一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用。将来自黑曲霉的按照毕赤酵母密码子偏好性优化后的β-甘露聚糖酶基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA中，转化至毕赤酵母KM71H中，可得到高表达量的重组β-甘露聚糖酶。该重组β-甘露聚糖酶最适温度为80℃。将本发明的β-甘露聚糖酶用于酶解魔芋精粉生产甘露低聚糖，底物浓度高，产物产量高，反应时间短，转化率高，具有较大的工业化生产潜力和应用价值。
【专利说明】一种耐高温重组β-甘露聚糖酶及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种耐高温重组β -甘露聚糖酶及其应用，属于生物工程【技术领域】。【背景技术】
[0002]甘露低聚糖是由甘露糖与葡萄糖以β_1，4糖苷键连接形成的聚合度为2~10的功能性寡糖。甘露低聚糖具有促进人和动物肠道内以双歧杆菌为代表的有益菌的增殖、改善肠道内菌群结构等功能性低聚糖共同的理化特性，同时也有清除自由基、增强机体抗氧化性的能力，若将甘露低聚糖作为功能性食品添加剂应用于工业开发，应用前景十分广阔。
[0003]魔芋是我国云南、四川、陕西、贵州等地盛产的多年生草本植物，其芋块茎中含有丰富的甘露聚糖。目前，魔芋粉主要被作为食用粗纤维或作为食品添加剂，开发利用程度不够。利用β_甘露聚糖酶将魔芋水解制成甘露低聚糖，可大大拓宽魔芋粉的应用范围，提高原料附加值，具有广泛的经济效益和社会效益。酶法制备甘露低聚糖的核心技术是采用高活力甘露聚糖酶和高浓度魔芋胶溶液。但目前发酵酶活力低，导致酶的生产和使用成本高；同时由于魔芋胶水溶液的粘度非常大，40g/L的魔芋胶已呈凝胶状态，可阻止酶对它的水解作用。因此国内外文献报道的魔芋胶酶水解工艺均采用10~30g/L的魔芋胶溶液，导致了酶解产物的后处理成本高、生产效率低。因此解决酶法制备甘露低聚糖所遇到的问题，首先要得到活力高稳定性好的β -甘露聚糖酶，其次是优化酶解工艺提高底物浓度。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种耐高温重组甘
露聚糖酶。
[0005]本发明还要解决的技术问题是提供上述β -甘露聚糖酶酶解高浓度魔芋粉制备甘露低聚糖的应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0007]一种耐高温重组β -甘露聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ IDNo:2所示。
[0008]一种耐高温重组甘露聚糖酶的编码基因，是满足下列要求的核苷酸序列之
[0009](I)编码如SEQ ID No:2所示氨基酸序列的核苷酸序列；
[0010](2)如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0011]一种表达耐高温重组甘露聚糖酶的重组菌株，该菌株为基因组上整合了权利要求2所述的β-甘露聚糖酶的编码基因的毕赤酵母。
[0012]其中，所述的毕赤酵母为分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
[0013]构建上述重组菌株的方法，它包括如下步骤:
[0014](I)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZ a A - man,该质粒以AOXl为启动子，并含有SEQ ID No:1所示的β -甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因；[0015](2)将重组密码子优化质粒pPICZ a A - man用Sac I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构成表达β -甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株；
[0016](3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达甘露聚糖酶的重组工程菌。
[0017]步骤(1)中，所述的重组质粒pPICZa A-man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZ a A中形成的重组质粒。具体方法参见Invitrogen公司的Mult1-Copy Pichia Expression Kit 操作手册。
[0018]步骤(2)中，在将重组密码子优化质粒pPICZ a A - man用Sac I酶切线性化之后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中之前，可将密码子优化质粒pPICZ a A - man导入大肠杆菌进行扩增。
[0019]上述耐高温重组β -甘露聚糖酶的制备方法,将上述重组菌在BMGY培养基中30°C培养至细胞密度OD6tltlnm = 2~6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD600nm为1.0以诱导表达，28 °C继续培养72h，每24h向培养基添加纯甲醇至终浓度为Iv/v%，将完成培养的重组菌经离心除去菌体，收集上清液，以分子量为IOKDa的超滤管，滤去小分量的蛋白和盐，经过分子筛Superdex75PrepGrade纯化,使用100mmol/L pH5.0的朽1檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，流速0.3ml/min洗脱，分布收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目的蛋白，该重组β_甘露聚糖酶酶活为1168IU/mg,最适反应温度为80°C,最适pH为5.0。
[0020]上述耐高温 重组甘露聚糖酶在酶法制备甘露低聚糖中的应用。
[0021]优选的是，以富含甘露聚糖的生物质为原料酶法制备甘露低聚糖，所述的生物质为魔芋粉、田菁胶、刺槐豆胶和瓜尔胶的一种或多种
[0022]更有选的是，以10_50IU/g的耐高温重组β -甘露聚糖酶添加量、于ρΗ4.0-6.0、50-90°C的震荡或搅拌条件下酶解底物浓度为30-200g/L生物质溶液，酶解0.5_8h后降温离心去残渣,上清即为甘露低聚糖。
[0023]最优选的是，底物浓度为100_200g/L的高浓度生物质，酶用量为10_50IU/g，酶初始阶段一次性加入，底物分多次添加(也就是说先按照100-200g/L的浓度计算生物质的总添加量，然后分多次添加)，添加时间间隔在l_3h，pH4.0-6.0、50-90°C的震荡或搅拌条件下共酶解4-12h后冷却后离心去残渣，上清即为甘露低聚糖。
[0024]有益效果:本发明与现有技术相比，具有如下优势:
[0025](I)本发明中的重组β_甘露聚糖酶产量高，活力强，稳定性好。
[0026](2)本发明中的重组β -甘露聚糖酶可高效酶解魔芋粉，β -甘露聚糖酶和魔芋粉的最适比例为50IU/g，低于以往报道。酶解50g/L魔芋粉时甘露低聚糖得率为78%，甘露低聚糖浓度为39g/L，单糖含量很低。
[0027](3)本发明中优化后的酶解工艺和魔芋粉补料添加工艺可大大提高重组β -甘露聚糖酶对高浓度底物的酶解效率，最高甘露低聚糖浓度为81g/L，高于以往报道。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1是β -甘露聚糖酶的SDS-PAGE图谱。
[0029]图2是魔芋粉酶法水解过程pH优化。[0030]图3是魔芋粉酶法水解过程酶解温度优化。
[0031]图4是魔芋粉酶法水解过程底物浓度优化。
[0032]图5是魔芋粉酶法水解过程酶用量优化。
[0033]图6是魔芋粉酶法水解过程酶解时间优化。
[0034]图7是β -甘露聚糖酶降解魔芋精粉离子色谱检测结果。
【具体实施方式】
[0035]以下结合具体实施例，进一步阐述本发明的操作方法。但是这些实施例仅用于详细说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
[0036]实施例1:重组质粒的构建。
[0037]重组质粒pPICZ a A - man是按照毕赤酵母密码子偏好性优化后的β -甘露聚糖酶基因(如SEQ IDNo:1所示)插入到质粒pPICZ a A中形成的。
[0038]实施例2:目的DNA的准备及毕赤酵母的电转化。
[0039]将所得到的大肠杆菌转化子培养，提取质粒，采用Sac I进行酶切，通过纯化试剂盒纯化得到线性的目 的DNA ;分别制取毕赤酵母GSl 15、ΚΜ71Η、SMDl 168、X - 33的电转感受态细胞；将80 μ I电转感受态细胞与10 μ I的线性化DNA混合，转入2mm电转化杯中电击，电击参数为:1500V, 25 μ F，200 Ω。
[0040]实施例3:转化子的筛选。
[0041]将电转化后的毕赤酵母GS115、ΚΜ71Η、SMDl 168, X - 33感受态细胞涂布于含有100 μ g/mL博来霉素的YPDS平板上，30°C条件下培养直至转化子出现，该转化子即为毕赤
酵母重组菌株。
[0042]挑取四种不同的单克隆，接种至25ml BMGY培养基中30°C培养至细胞密度OD6tltol=2~6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD6tltlnm为1.0以诱导表达。28°C继续培养96h，每24h向培养基添加100%甲醇至终浓度为lv/v%。将完成培养的毕赤酵母基因工程菌经离心除去菌体，收集上清液，测定粗酶液酶活。当宿主为GS115和SMD1168时，菌株所产β-甘露聚糖酶活力偏低；而枷71!1和乂-33作为宿主产酶能力较佳，甲醇缓慢利用型的ΚΜ71Η宿主更为突出，甲醇诱导96h后菌株发酵活力达到252IU/mL。
[0043]酶活测定方法和酶活单位定义:采用DNS定糖法测定β -甘露聚糖酶的活性。将0.9mL5.0g/L洋槐豆胶底物溶液(pH5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液)与0.1mL经适当稀释的酶液混合均匀，80°C反应lOmin，立即加入3.0mL DNS试剂，煮沸7min，冷却后定容至25mL，摇匀。在540nm处测定样品液吸光度。甘露聚糖酶活力单位定义为每分钟水解底物产生I μ mol的甘露糖所需的酶量定义为一个活力单位(IIU)。
[0044]实施例4:重组β -甘露聚糖酶的高密度发酵。
[0045]挑取转化有重组质粒pPICZ a A - man的重组毕赤酵母菌KM71H的单克隆，接种至BMGY培养基中30°C培养至细胞密度OD6tltol = 2~6，以体积分数10%的接种量接种于甘油含量为40g/L的BMS中进行发酵培养。发酵罐体积为3L，装液量1.5L，30°C、pH5.0(28%的氨水调控)的条件下培养。重组酵母在发酵罐培养24h左右后，当甘油耗尽，湿重在90 - 150g/L，继而以18.15mL/h/L的速度流加甘油4h。停止流加甘油至DO再次反弹后饥饿培养lh，当细胞湿量达到180 - 220g/L后，开始流加甲醇诱导培养。甲醇诱导96h后菌株发酵活力达到2319IU/mL。
[0046]实施例5:重组β -甘露聚糖酶的纯化。
[0047]发酵液离心所得上清通过分子量为IOKDa的超滤管进行超滤，滤去小分量的蛋白和盐，取超滤过的液体2mL,经过分子筛Superdex75PrepGrade纯化,使用100mmol/LpH5.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，流速0.3ml/min洗脱，分布收集洗脱峰中的样品，经过酶活测定，确定目的样品所在的收集管，得到电泳纯的目的蛋白，酶活为1168IU/mg。如图1所示，是经纯化酶液的SDS-PAGE图谱。其中M为标准分子量蛋白质，I为含有pPICZ a A质粒的重组毕赤酵母KM71H发酵上清液作为对照，2为含有pPICZ a A-man质粒的重组毕赤酵母KM71H发酵上清液，3为纯化的重组β -甘露聚糖酶。实施例6:重组β -甘露聚糖酶的酶学性质分析。
[0048]分析纯化后的β -甘露聚糖酶的酶学性质，β -甘露聚糖酶的最适pH为5.0,当pH处于4~6之间时，该酶均有大于95%的相对酶活，在pH3~7范围内保持70h，仍然具有90%以上的酶活力。β -甘露聚糖酶的最适反应温度为80°C，90°C时仍然具有高达76.8%的相对酶活。60°C下保温70h仍然保持90%以上的酶活力。
[0049]实施例7:魔芋粉酶法水解条件的工艺优化。
[0050](I)酶解pH:以125IU/g魔芋粉的酶液添加量、于80°C、170rpm、不同pH下(3.0~
6.0)酶解50g/L魔芋胶溶液，2h后HPLC检测pH对甘露低聚糖得率的影响，结果显示(图2)酶解pH为3.0时魔芋粉在缓冲液中吸水成固态，不发生酶水解反应，酶解pH在4.0~
5.0范围内，魔芋粉的酶解效率较高。
[0051](2)酶解温度:以125IU/g魔芋粉的酶液添加量、于pH5.0、170rpm、不同温度下(50~90°C )酶解50g/L魔芋胶溶液，2h后HPLC检测温度对甘露低聚糖得率的影响，结果显示(图3)酶解温度在50~90°C范围内，魔芋粉的酶解效率都较高。
[0052](3)底物浓度:以125IU/g魔芋粉的酶液添加量、于pH5.0、80°C、170rpm下酶解底物浓度在2.5~50g/L的魔芋胶溶液，2h后HPLC检测底物浓度对甘露低聚糖得率的影响，结果显示(图4)随着底物浓度的增加，甘露低聚糖产量相应增加，没有明显的传质受阻现象。
[0053](4)酶用量:以50g/L的魔芋胶溶液为底物，在pH5.0、80°C、170rpm下酶解，酶液添加量为12.5~125IU/g魔芋粉，2h后HPLC检测酶用量对甘露低聚糖得率的影响，结果显示(图5)当酶用量从12.5IU/g提高到50IU/g时，随着酶用量增加，甘露低聚糖产量不断提高，但从50IU/g继续增加到一定程度时甘露低聚糖产量增加不明显。
[0054](5)酶解时间:以50IU/g魔芋粉的酶液添加量、于pH5.0、80°C、170rpm下酶解底物浓度为50g/L的魔芋胶溶液，在O~4h范围内不同时间点取样，HPLC检测酶解时间对甘露低聚糖得率的影响，结果显示(图6)由于魔芋吸水性极强，Oh时呈现固态，随着时间的推移，甘露聚糖酶发生酶水解作用，底物不断的液化，反应2h后基本液化完全，酶解已经趋于停止，甘露低聚糖含量也不再上升。
[0055]实施例8:最优酶解条件下重组β -甘露聚糖酶对魔芋粉的降解分析。
[0056]以50IU/g魔芋粉的酶液添加量、于ρΗ5.0、80°C、170rpm下酶解底物浓度为50g/L的魔芋胶溶液，酶解2h后加温至100°C保持IOmin使酶灭活，冷却后离心去残渣，上清用于HPLC和离子色谱分析。HPLC结果显示，甘露低聚糖浓度为39g/L，甘露低聚糖得率为78%。图7为β-甘露聚糖酶降解魔芋粉离子色谱检测结果，从图中可知，该重组β-甘露聚糖酶酶解魔芋精粉主要产物为甘露二糖和甘露六糖，甘露二糖含量为45.5 %，甘露六糖为34.3%，甘露一糖、甘露三糖、甘露四糖含量分别为7.5%，8.8%，3.4%。
[0057]实施例9:重组β -甘露聚糖酶酶解刺槐豆胶制备甘露低聚糖。
[0058]以30IU/g刺槐豆胶的酶液添加量、于ρΗ5.0、70°C、170rpm下酶解底物浓度为30g/L的魔芋胶溶液，酶解2h后加温至100°C保持IOmin使酶灭活，冷却后离心去残渣，上清用于HPLC和离子色谱分析。HPLC结果显示，甘露低聚糖浓度为25.8g/L，甘露低聚糖得率为78%。
[0059]实施例10:酶解条件下重组β -甘露聚糖酶酶解高浓度魔芋粉制备甘露低聚糖。
[0060]150g/L的魔芋粉在Oh时一次性全部添加，β -甘露聚糖酶在Oh时按50IU/g魔芋粉(以150g/L魔芋粉计)一次性全部添加，在pH为5.0、温度为80°C、转速为170rpm的条件下酶解，6h后酶解结束,将酶液加温至100°C保持IOmin使酶灭活,冷却后离心去残洛,上清用于HPLC分析，结果显示甘露低聚糖浓度为56.6g/L。
[0061]实施例11:重组β -甘露聚糖酶酶解分批添加的魔芋粉制备甘露低聚糖。
[0062]150g/L的魔芋粉分三次添加，添加时间分别为0h、2h和4h。β -甘露聚糖酶在Oh时按50IU/g魔芋粉(以150g/L魔芋粉计)一次性全部添加。在pH为5.0、温度为80°C、转速为170rpm的条件下酶解，6h后酶解结束，将酶液加温至100°C保持IOmin使酶灭活，冷却后离心去残洛，上 清用于HPLC分析,结果显示甘露低聚糖浓度为81g/L。
【权利要求】
1.一种耐高温重组β -甘露聚糖酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
2.一种耐高温重组β_甘露聚糖酶的编码基因，其特征在于，是满足下列要求的核苷酸序列之一: (1)编码如SEQID No:2所示氨基酸序列的核苷酸序列； (2)如SEQID No: I所示的核苷酸序列。
3.一种表达耐高温重组甘露聚糖酶的重组菌株，其特征在于，该菌株为基因组上整合了权利要求2所述的β-甘露聚糖酶的编码基因的毕赤酵母。
4.根据权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述的毕赤酵母为分泌型巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
5.构建权利要求3所述的重组菌株的方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)应用常规重组质粒构建方法构建出重组密码子优化质粒pPICZa A - man,该质粒以AOXl为启动子，并含有SEQ ID No:1所示的β -甘露聚糖酶基因和Zeocin抗性基因； (2)将重组密码子优化质粒pPICZa A - man用Sac I酶切线性化后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中，即构成表达β-甘露聚糖酶的毕赤酵母重组菌株； (3)将重组菌株经过甲醇利用表型筛选、外源基因多拷贝整合筛选以及诱导表达筛选后，即筛选出过量表达甘露聚糖酶的重组工程菌。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的重组质粒pPICZ a A - man是密码子偏好性优化后合成的目的基因man插入到质粒pPICZ a A中形成的重组质粒。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，在将重组密码子优化质粒pPICZ a A - man用Sac I酶切线性化之后，电击转化入毕赤酵母宿主菌中之前，可将密码子优化质粒PPICZ a A - man导入大肠杆菌进行扩增。
8.权利要求1所述的耐高温重组甘露聚糖酶的制备方法，其特征在于，将权利要求3所述的重组菌在BMGY培养基中30°C培养至细胞密度OD6tltol = 2~6，室温离心收集菌体，用BMMY液体培养基将细胞重悬至OD6tltol为1.0以诱导表达，28°C继续培养72h，每24h向培养基添加纯甲醇至终浓度为1V/V%，将完成培养的重组菌经离心除去菌体，收集上清液，经超滤和分子筛纯化制备得到耐高温重组β-甘露聚糖酶。
9.权利要求1所述的耐高温重组β-甘露聚糖酶在酶法制备甘露低聚糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以富含甘露聚糖的生物质为原料酶法制备甘露低聚糖，所述的生物质为魔芋粉、田菁胶、刺槐豆胶和瓜尔胶的一种或多种。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，以10-50IU/g的耐高温重组β-甘露聚糖酶添加量、于pH4.0-6.0、50-90°C的震荡或搅拌条件下酶解底物浓度为30_200g/L生物质溶液，酶解0.5-8h后降温离心去残渣，上清即为甘露低聚糖。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，底物浓度为100-200g/L的高浓度生物质，酶用量为10-50IU/g，酶初始阶段一次性加入，底物分多次添加，添加时间间隔在l_3h，pH4.0-6.0、50-901:的震荡或搅拌条件下共酶解4-1211后冷却后离心去残渣，上清即为甘露低聚糖。
【文档编号】C12N15/56GK104004735SQ201410274470
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月18日 优先权日:2014年6月18日
【发明者】欧阳嘉, 倪玉佳, 周旻昱, 郑兆娟, 李鑫, 朱均均, 徐勇, 勇强 申请人:南京林业大学