一种重组家蚕素的表达方法及其抗肿瘤应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了属于基因工程【技术领域】的一种重组家蚕素的表达方法及其抗肿瘤应用。方法如下：根据表达系统对目的基因进行密码子偏好优化；利用全基因合成技术合成优化后的家蚕素基因；将该基因连接到表达载体，构建成重组表达载体；将重组表达载体转化到相应的表达系统；通过进一步的培养、筛选、鉴定，获得含重组表达载体菌株，并诱导表达出目的蛋白，本发明表达重组家蚕素II或重组家蚕素IV及两者的混合物具有广泛的抗肿瘤活性，无生物毒性，可以用于制备抗肿瘤药物。
【专利说明】一种重组家蚕素的表达方法及其抗肿瘤应用
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种重组家蚕素的表达方法及其抗肿瘤应用。
【背景技术】
[0002]家蚕素(bombyxin)是无脊椎动物中首个被鉴定的昆虫胰岛素，由4对位于蚕蛾脑中央背部的大型神经分泌细胞分泌。其中，天然成熟的家蚕素分子量约5kD，为异二聚体分子，含有两条氨基酸链:A链与B链，其中A链由20个氨基酸组成，B链由26或28个氨基酸组成。家蚕素的A链与B链之间有两个二硫键相连，A链自身由一个二硫键相连。家蚕素与人类胰岛素具有高度同源性，其A链与B链对应人胰岛素的A链与B链的相似度分别达50% 和 30%ο
[0003]家蚕素基因属于基因组多拷贝基因，目前在家蚕中已发现至少38种家蚕素基因，其中32种家蚕素基因都无内含子；根据家蚕素基因序列的相似程度分成A、B、C、D、E、F、G等7个亚族；家蚕素基因主要在蚕脑组织表达，在蚕的其它组织中表达量较低。
[0004]从昆虫遗传学角度相继证明了家蚕素在昆虫体内具有参与糖代谢调控、调节变态发育、调控前胸腺分泌活性、促进翅芽形成、促造血器官细胞增殖以及卵巢发育等生理功倉泛。
[0005]日本学者曾经从3千万头蚕蛾头部中提取出微克量级的家蚕素。从生物资源的开发角度来看，成本耗费太高，无法充分体现其资源的优越性。有报道通过化学合成获得家蚕素，合成过程复杂，产量较低，而且易掺杂很多化学成分，最终得到的家蚕素往往无法保证其天然的生物活性。通过真核或者原核表达系统能实现家蚕素的表达，可克服上述制备技术的缺陷，并使家蚕素的制备更快捷、简单，表达水平更高。
[0006]目前抗肿瘤多肽药物是肿瘤治疗领域最具开发性的新领域，以其低毒、高效、特异性广谱等特点用于癌症治疗。研究开发出具有重要生物功能的多肽，可为抗肿瘤新药的开发带来重要的影响。
[0007]已有实验证实，家蚕素可通过PI3K信号途径促进肿瘤细胞的糖原合成，但其在体内外抗肿瘤活性及其在药物方面的应用仍未见公开报道。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于克服现有的制备家蚕素的缺点，提供一种极为简便、工序少、设备简单、能耗小、投入资金少、高效而且适合实验室研究制备和大规模工业生产的制备重组家蚕素的方法。 [0009]本发明的目的是这样实现的:
[0010]一种重组家蚕素的表达方法，制备方法包括以下步骤:
[0011](1)优化家蚕素基因:根据表达系统对删除编码信号肽序列基因的家蚕素基因bbxA6进行密码子偏好优化，添加酶切位点和纯化标签，人工合成基因片段；[0012] (2)构建重组克隆载体:将将步骤(1)中的人工合成基因片段与克隆载体连接，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆；
[0013](3)构建重组表达载体:将表达载体和步骤(2)重组克隆载体酶切、纯化、回收目的基因片段与线性化表达载体、连接目的基因片段与线性化表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体线性化后转化到酵母菌中，经筛选得到酵母菌转化子；
[0014](4)表达重组家蚕素:将步骤(3)所筛选的转化子培养、诱导、分离、纯化得到重组的家蚕素。
[0015]步骤(1)中所述纯化标签可选择6XHis、GST、MBP、exact、Flag、His-MBP、His_Myc、His-AviTag?、His-Sumo、SNAP-Tag? 或 HaloTag?。
[0016]步骤(1)中所述家蚕素基因为bbxA6，优化后的家蚕素基因bbxA6的核苷酸序列如SEQ ID N0.3 所示。
[0017]步骤(3)中所述的表达载体为pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICza、PYAM75P6、PHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、pGAPZ、pGAPZa、pYES2、pYES2/NT、pYES2/CT、pYES3, pYES6、pYCplac22_GFP、pAUR123、pRS303TEF、pRS304、pRS305、pRS306、pY13TEF、PY14TEF、pY15TEF、pY16TEF、pSH47、pHISi, pLacZ1、pHIS2 或 pGAD42。
[0018]步骤(3)中所述的酵母菌为毕赤酵母菌GSl 15。
[0019]步骤(4)中所述的重组的家蚕素为家蚕素II。
[0020]还提供另一种重组家蚕素的表达方法，制备方法包括以下步骤:
[0021](I)优化家蚕素基因:根据表达系统对家蚕素基因bbxEl进行密码子偏好优化，添加酶切位点和纯化标签，人工合成基因片段；
[0022](2)构建重组克隆载体:将基因片段与克隆载体连接，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆；
[0023](3)构建重组表达载体:将表达载体和步骤(2)重组克隆载体酶切、纯化、回收目的基因片段和线性化表达载体、连接目的基因片段和线性化表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转化到大肠杆菌中，经筛选得到大肠杆菌转化子；
[0024](4)表达重组家蚕素:将步骤(3)所筛选的转化子培养、诱导、分离、纯化得到重组的家蚕素。
[0025]步骤(1)中所述纯化标签可选择6XHis、GST、MBP、exact、Flag、His-MBP、His_Myc、His-AviTag?、His-Sumo、SNAP-Tag? 或 HaloTag?。
[0026]步骤(1)中所述家蚕素基因为bbxEl，优化后的家蚕素基因bbxEl的核苷酸序列如SEQ ID N0.6 所示。
[0027]步骤(3)中所述的表达载体为pGEX-5X-l、pET3a、pET-lla、pET_12a、pET_14b、pET-15b、pET-16b、pET_17b、pET_19b、pET_20b、pET_21a、pET_22b、pET_23a、pET_23b、pET_24a、pET_25b、pET_26b、pET_27b、pET_28a、pET_29a、pET_30a、pET302，-303、pET_31b、pET_32a、pET_35b、pET_38b、pET-39b/pET_40b、pET_41a，_b、pET_42a、pET-43.1aj _b、pET-44a、pET-49b、PET303、pET-His、pET-Dsb、pET-GST、pET-Trx、pQE2、pQE9、pQE30，31，32、pQE-40 λ pQE70、pQE80L 或 pQETirs-system。
[0028]步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
[0029]步骤(4)中所述的重组家蚕素为家蚕素IV。[0030]本发明的目的还在于提供家蚕素在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0031]所述家蚕素为家蚕素I1、家蚕素IV或两者的混合物。
[0032]所述肿瘤为食管癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、胰岛素瘤、结肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌或白血病。
[0033]本发明采用基因工程技术，利用真核或原核表达系统，提供了一种家蚕素的制备方法。用本发明的方法生产家蚕素，其工艺成熟、资金投入少、易于实施、能耗少、可操作性强、对环境友好、无污染；本发明制备的家蚕素的一级结构与天然家蚕素的完全相同；本发明首次采用酵母表达系统表达重组家蚕素II;酵母表达系统能对异源蛋白修饰，而且在家蚕素的表达过程中，采用表达载体信号肽，促使目的蛋白分泌到培养基中，与哺乳动物细胞相比，酵母可以在简单的培养基中快速生长，酵母系统表达的家蚕素达102mg/L。本发明也同时首次采用大肠杆菌表达系统表达重组家蚕素IV。本发明制备的家蚕素I1、家蚕素IV及两者的混合物具有广泛的抗肿瘤生物活性，可用于制备抗肿瘤药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为人工合成家蚕素基因bbxA6片段。
[0035]图2为目的基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。
[0036]图3为重组整合型质粒pPIC9K/bbxA6琼脂糖凝胶电泳图。
[0037]图4为重组家蚕素II随时间表达的浓度。
[0038]图5为人工合成家蚕素基因bbxEl片段。
[0039]图6为重组克隆载体pMD18_T/bbxEl琼脂糖凝胶电泳图。
[0040]图7为重组表达载体pGEX-5X_l/bbxEl琼脂糖凝胶电泳图。
[0041 ]图8为重组家蚕素IV的SDS-PAGE图。
【具体实施方式】
[0042]下面结合附图和实施例对本发明进行详细地说明。
[0043]实施例1
[0044]家蚕素在毕赤酵母系统重组表达
[0045](I)家蚕素A族基因bbxA6根据毕赤酵母表达系统密码子做偏好优化；
[0046]将编码家蚕素的基因bbxA6 (G1:217215)中编码信号肽的序列去掉，得到无家蚕素信号肽序列的核酸序列(222bp)，如SEQ ID N0.1所示；
[0047]家蚕素II的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示；bbxA6核酸优化后的序列如SEQ IDN0.3所示；
[0048](2)在优化序列基础上作基因设计:在(I)中的基因5’端依次添加EcoRI酶基因、蛋白纯化标签6 X His tag基因、肠激酶识别位点DDDDK对应基因，3’端添加NotI酶基因，如附图1所示。上述目的基因可以人工合成，本发明由华大基因科技服务有限公司合成目的基因。
[0049] (3)构建重组克隆载体:克隆载体为PUC57。将人工合成的目的基因片连接到质粒PUC57，得到重组质粒pUC57/bbxA6，通过电击穿孔转化法转化到大肠杆菌DH5 α中，涂布于含100μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养板中，能正常生长的即为阳性克隆菌株，阳性转化子菌株命名为DH5 a /PUC57-bbxA6。阳性重组菌株保存在含有15%甘油的LB培养液中，冻存于_80°C。划线挑取单菌落、摇菌、提取重组克隆质粒pUC57/bbxA6，EcoR1、NotI双酶切获取同步骤(1)中的目的基因，通过PCR特异性引物进一步鉴定是否为目的基因。
[0050]其中PCR反应体系及操作条件如下:
[0051]PCR鉴定所需引物:
[0052]上游Pl 引物(5’ CAGCAACCTCAGGCTGTTC3’ )
[0053]下游P2 引物(5’ CTAGCAATAAGACAACAAAACATCA3’ )。
[0054]表1PCR 反应体系(50 μ I)
[0055]
【权利要求】
1.一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤: (1)优化家蚕素基因:根据表达系统对删除编码信号肽序列基因的家蚕素基因进行密码子偏好优化，添加酶切位点和纯化标签，人工合成基因片段； (2)构建重组克隆载体:将步骤(1)中的人工合成基因片段与克隆载体连接，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆； (3)构建重组表达载体:将表达载体和步骤(2)重组克隆载体分别酶切、纯化、回收目的基因片段和线性化表达载体、连接目的基因片段和线性化表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转化到酵母菌中，经筛选得到酵母菌转化子； (4)表达重组家蚕素:对步骤(3)所筛选的转化子进行培养、诱导、分离、纯化，得到重组的家蚕素。
2.根据权利要求1所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(1)中所述家蚕素基因为bbxA6，优化后的家蚕素基因bbxA6的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.根据权利要求1所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(3)中所述的表达载体为 pPIC9、pPIC9k、pHIL-Sl、pPICza、pYAM75P6、pHIL_D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWOlO、pGAPZ、pGAPZa、pYES2、pYES2/NT、pYES2/CT、pYES3，pYES6、pYCplac22_GFP、pAUR123、pRS303TEF、pRS304、pRS305、pRS306、pY13TEF、pY14TEF、pY15TEF、pY16TEF、pSH47、pHISi, pLacZ1、pHIS2 或 pGAD42。
4.根据权利要求1所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酵母菌为毕赤酵母菌GS115。
5.根据权利要求1所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述的重组的家蚕素为家蚕素II。
6.一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤: (1)优化家蚕素基因:根据表达系统对家蚕素基因进行密码子偏好优化，添加酶切位点和纯化标签，人工合成基因片段； (2)构建重组克隆载体:将将步骤(1)中的人工合成基因片段与克隆载体连接，转化到大肠杆菌中，挑选阳性克隆； (3)构建重组表达载体:将表达载体和步骤(2)重组克隆载体分别酶切、纯化、回收目的基因片段和线性化表达载体、连接目的基因片段和线性化表达载体，构建重组表达载体，将重组表达载体转化到大肠杆菌菌中，经筛选得到大肠杆菌转化子； (4)表达重组家蚕素:将步骤(3)所筛选的大肠杆菌转化子培养、诱导、分离、纯化得到重组的家蚕素。
7.根据权利要求6所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(1)中所述家蚕素基因为bbxEl，优化后的家蚕素基因bbxEl的核苷酸序列如SEQ ID N0.6所示。
8.根据权利要求6所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(3)中所述的表达载体为 pGEX-5X-l、pET3a、pET-lla、pET_12a、pET_14b、pET_15b、pET_16b、pET_17b、pET_19b、pET_20b、pET_21a、pET_22b、pET_23a、pET_23b、pET_24a、pET_25b、pET_26b、pET_27b、pET_28a、pET_29a、pET_30a、pET302，-303、pET_31b、pET_32a、pET_35b、pET_38b、pET-39b/pET-40b、pET_41a，_b、pET_42a、pET-43.1aj _b、pET_44a、pET_49b、PET303、pET-His、pET-Dsb、pET-GST、pET-Trx、pQE2、pQE9、pQE30，31，32、pQE-40、pQE70、pQE80L 或pQETirs—system。
9.根据权利要求6所述一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(3)中所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
10.根据权利要求6所述的一种重组家蚕素的表达方法，其特征在于，步骤(4)所述的重组的家蚕素为家蚕素IV。
11.根据权利要求1或6重组家蚕素的表达方法制备的家蚕素。
12.家蚕素在制备抗肿瘤药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述的家蚕素为家蚕素I1、家蚕素IV或两者的混合物。
14.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为食管癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、胰岛素瘤、结肠癌、直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌或白血病。
【文档编号】A61K38/28GK103937808SQ201410079147
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年3月5日 优先权日:2014年3月5日
【发明者】赵红平, 冯西桥, 龙燕, 邹凤竹, 黄慧明 申请人:清华大学