SEQ ID NO:22，SEQID NO: 77编码 SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 78 编码 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 79编码 SEQ IDNO: 25，SEQ ID NO: 80 编码 SEQ ID NO: 26，SEQ ID NO: 81 编码 SEQ ID NO: 27，SEQ ID NO: 82编码 SEQ ID NO: 28，SEQ ID NO: 83 编码 SEQ ID NO: 29，SEQ ID NO: 30 编码 SEQ ID NO: 84，SEQ ID NO:31 编码 SEQ ID NO:85，SEQ ID NO:32 编码 SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:33 编码SEQ ID NO: 87，SEQ ID NO:34编码 SEQ ID NO: 88，SEQ ID NO:35 编码 SEQ ID NO: 89，和 SEQID NO:36 编码 SEQ ID NO:90)。本发明的目标还在于核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编码如在上面所定义的氨基酸序列SEQ ID N0:37至SEQ ID NO:48，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO:91 至 SEQ ID NO: 102 来表示。因此，SEQ ID N0:91表示编码氨基酸序列SEQ ID NO: 37的核苷酸序列，依此类推(SEQ ID NO:92 编码 SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:93 编码 SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:94 编码SEQ ID N0:40, SEQ ID N0:95 编码 SEQ ID N0:41, SEQ ID N0:96 编码 SEQ ID N0:42, SEQID N0:97 编码 SEQ ID N0:43, SEQ ID N0:98 编码 SEQ ID NO:44, SEQ ID N0:99 编码 SEQID NO:45，SEQ ID NO: 100 编码 SEQ ID NO:46，SEQ ID NO: 101 编码 SEQ ID NO:47，SEQ IDNO: 102 编码 SEQ ID NO:48)。本发明还涉及核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编码如在上面所定义的氨基酸序列SEQ ID N0:49至SEQ ID NO:54，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ IDNO: 103 至 SEQ ID NO: 108 来表示， 所述SEQ ID NO: 103包含通过具有核苷酸序列SEQ ID NO: 110的连接肽彼此相连接的序列 SEQ ID N0:91 和 SEQ ID N0:92,所述SEQ ID NO: 104包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO:93和 SEQ ID NO:94，所述SEQ ID NO: 105包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO:95和 SEQ ID NO:96，所述SEQ ID NO: 106包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO:97和 SEQ ID NO:98，所述SEQ ID NO: 107包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO:99和 SEQ ID NO:100，所述SEQ ID NO: 108包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO: 101和 SEQ ID NO:102，SEQ ID NO: 103表示编码氨基酸序列SEQ ID NO: 49的核苷酸序列，依此类推(SEQID NO: 104编码 SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 105 编码 SEQ ID NO: 51，SEQ ID NO: 106编码 SEQID NO:52，SEQ ID NO: 107 编码 SEQ ID NO:53 JPSEQ ID NO: 108 编码 SEQ ID NO:54)。本发明还涉及分离的核酸分子，其包含如在上面所定义的核苷酸序列SEQ IDNO:55至SEQ ID NO: 108中的至少一个。同样地，本发明的目标还在于-表达载体，其包含如在上面所定义的核酸分子，-宿主细胞或生物，其包含如在上面所定义的表达载体。本发明的另一个目标在于药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种如在上面所定义的分子构建物，以及与之相联合的药学上可接受的载体。如上面所描述的，所述分子构建物优选地为抗体或抗体片段。根据一个有利的实施方案，在所述药物组合物中，所述分子构建物用于定向运载一个(或多个)生物学活性分子。
本发明的抗体具有内化特性(参见实施例I)，该内化特性使得它们成为对于发挥用于将所述生物活性分子递送至过表达TfR的癌细胞内的载体的作用来说令人感兴趣的工具。根据另一个有利的实施方案，在所述药物组合物中，所述分子构建物用于装载有一个(或多个)细胞毒性试剂和/或一个(或多个)具有诊断目的的试剂的脂质体(形成“免疫脂质体”)或纳米颗粒的靶向。本发明还涉及如在上面所定义的药物组合物，其用于在呈现出TfR过表达的病理学状态的治疗中作为药物的应用。 作为呈现出TfR过表达的病理学状态的例子，可以提及癌症，特别是淋巴瘤或白血病类型的癌症。根据本发明的一个有利的实施方案，针对癌症的治疗更特别地如此来进行-通过本发明的抗体在体外和/或在体内对于癌细胞的抗增殖和细胞毒性作用，和/ 或-通过本发明的抗体对于癌细胞死亡的诱导(经由使它们丧失铁)。本发明的目标还在于，用于抑制癌细胞的细胞增殖和/或诱导所述细胞的死亡的方法，其特征在于，所述方法包括向患者施用至少选自下列的物质-如在上面所定义的分子构建物，-如在上面所定义的药物组合物，以便使所述物质结合至所述癌细胞，并因此造成增殖的抑制和/或诱导癌细胞的死亡。本发明的另一个目标在于治疗癌症的方法，其特征在于，所述方法包括向患者施用至少选自下列的物质-如在上面所定义的分子构建物，-如在上面所定义的药物组合物，以便使所述物质结合至癌细胞的转铁蛋白受体，并因此造成增殖的抑制和/或诱导癌细胞的死亡。作为癌细胞的例子，可以提及造血系统来源的细胞。呈现出TfR过表达的病理学状态的另一个例子为自身免疫性病理学状态的例子。这是因为，在该特定情况下，正是细胞效应子呈现出TfR过表达。图I显示了命名为“SCFv-3TF12”的本发明的单价片段的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO:49)和核苷酸序列(SEQ ID N0:103)，其中重链和轻链通过连接肽彼此相连接。每个在上面的行表示SEQ ID N0:49，和每个在下面的行表示SEQ ID N0:103。序列SEQ ID NO: 49 的重链的 3 个 “CDR” 区(CDR1-H 至 CDR3-H SEQ ID NO: I 至SEQ ID 勵:3)和轻链的3个“0 ”区(0)1 1-1至0)1 3-1:5￡0 ID N0:4 至 SEQ ID N0:6)加了框并以粗体表示。重链(VH)包括第I位氨基酸至第119位氨基酸(SEQ ID NO:37)。轻链(VL)包括第135位氨基酸至第245位氨基酸(SEQ ID NO:38)。连接肽(SEQ ID NO: 109)包括第120-134位的15个氨基酸，其被表示为斜体并加有下划线(S GGGGSGGGGSGGGG)。编码SEQ ID NO: 109的核苷酸序列SEQ ID NO: 110是斜体的，加有下划线，并且为
小写字母。图2显示了命名为“scFv-3TF2”的本发明的单价片段的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 50)和核苷酸序列(SEQ ID NO: 104)，其中重链和轻链通过连接肽彼此相连接。每个在上面的行表示SEQ ID NO: 50，和每个在下面的行表示SEQ ID N0:104。序列SEQ ID N0:50 的重链的 3 个“CDR”区(CDR1-H至 CDR3-H :SEQ ID NO: 7 至 SEQID 勵:9)和轻链的3个“0 ”区(0)1 1-1至0)1 3-L SEQ ID NO: 10 至 SEQ ID NO: 12)力口了框并以粗体表示。 重链(VH)包括第I位氨基酸至第118位氨基酸(SEQ ID NO:39)。轻链(VL)包括第134位氨基酸至第243位氨基酸(SEQ ID N0:40)。连接肽(SEQ ID NO: 109)如图I中所定义它包括从第119至133位氨基酸的15
个氨基酸。图3显示了命名为“SCFv-3GH9”的本发明的单价片段的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列(SEQ ID N0:51)和核苷酸序列(SEQ ID N0:105)，其中重链和轻链通过连接肽彼此相连接。每个在上面的行表示SEQ ID NO: 51，和每个在下面的行表示SEQ ID NO: 105。序列SEQ ID N0:51 的重链的 3 个 “CDR” 区(CDR1-H 至 CDR3-H:SEQ ID NO: 13 至SEQ ID 勵15)和轻链的3个“0 ”区(0)1 1-1至0)1 3-L SEQ ID N0:16至SEQ ID NO: 18)加了框并以粗体表示。重链(VH)包括第I位氨基酸至第118位氨基酸(SEQ ID N0:41)。轻链(VL)包括第134位氨基酸至第242位氨基酸(SEQ ID NO:42)。连接肽(SEQ ID NO: 109)如图I中所定义它包括从第119至133位氨基酸的十五
个氨基酸。图4显示了命名为“scFv-C 3. 2”的本发明的单价片段的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 52)和核苷酸序列(SEQ ID N0:106)，其中重链和轻链通过连接肽彼此相连接。每个在上面的行表示SEQ ID NO: 52，和每个在下面的行表示SEQ ID N0:106。序列SEQ ID N0:52 的重链的 3 个 “CDR” 区(CDR1-H 至 CDR3-H:SEQ ID NO: 19 至SEQ ID 勵:21)和轻链的3个“0 ”区(0)1 1-1至0)1 3-1:5￡0 ID NO:22 至 SEQ ID NO:24)加了框并以粗体表示。重链(VH)包括第I位氨基酸至第118位氨基酸(SEQ ID NO:43)。轻链(VL)包括第134位氨基酸至第243位氨基酸(SEQ ID NO:44)。连接肽(SEQ ID NO: 109)如图I中所定义它包括从第119至133位氨基酸的15
个氨基酸。图5显示了命名为“SCFv-3TG9”的本发明的单价片段的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 53)和核苷酸序列(SEQ ID NO: 107)，其中重链和轻链通过连接肽彼此相连接。
每个在上面的行表示SEQ ID NO: 53，和每个在下面的行表示SEQ ID N0:107。序列SEQ ID N0:53 的重链的 3 个 “CDR” 区(CDR1-H 至 CDR3-H:SEQ ID NO: 25 MSEQ ID 勵:27)和轻链的3个“0 ”区(0)1 1-1至0)1 3-1:5￡0 ID NO:28 至 SEQ ID NO:30)加了框并以粗体表示。重链(VH)包括第I位氨基酸至第117位氨基酸(SEQ ID N0:45)。轻链(VL)包括第133位氨基酸至第241位氨基酸(SEQ ID NO:46)。连接肽(SEQ ID NO: 109)如图I中所定义它包括第118至132位氨基酸。图6显示了命名为“SCFv-3GH7”的本发明的单价片段的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的氨基酸序列(SEQ ID NO: 54)和核苷酸序列(SEQ ID NO: 108)，其中重链和轻链通过连接肽彼此相连接。
每个在上面的行表示SEQ ID NO: 54，和每个在下面的行表示SEQID N0:108。序列SEQ ID N0:54 的重链的 3 个“CDR” 区(CDR1-H 至 CDR3-H:SEQ ID N0:31 至SEQ ID 勵:33)和轻链的3个“0 ”区(0)1 1-1至0)1 3-1:5￡0 ID NO:34 至 SEQ ID NO:36)加了框并以粗体表示。重链(VH)包括第I位氨基酸至第119位氨基酸(SEQ ID NO:47)。轻链(VL)包括第135位氨基酸至第243位氨基酸(SEQ ID NO:48)。连接肽(SEQ ID NO: 109)如图I中所定义它包括从第120至134位氨基酸的15
个氨基酸。图7图解说明了序列SEQ ID NO:49至SEQ ID NO:54的本发明的六种抗体(如前面所定义并且在前面的图I至6中所描述的)对于TfR的特异性。将LS-174T细胞与不同浓度的全转铁蛋白(Sigma)以所示浓度于4°C温育一小时。抗-TfR scFv噬菌体或特异于受体ErBb2 (其存在于LS-174T细胞上)的对照scFv-F5噬菌体的结合，借助于针对噬菌体衣壳的蛋白p8的小鼠抗体(抗_M13，GEhealthcare)来定量，然后借助于识别小鼠免疫球蛋白的荧光抗体通过FACS来测量。MFI (%)信号表示相对于在竞争者转铁蛋白不存在下所获得的MFI而言的平均荧光强度(MFI)。图8显示了序列SEQ ID N0:49至SEQ ID NO:54的本发明的六种抗-TfR抗体(抗-TfR scFv)的表位的表位图谱绘制。将过表达TfR的肿瘤细胞LS-174T在IOii g/ml的可溶性抗-TfR抗体或针对肉毒杆菌毒素的对照抗体(Bot)存在下于4°C温育一小时。然后，向所述细胞添加IO11 cfu/ml的抗体噬菌体(scFv噬菌体)并且于4°C保持一小时。抗-TfR scFv噬菌体或特异于受体ErBb2的对照scFv-F5噬菌体的结合，以与在图7中所描述的同样的方式来进行定量。MFI (%)信号表示相对于在竞争者抗体不存在下所获得的MFI而言的平均荧光强度(MFI)。图9图解说明了本发明的六种抗体“抗-TfR scFv”对于Tf/TfR结合的抑制。在浓度为20 u g/ml的抗-TfR scFv抗体存在下，将LS-174T细胞于4°C温育一小时。备选地，使用非特异于TfR的scFv抗体(Bot)，或者在仅PBS中进行温育。然后，添加500nM的荧光全转铁蛋白(Tf-FITC)并且于4°C保持一小时。在洗涤后，通过FACS来测量与所述细胞结合的Tf-FITC。信号被表示为相对于在没有抗体(PBS)时进行温育的细胞的MFI而言的MF I的百分比。
图10图解说明了在本发明的六种抗体“抗-TfR scFv”存在下，在3天期间在Jurkat系(来自于人T淋巴瘤)上的增殖测试。图11图解说明了在抗-TfR scFv (即3TF12和3GH7)存在下，在数种造血癌性系上的生存力测试。图10和11 :在包含IOii g/ml的可溶性抗体的RPMI培养基/SVF 10%中，以六次重复，用5000个Jurkat细胞/孔接种96孔平板。将所述细胞于37°C 在具有5%C02的潮湿的室中温育3天。借助于MTT测试(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay, Promega)来定量活细胞的数目。图12(参见图12-a、12-b、12-c和12_d)图解说明了在所述抗体的单价形式3TF12和3GH7转变成二价形式F12CH和H7CH的过程中获得的结果。图12-a和12-b :从由Bin Liu (UCSF)提供的细菌表达载体pSYN-HIS-CYS开始产生二价scFvCH抗体(即F12CH和H7CH)。更具体地，图12_a显示了 Superdex 75 FPLC色谱图，其显示了通过Ni-NTA亲和层析进行纯化的抗体的凝胶过滤洗脱谱线。图12-b显示了在凝胶过滤后分离出的二聚体抗体级分(在位于1500秒的峰处的大约55kDa的级分)的在SDS-PAGE凝胶上的分析，在还原(+DTT)或非还原(-DTT)条件下。图12-c和12-d :用于抑制全-Tf与Raji细胞的结合的所述抗体的二聚体形式或单体形式的比较。将Raji细胞与单价(图12-c)或二价(图12-d)抗体以所示浓度于4°C温育一小时。然后，向所述细胞添加500nM的全-Tf-FITC并且于4°C保持一小时。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。图13图解说明了二价形式的抗增殖效应。图13-a :在IOii g/ml的二价可溶性抗体存在下，使数种造血系统来源的细胞系温育数天。借助于 MTT 测试(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay, Promega) (0D 490nm)来定量细胞生存力。图13-b :将ERY-I细胞与单价的(左边)或二价的(右边)可溶性抗-TfR抗体以所示浓度温育三天。通过MTT测试来定量生存力。图14图解说明了抗-TfR F12CH和H7CH对于Raji和ERY-I系的细胞死亡的诱导。更具体地，图14-a图解说明了磷脂酰丝氨酸易位的标记。将Raji系(上方的图)和ERY-I系(下方的图)用10 u g/ml的抗体F12CH、H7CH和阴性对照Bot分别处理4天和2天。将细胞进行洗涤，然后用碘化丙锭(PI)和膜联蛋白-V-FITC进行标记。阴性PI且阳性膜联蛋白-V标记相应于凋亡的细胞，而阳性PI且阳性膜联蛋白-V标记相应于坏死的细胞。图14-b图解说明了线粒体膜去极化的标记。将Raji细胞系(上方的图)和ERY-I细胞系(下方的图)以与14-a中相同的方式进行处理。在洗涤后，将所述细胞用3，3’-二己基氧杂羰花青(DI0C6)进行标记。荧光强度的下降与线粒体电位的下降相关。图15图解说明了抗-TfR F12CH和H7CH的作用机制。在图15-a的左图中，在500nM的Tf-FITC存在下，将经固定的或未固定的Raji细胞于37°C或4°C温育三小时。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。
图15-a的右图将Raji细胞与抗体以所示浓度于37°C温育一小时，在这之后在500nM的Tf-FITC存在下温育3小时。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。图15-b的左图将Raji细胞与浓度为10 ii g/ml的抗体温育4天。然后，在甘氨酸缓冲液(甘氨酸50mM，NaCl 500mM, pH 2. 8)中洗涤所述细胞，在这之后进行固定并且用Tf-FITC (500nM)进行标记，于37。。3小时。图15-b的右图将Raji细胞与10 U g/ml的抗体温育4天。然后，借助于裂解缓冲液(Tris-HCl pH 7. 550mM, NaCl 250mM, EDTApH 8 IOmM, DTT ImM, NP401%,蛋白酶抑制剂(Roche ))来获得蛋白质提取物。在SDS-PAGE上进行迁移后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。借助于抗-TfR的小鼠抗体(Zymed)和抗-a -肌动蛋白的山羊抗体(Santa-Cruz)来定量TfR和肌动蛋白(后者充当凝胶载荷对照)的表达。用两种与酶HRP相偶联的抗体(其识别对于TfR的小鼠免疫球蛋白和对于肌动蛋白的山羊免疫球蛋白)来进行检测。图15-c的左图在所示浓度的柠檬酸铁铵(FAC)存在下，将Raji细胞用10 ii g/ml的抗体F12CH或Bot处理4天。然后，洗涤所述细胞，并且以与前面相同的方式来获得 蛋白质提取物。在SDS-PAGE凝胶上进行迁移并转移到膜上后，借助于抗-TfR的小鼠抗体(Zymed)来定量TfR，和借助于抗- a -微管蛋白的小鼠抗体(Santa-Cruz)来定量a -微管蛋白(凝胶载荷对照)。图15-c的右图在25iiM的柠檬酸铁铵(FAC)或硫酸锌(ZnS04)存在下，用5 ii g/ml 的抗体处理 ERY-1 细胞。借助于 MTT 测试(CellTiter 96 Aqueous One Solution CellProliferation Assay, Promega)来定量细胞生存力。图16图解说明了抗体F12CH的体内研究。图16-a :以4Gy对无胸腺裸鼠进行辐射，在这之后向每只动物皮下注射2百万个ERY-I细胞。一旦肿瘤达到200mm3的平均体积，就将这些小鼠分配在三只笼中，每只笼包含五只小鼠。然后，在与在Jtl时肿瘤的定位位点相对的一侧向每只小鼠通过腹膜内途径每周两次注射200 u I体积的PBS或包含200 u g抗体的PBS。借助于游标卡尺根据下式来测量肿瘤生长体积=O/6)x(长+宽)3。在J25时处死小鼠。用Mann-Whitney检验来分析组之间的平均值的差异(*表明P〈0. 01，**表明p〈0. 005)。图16-b :在取出后，将肿瘤固定，然后用苏木精-伊红-藏红花色素(HES)进行标记。图16-c :将FMA3、P815 (源自鼠类肥大细胞瘤的P815和FMA3系)和ERY-I细胞与生物素化的小鼠全转铁蛋白(Tfm) (Rockland)以所示浓度于4°C温育一小时。借助于与藻红蛋白相偶联的链霉抗生物素蛋白(BD Pharmingen)来检测Tfm与细胞的结合。在洗洚后，通过FACS来测量荧光。图16-d的左图将FMA3细胞与浓度为50 u g/ml的抗体3TF12 (单体的)或抗体Bot于4°C温育一小时。所述抗体与细胞的结合借助于针对抗体3TF12和Bot的myc标签的二抗(抗c-myc, Sigma),然后借助于与藻红蛋白相偶联的抗小鼠免疫球蛋白的抗体(BDPharmingen)来进行测量。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。实心的灰色曲线相应于Bot标记的荧光，而透明的曲线相应于3TF12标记的荧光。图16-d的右图将FMA 3细胞与浓度为50 u g/ml的抗体F12CH (二聚体的)或抗体Bot于4°C温育一小时。所述抗体与细胞的结合借助于针对抗体F12CH和Bot的组氨酸标签的二抗(五-His抗体，Qiagen)，然后借助于与藻红蛋白相偶联的抗小鼠免疫球蛋白的抗体(BD Pharmingen)来进行测量。在洗涤后，通过FACS来测量荧光。实心的灰色曲线相应于Bot标记的荧光，而透明的曲线相应于F12CH标记的荧光。图17显示了在用F12CH处理的人血单核细胞(PBMC)上的增殖测试。将所述细胞以2X IO4个细胞/孔接种在补充有IL2 (50ng/ml)的RPMI培养基，10%SVF中。所述细胞用抗体Bot或F12CH (在细菌中产生的二聚体形式)以所示浓度处理3天。借助于MTT测试(CellTiter96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)来测量生存力(OD 490nm)o图18显示了抗体Bot-Fc和F12_Fc的scFv-Fc形式的研究。图18(a):在还原和非还原条件下，关于抗体Bot-Fc和F12-Fc的纯化的在SDS-PAGE凝胶上的分析。每个凝胶孔中放置I U g的抗体。
图18(b):通过抗体Bot-Fc (灰色)和F12-Fc (黑色)来进行的人HMC1. 2细胞(左边)和鼠类Ba/F 3细胞(右边)的膜标记。将所述细胞与10 u g/ml的所述抗体于4°C温育I小时。借助于针对人Fe片段并且与藻红蛋白相偶联的二抗(Rockland)来检测所述scFv-Fc与细胞的结合。图18(c):两种形式的scFv抗体相比于scFv-Fc抗体的对于HMC1. 2系的增殖的效应的测试。将HMC1. 2细胞(104/孔，以六次重复)接种在具有IOii g/ml的所述抗体(要么以scFv形式，要么以scFv-Fc形式)的RPMI培养基，10%SVF中。在6天(scFv，左图)和4天(右图)结束时通过 MTT 测试(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay, Promega)来测量细胞生存力(0D 490nm)。图19显示了 ERY-I细胞对于抗体F12的scFv_Fc 二价形式的敏感性的评价。在包含0. 001,0. 01、0. 1、1或10 i! g/ml的可溶性抗体的RPMI培养基/SVF 10%中，以六次重复用4000个细胞/孔对96孔平板进行接种。将所述细胞于37°C在具有5%C02的潮湿的室中温育 4 天。借助于 MTT 测试(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell ProliferationAssay, Promega)来定量活细胞的数目。将结果表示为相对于没有抗体的对照而言的生存力的％。图20显示了在抗体3TF12存在下UT-7系的增殖的抑制。在包含O、I或10 y g/ml的可溶性抗体的MDM培养基/SVF 10%/2U/mL促红细胞生成素中，以六次重复用4000个细胞/孔对96孔平板进行接种。将所述细胞于37°C在具有5%C02的潮湿的室中温育4天。借助于MTT测试(CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)来定量活细胞的数目。结果代表了依照所应用的抗体浓度而变化的在490nm处的吸光度值。下面的实施例举例说明了本发明，它们无论如何不是要限制本发明。实施例I :产生自功能选择的六种不同的抗-TfR抗体在体外通过噬菌体展示以scFv形式(单链可变区片段形式)获得了抗-TfR抗体，并且就其被特异性地内吞(内化)到乳腺肿瘤细胞(SKBR3)内的能力进行了选择。该选择使得能够获得各具有28kDa的分子量的6种抗体，分别命名为3TF12 (SEQID N0:49)、3TF2 (SEQ ID N0:50)、3GH9 (SEQ ID N0:51)、C3.2 (SEQ ID N0:52)、3TG9 (SEQID N0:53)和 3GH7 (SEQ ID NO:54)。
这些单链可变区片段(scFv)也称为单价片段，并且表示单体形式。本发明的抗体特异于TfR:通过全转铁蛋白的存在，以剂量依赖性方式抑制了每种抗-TfR scFv噬菌体的结合(图7)。它们识别邻近的或共同的表位通过可溶性抗-TfRscFv的存在，抑制了每种抗-TfR scFv噬菌体的结合(图8)。它们叠盖住全转铁蛋白(全-Tf )与TfR的结合位点每种抗-TfR scFv或多或少显著地抑制全-Tf与TfR的结合，其中对于3TF12和3GH7出现最大抑制(图9)。实施例II :所述抗-TfR抗体的抗增殖效应和其作用机制的研究造血系统来源的癌细胞具有高的对铁的需求。在六种抗-TfR scFv存在下，在3天期间，在从T急性淋巴细胞白血病发展出的Jurkat系上进行增殖测试。仅抗体3TF12和3GH7对于Jurkat系具有弱的但可重现的抗增殖活性(图10)。对于Jurkat系具有抗增殖效应的抗体，即3TF12和3GH7，也是最好地抑制Tf与TfR的结合的那些抗体。为了确定该抗增殖效应是所述抗体所特有的，还是所使用的细胞系的来源所特有的，在10 u g/ml的抗体3TF12或3GH7存在下，在数天期间测试了五种其他造血系统来源的癌系的生存力(图11)。依赖于所测试的细胞类型，观察到明显的抗增殖效应(对于Raji系和ERY-I系，直至80%的抑制)。单体形式的所述抗体变为二聚体形式(F12CH，对于3TF12 ;和H7CH，对于3GH7)使得能够增加所述抗体对于TfR的亲和力所述抗体的二价形式改善了对于Tf结合到TfR上的抑制(图12-a至12-d)。改善了抗增殖效应。二聚体或二价的可变区片段的分子量为大约55kDa。这种形式改变使得能够增强单价scFv对于所有所测试的系的抗增殖效应(图13)，以及降低关于每种抗体的IC5tl (表I)。表I :通过于在抗体(以单体或二聚体形式)存在下温育三天的ERY-I系之上的增殖测试，对于每种抗体所获得的IC5tl的比较。
权利要求
1.分子构建物，其特征在于，所述分子构建物包含至少一个选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO: U SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4、SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:6、SEQID NO:7,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30,SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36，所述氨基酸序列相应于靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(“CDR”，互补决定区)(CDR-H)或 轻链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(CDR-L)。
2.根据权利要求I的分子构建物，其特征在于，所述分子构建物由选自下列的氨基酸序列中的至少一个构成SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO:15,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:30,SEQ IDNO:33 和 SEQ ID NO:36。
3.根据权利要求I的分子构建物，其特征在于，序列SEQID NO: I至SEQ ID NO: 36中的至少一个包含在选自下列的氨基酸序列之一中SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38, SEQ IDNO:39,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48, 所述序列SEQ ID NO: 37至SEQ ID NO:48中的每一个相应于靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域， 所述序列 SEQ ID NO:37 包含序列 SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2 和 SEQ ID NO:3， 所述序列 SEQ ID NO:38 包含序列 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6, 所述序列 SEQ ID NO:39 包含序列 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9,所述序列 SEQ ID N0:40 包含序列 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11 和 SEQ ID NO: 12，所述序列 SEQ ID N0:41 包含序列 SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 14 和 SEQ ID NO: 15，所述序列 SEQ ID NO:42 包含序列 SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18， 所述序列 SEQ ID NO:43 包含序列 SEQ ID NO: 19, SEQ ID N0:20 和 SEQ ID NO:21, 所述序列 SEQ ID N0:44 包含序列 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 和 SEQ ID NO:24, 所述序列 SEQ ID NO:45 包含序列 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 和 SEQ ID NO:27, 所述序列 SEQ ID N0:46 包含序列 SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:30, 所述序列 SEQ ID NO:47 包含序列 SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32 和 SEQ ID NO:33, 所述序列 SEQ ID N0:48 包含序列 SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35 和 SEQ ID NO:36。
4.根据权利要求3的分子构建物，其特征在于，序列SEQID NO:37至SEQ ID NO:48中的至少一个包含在选自下列的氨基酸序列之一中SEQ ID NO:49, SEQ ID NO: 50, SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54， 所述序列SEQ ID N0:49至SEQ ID NO:54中的每一个包含靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域和轻链可变结构域， 所述序列SEQ ID NO:49包含通过具有氨基酸序列SEQ ID NO: 109的连接肽彼此相连接的序列 SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38,所述序列SEQ ID NO:50包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQ IDNO:39 和 SEQ ID NO:40， 所述序列SEQ ID NO:51包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQ IDNO:41 和 SEQ ID NO:42， 所述序列SEQ ID NO:52包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQ IDNO:43 和 SEQ ID NO:44， 所述序列SEQ ID NO:53包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQ IDNO:45 和 SEQ ID NO:46， 所述序列SEQ ID NO:54包含通过连接肽SEQ ID NO: 109彼此相连接的序列SEQ IDNO:47 和 SEQ ID NO:48。
5.根据权利要求4的分子构建物，其特征在于，所述分子构建物以单体的形式存在。
6.根据权利要求4的分子构建物，其特征在于，所述分子构建物以二聚体的形式存在。
7.根据权利要求I至6中任一项的分子构建物，其特征在于，所述分子构建物还包含Fe片段。
8.根据权利要求I至7中任一项的分子构建物，其特征在于，其为抗体或抗体片段。
9.核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编码在权利要求I中所定义的氨基酸序列SEQ ID NO: I至SEQ ID NO: 36，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO: 55至SEQ ID NO:90 来表示。
10.核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编码在权利要求3中所定义的氨基酸序列SEQ ID NO:37至SEQ ID NO:48，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO:91至SEQ ID NO: 102 来表示。
11.核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列分别编码在权利要求4中所定义的氨基酸序列SEQ ID NO: 49至SEQ ID NO: 54，并且所述核苷酸序列分别由序列SEQ ID NO: 103至SEQ ID NO: 108 来表示， 所述SEQ ID NO: 103包含通过具有核苷酸序列SEQ ID NO: 110的连接肽彼此相连接的序列 SEQ ID NO:91 和 SEQ ID NO:92， 所述SEQ ID NO: 104包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO: 93和SEQID NO:94, 所述SEQ ID NO: 105包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO: 95和SEQID NO:96, 所述SEQ ID NO: 106包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO: 97和SEQID NO:98, 所述SEQ ID NO: 107包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO: 99和SEQID NO:100, 所述SEQ ID NO: 108包含通过SEQ ID NO: 110彼此相连接的序列SEQ ID NO: 101和SEQ ID NO:102。
12.分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含有在权利要求9至11中任一项之中所定义的核苷酸序列SEQ ID NO:55至SEQID NO: 108中的至少一个。
13.表达载体，其特征在于，所述表达载体包含有在权利要求12中所定义的核酸分子。
14.宿主细胞或生物，其特征在于，所述宿主细胞或生物包含有在权利要求13中所定义的表达载体。
15.药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种根据权利要求I至8中任一项所定义的分子构建物，以及与之相联合的药学上可接受的载体。
16.根据权利要求15的组合物，其中所述分子构建物用于定向运载一个(或多个)生物学活性分子。
17.根据权利要求15的组合物，其中所述分子构建物用于装载有一个(或多个)细胞毒性试剂和/或一个(或多个)具有诊断目的的试剂的脂质体和/或纳米颗粒的靶向。
18.根据权利要求15至17中任一项的组合物，其用于在呈现出TfR过表达的病理学状态的治疗中作为药物的应用。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述病理学状态为癌症。
20.根据权利要求19的组合物，其中所述癌症为淋巴瘤或白血病类型的癌症。
21.根据权利要求18的组合物，其中所述病理学状态为自身免疫性病理学状态。
全文摘要
本发明的目标在分子构建物，其特征在于，所述分子构建物包含至少一个选自下列的氨基酸序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36，所述氨基酸序列相应于靶向人转铁蛋白受体(TfR)的抗体的重链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(“CDR”，互补决定区)(CDR-H)或轻链可变结构域的决定与抗原的互补性的区域(CDR-L)。本发明的目标还在于药物组合物，其包含治疗有效量的至少一种在本申请中所定义的分子构建物，以及与之相联合的药学上可接受的载体。
文档编号C07K16/18GK102741282SQ201080062265
公开日2012年10月17日 申请日期2010年12月16日 优先权日2009年12月16日
发明者J·D·马克斯, M-A·波尔, R·P·克雷潘 申请人:加利福尼亚大学董事会, 国家科研中心