全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于利用植物生物反应器生产一种抗肿瘤药物的领域，特别涉及一种全人 源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前利用化学疗法治疗癌症已经成为常规治疗方法，但化疗有其应用瓶颈。如今 急需另外的医疗方法突破化疗的瓶颈。肿瘤生物治疗（cancerbiotherapy)成为继手术、 化疗和放疗三大经典肿瘤治方法后的第四种方法。表皮生长因子受体（EGFR)是一种广泛 分布于人体各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，EGFR表达异常可以导致细胞信号通路持续活 化、最终导致肿瘤发生（非专利文献1)。EGFR是一种酪氨酸蛋白激酶型受体，其相对分子 质量约为170 000。廖刚等人认为EGFR在多种恶性肿瘤细胞中存在过表达的现象，EGFR的 过表达甚至突变在肿瘤发生与发展中很关键，并与肿瘤的恶性生物学行为和肿瘤患者的不 良预后有着紧密关系。
[0003] EGFR受体常高表达于恶性肿瘤细胞（非专利文献2)，EGFR已成为肿瘤生物治疗 的一个理想靶点。针对EGFR靶点的ScFv药物的研宄具有广阔的前景，利用配体或抗体将 治疗分子运送到高表达EGFR的肿瘤细胞局部也受到越来越多的关注。利用ScFv作为靶向 分子具有以下优点：分子量小，穿透性较强，能实现人源化，易对它进行改造，可大规模生产 等（非专利文献3)。目前国内外已经研制出多种ScFv，并用于临床（非专利文献4)。
[0004] 近年来靶向EGFR的肿瘤生物治疗方法在针对于肿瘤靶向治疗的药物研发及应 用受到了强烈的重视。以EGFR为靶点的治疗方式主要有以下两种：小分子酪氨酸激酶拮抗 剂和单克隆抗体。在肿瘤生物治疗中，EGFR这一靶点起关键作用。以EGFR为靶点的单克 隆抗体治疗，通过现代分子生物学和遗传学等技术方法在基因及细胞分子水平对其表达、 活性及其效应等多个环节进行有效抑制而达到治疗肿瘤的目的，是近年来抗肿瘤治疗新的 方法和手段之一。然而，由于目前制备的单克隆抗体多为鼠源性的，在体内易产生人抗鼠的 抗体反应，加之其分子量大，血管通透性差，给临床应用带来了一定的困难。而至今尚未见 全人源抗EGFRScFv的构建和应用的报道。
[0005] 现有技术文献
[0006] 非专利文献
[0007]非专利文献1 :MENDELSOHN J，BASELGA J. Epidermal growth factor receptor targeting in cancer[J]. Semin Oncol, 2006, 33(4):369-385.
[0008] 非专利文献 2:NormannoN,BiancoC,StrizziL,eta. 1TheErbB receptorsandtheirligandsincancer:anoverview[J]?CurrDrug Targets, 2005, 6 (3) : 243-257.
[0009] 非专利文献3 :赵晓蓉，戴维，彭吉林，黄鹤，袁晓梅，刘静，朱慧芬，沈关 心.EGFR特异性单链抗体与靶细胞结合的特异性[J].郧阳医学院学报200625 (4) : 202-204
[0010] 非专利文献 4:SunC,WirschingP,JandaKD.EnablingScFvsasmultidrug carriers:Adendriticapproach[J].BioorgMedChem, 2003, 11(8):176168.
【发明内容】
[0011] 为克服以上缺陷，本发明利用烟草这一植物生物反应器进行高效的表达全人源 EGFRScFv序列，该发明的基因序列高效表达后具有抗肿瘤作用。
[0012] 本发明目的是由以下技术方案实现的：
[0013] 一种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列，包括的核苷酸序列见SEQID N01〇
[0014] 本发明还提供了一种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，包 括以下步骤：
[0015]a、全人源EGFRScFv基因序列的获得，通过连接肽（Linkr)将重链可变区（VH)DNA 序列与轻链全长（VL)DNA序列连接起来，得到VH-L-VL基因序列；
[0016]b、全人源EGFRScFv基因序列的改变，对全人源EGFRScFv基因序列进行烟草密 码子偏好性基因序列改变，得到改变的VH-L-VL基因序列；
[0017] c、对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xbal、BamHl，TCTAGA为Xbal的酶 切位点，且序列中没有BamHl的酶切位点，为方便PBI121+GUS的载体构建，选择Xbal和 BamHl两个酶切位点，把碱基TCTAGA改动成密码子频率次之的密码子，改为TCAAGG，得到 Xbal_VH_L_VL_BamH1 基因序列；
[0018] d、在Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列两端加保护碱基，且在ATG后加组氨 酸标签（组氨酸标签不可切除）、在5'端的酶切位点内加3个终止码子，修饰成 XbalHISVH-L-VL-BamHl基因序列，既全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列。
[0019] 进一步的，本发明目的还可以由以下技术方案实现：
[0020] 一种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述重链可变区 (VH)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQIDN02。
[0021] -种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述轻链全长（VL) DNA序列包括的核苷酸序列见SEQIDN03。
[0022] 一种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述连接肽 (Linkr)包括的核苷酸序列见SEQIDN04。
[0023] 一种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤a所得 VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQIDN05。
[0024] -种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤b所得改 变的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQIDN06。
[0025] 一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤c所得 Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列包括的核苷酸序列见SEQIDN07。
[0026] -种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，所述步骤d所得全 人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列包括的核苷酸序列见SEQIDN01。
[0027] 本发明的一种全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列高效表达后具有抗肿瘤 作用。
[0028] 全人源EGFR ScFv(VH-L-VL)烟草密码子偏好基因序列蛋白质高级结构的预测，通 过ORF Finder预测VH-L-VL的ORF，可知它是一个完整的编码序列。通过理化性质分析，可 知VH-L-VL是一种稳定蛋白，且还是一种亲水性蛋白，通过TMHMM分析，可知VH-L-VL并非 是跨膜蛋白，TargetP对VH-L-VL蛋白的亚细胞定位进行预测，结果表明，VH-L-VL是分泌到 细胞周质的蛋白。以上各种结果符合ScFv的特点。
[0029] 利用植物作为工厂生产重要的药用蛋白，包括疫苗抗原和治疗的单克隆抗体 (mAbs)，有几个优势，首先，植物可以产生大量的蛋白质，有效和可持续，并在一定条件下， 可以有显着的优势，成本低。其次，植物的生长不需要的动物或人来源的营养素，因此动物 或人类病原体和毒素的污染的风险极低。第三，植物具有类似于哺乳动物的细胞，允许适 当的重组蛋白的翻译后修饰，可以表达具有功能的产物。将编码全抗体或抗体片段的基因 导入植物，在植物中可表达出具有功能的抗体，即具有结合特性的全抗体或部分抗体片段。 在植物中表达重组抗体，可以大规模在大田种植，条件相对简单，价格低廉，外源抗体基因 片段可以整合进入植物染色体中稳定遗传。植物细胞可以对表达的重组抗体蛋白进行正确 的组装和翻译后修饰，其表达产物还能保持良好的生物学特性；同时由于植物表达系统表 达的抗体以二聚体形式存在，因此表达产物的亲和力高，有助于全面发挥抗体的功能。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 本发明的全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列，克服了鼠源性基因序列在 体内易产生人抗鼠的抗体反应及其它源性基因序列导致的其它不良反应。利用烟草这一植 物生物反应器进行高效表达的全人源EGFR ScFv，烟草中表达的全人源EGFR ScFv的氨基酸 序列和它的原始序列相同，并且能形成类似于人类等哺乳类动物的复杂型糖链结构。本发 明对抗体药物的植物生产具有指导意义，可以大幅度降低抗体药物的生产成本，具有较高 的经济效益和社会效益。
【附图说明】
[0032]图1为本发明的基因序列在烟草中高效表达后所得蛋白质对乳腺癌细胞增值的 抑制作用结果图。
【具体实施方式】
[0033] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明而不应当也不会限制 权利要求书中所详细描述的本发明。
[0034] 实施例1
[0035] 一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，包括以下步骤：
[0036] a、全人源EGFR ScFv基因序列的获得，通过连接肽（Linkr)将重链可变区（VH)DNA 序列与轻链全长（VL)DNA序列连接起来，得到VH-L-VL基因序列；
[0037] 所述重链可变区（VH)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N02。
[0038] 所述轻链全长（VL)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N03。
[0039] 所述连接肽（Linkr)包括的核苷酸序列见SEQ ID N04。
[0040] 所得VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N05。
[0041] b、全人源EGFRScFv基因序列的改变，对全人源EGFRScFv基因序列进行烟草密 码子偏好性基因序列改变，得到改变的VH-L-VL基因序列；
[0042] 具体操作步骤包括：采用CodonUsageDatabase软件，得到烟草偏好性密码 子；用高频率烟草偏好性密码子对VH-L-VL基因序列中的密码子进行替换，得到改变的 VH-L-VL基因序列。
[0043] 所得改变的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQIDN06。
[0044] c、对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xbal、BamHl，T