基于原核密码子偏好性构建高表达igf-1基因的工程菌的制作方法
【专利摘要】基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌。本发明依据原核密码子使用频率表，人工合成不同偏好全基因序列和人源原基因序列，并克隆在不同表达载体上，然后转化到不同表达大肠杆菌菌株中，共构建27株工程菌。PCR筛选阳性克隆、IPTG诱导表达、SDS-Page电泳和HPLC检测，筛选获得了一株经偏好性改造能高效表达融合蛋白的工程菌株，该工程菌株命名为RPP②，经液相检测RPP②目的蛋白的表达量是所构建的未经改造人源原基因工程菌最高表达量的2.4倍，若该菌用于工业化生产，能极大提高工业产值并为企业带来显著经济效益。
【专利说明】基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌
【技术领域】
[0001]本发明涉及重组人胰岛素样生长因子(hIGF-Ι)基因的构建，属于分子生物学领域，具体地说是涉及一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌。
【背景技术】
[0002]膜岛素样生长因子IGF-1 (insulin-like growth factors-1, IGF-1)是一类既具有促进细胞分化和增殖又具有胰岛素样作用的多肽，是人体本身含有的一种活性蛋白多肽物质，IGF-1在降血糖、降血脂、舒张血管、促生长、促细胞分化、创伤修复、抗肿瘤、心血管疾病和抗衰老等方面都有很重要的作用。鉴于IGF-1广泛而重要的生理功能，其合成与分泌的异常及系统功能的障碍会导致很多严重疾病，还有糖尿病；胰岛素抵抗综合症；侏儒症；心脑血管及神经系统疾病等多种顽疾也与IGF-1的生理功能息息相关，因此利用基因工程方法获得大量有生物学活性的IGF-1制品，对其基础理论研究和临床应用具有深远的意义。
[0003]但是，IGF-1的生产研究大部分实验都还处于实验室小规模阶段，主要是IGF-1生产时产量少，分离困难，产量低，价格昂贵(约100000元/克)，这导致IGF-1的开发和利用受到严重影响。如何扩大IGF-1的产量，降低成本，已经成为迫在眉睫的工作。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术存在的不足，克服真核基因在原核宿主中表达量低的问题，本发明提供了一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，通过设计多种优化密码子序列，构建不同表达载体，制备多种表达菌株。
[0005]一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，所述工程菌为能在胞内表达或分泌表达重组人胰岛素样生长因子融合蛋白的基因工程菌，所述工程菌为大肠杆菌工程菌，所述融合蛋白的氨基酸序列为Seq ID No:4所示。
[0006]优选地，所述工程菌包括含有所述高表达IGF-1基因的重组表达载体和表达菌株。
[0007]优选地，所述重组表达载体的出发载体为未经优化的IGF-1人源原基因序列，其基因序列为Seq ID No:I所不。
[0008]优选地，所述IGF-1基因包括全合成密码子优化后的IGF-1偏好序列①，其基因序列为Seq ID No:2所示。
[0009]优选地，所述IGF-1基因包括全合成密码子优化后的IGF-1偏好序列②，其基因序列为Seq ID No:3所示。
[0010]优选地，所述 的重组表达载体包括胞内表达载体和分泌表达载体。
[0011]优选地，所述胞内表达载体为将IGF-1偏好序列①或IGF-1偏好序列②DNA分子插入到质粒PGEX4T-1和PET32a的多克隆位点处得到的重组质粒，所述胞内表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。[0012]优选地，所述分泌表达载体为将IGF-1偏好序列①或IGF-1偏好序列②DNA分子插入到质粒PET22b的多克隆位点处得到的重组质粒,所述分泌表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。
[0013]优选地，所述的大肠杆菌包括Escherichia coli BL21 (DE3)、Rosetta(DE3)和Origami (DE3)。
[0014]优选地，所述表达菌株包括一株经偏好性改造的工程菌株，该工程菌株命名为RPP②，RPP②目的蛋白的表达量是所构建的未经改造人源原基因工程菌最高表达量的2.4倍。该工程菌株为能高效表达融合蛋白的工程菌株。
[0015]不同物种在遗传密码子的使用频率上是不一致的，有些真核基因中出现频率很高的密码子在原核基因中却很少使用。本发明中依据大肠杆菌密码子使用频率表人工合成并克隆了适于在大肠杆菌中表达的IGF-1基因，通过提高目的基因mRNA的转录来增加表达量，从本质上提闻目的蛋白的表达。
[0016]本发明依据原核密码子使用频率表人工合成并克隆适于在大肠杆菌中表达的IGF-1基因，下文所述的目的基因(包括经偏好性改造的IGF-1基因和未经改造的人源原IGF-1 基因)。[0017]本发明中目的基因含有243个碱基，该243碱基序列能翻译出含有77个氨基酸的肽链。
[0018]本发明共设计3种表达IGF-1的密码子序列，构建9种重组表达载体以及筛选得27株工程菌。
[0019]本发明中IGF-1目的蛋白表达量最高的重组表达载体为PGEX4T-1GF-1②，该表达载体启动所述DNA分子转录的启动子具有T7启动子，所述的目的基因是插入到质粒PGEX4T-1的多克隆位点处得到的重组质粒，所述的多克隆位点为BamHI和EcoRI，该融合质粒的构建见图1所示，构建步骤为:(1)用BamHI和EcoRI两种限制性内切酶在36°C，5h下分别双酶切表达质粒PGEX4T-1和重组质粒PUC57-1GF-1②；(2)用1.0%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，割胶回收目的基因片段和被切割后的线性质粒，再用DNA琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒从琼脂糖中分离出目的基因片段和被切割后的线性质粒；(3)目的条带和被切割后的线性质粒按3:1的比例用T4 DNA Iigase在16°C连接过夜；(4)连接的重组质粒转染Escherichia coli JM109感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB平板，37°C培养，12h，挑取10个单菌落检测阳性克隆。
[0020]本发明利用所述表达载体的GST标签和目的基因构建而成的融合蛋白，在GST标签和目的基因之间插入肠激酶酶切位点，所述的融合蛋白的氨基酸序列见序列表中GST-1GF-1氨基酸序列。
[0021]发明中所涉及的目的基因转录所得到RNA分子，含有所述目的基因的克隆载体、表达载体、保存菌株和表达菌株也属于本发明的保护范围。
[0022]在大肠杆菌中，本发明所提供的经过密码子优化的IGF-1基因与未经改造的人源原IGF-1基因相比，筛选获得了一株经偏好性改造能高效表达融合蛋白的工程菌株，该工程菌株命名为RPP②，经液相检测RPP②目的蛋白的表达量是所构建的未经改造人源原基因工程菌最高表达量的2.4倍。
[0023]本发明通过大肠杆菌密码子偏好性合成IGF-1全基因构建出高表达的IGF-1工程菌及其高密度培养技术的建立，为IGF-1的生产探索新的途径，可以有效解决IGF-1在应用和生产过程中天然量低，生产成本高，产品不纯等问题。
[0024]本发明依据原核密码子使用频率表，人工合成不同偏好全基因序列和人源原基因序列，并克隆在不同表达载体上，然后转化到不同表达大肠杆菌菌株中，共构建27株工程菌。PCR筛选阳性克隆、IPTG诱导表达、SDS-Page电泳和HPLC检测，筛选获得了一株经偏好性改造能高效表达融合蛋白的工程菌株，该工程菌株命名为RPP②，经液相检测RPP②目的蛋白的表达量是所构建的未经改造人源原基因工程菌最高表达量的2.4倍，若该工程菌用于工业化生产，能极大提高工业产值并为企业带来显著经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1为本发明PGEX4T-1GF-1②构建示意图；
图2为酶切图谱进行琼脂糖凝胶电泳检测图；
图3为PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳图；
图4为各菌株表达重组质粒的SDS-PAGE电泳图；
图5为终浓度为50ug/mL的IGF-1标准样品HPLC图；
图6为稀释2倍的IGF-1人源原样品HPLC图；
图7为稀释2倍的IGF-1②样品HPLC图。
【具体实施方式】
[0026]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028]目的基因(包括IGF-1偏好序列和IGF-1人源序列):由上海生物工程有限公司合成并构建于PUC57载体；表达载体PGEX4T-1载体、PET22b载体和PET32载体:购自Addgene公司;大肠杆菌(包括 Escherichia coli BL21 (DE3)、Rosetta (DE3)和 Origami (DE3)):由浙江大学生命科学学院提供。其他试剂:实验中所需的其他试剂均由浙江中医药大学生物工程学院基因工程实验室提供。
[0029]本发明不仅提供了种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，同时也提供了含有IGF-1基因的重组表达载体和表达菌株。
[0030]1、胰岛素样生长因子IGF-1密码子优化及全基因合成
首先，在 NCBI 下载 IGF-1 人源基因序列(insulin-like growth factors-1, IGF-1),依据大肠杆菌密码子使用频率表设计IGF-1偏好性序列，从而提高IGF-1在大肠杆菌中的表达水平。再由上海生物工程有限公司合成IGF-1人源原基因序列和密码子优化后的IGF-1基因序列并构建于TOC57克隆质粒上，最后保存于DH5 α菌株中。
[0031]用primer 5.0分别设计IGF-1偏好和IGF-1人源引物序列，再由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。
[0032]表1
【权利要求】
1.一种基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述工程菌为能在胞内表达或分泌表达重组人胰岛素样生长因子融合蛋白的基因工程菌，所述工程菌为大肠杆菌工程菌，所述融合蛋白的氨基酸序列为Seq ID No:4所示。
2.根据权利要求1所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述工程菌包括含有IGF-1基因的重组表达载体和表达菌株。
3.根据权利要求2所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述重组表达载体的出发载体为未经优化的IGF-1人源原基因序列，其基因序列为Seq ID No:1所示。
4.根据权利要求1所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述IGF-1基因包括全合成密码子优化后的IGF-1偏好序列①，其基因序列为Seq ID No:2 所示。
5.根据权利要求1所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述IGF-1基因包括全合成密码子优化后的IGF-1偏好序列②，其基因序列为Seq ID No:3 所示。
6.根据权利要求2所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述重组表达载体包括胞内表达载体和分泌表达载体。
7.根据权利要求6所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述胞内表达载体为将IGF-1偏好序列①或IGF-1偏好序列②DNA分子插入到质粒PGEX4T-1和PET32a 的多克隆位点处得到的重组质粒，所述胞内表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。
8.根据权利要求6所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述分泌表达载体为将IGF-1偏好序列①或IGF-1偏好序列②DNA分子插入到质粒PET22b的多克隆位点处得到的重组质粒,所述分泌表达载体中启动所述DNA转录的启动子为T7启动子。
9.权利要求1所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述大肠杆菌包括 Escherichia coli BL21 (DE3)、Rosetta(DE3)和 Origami (DE3)。
10.权利要求2所述的基于原核密码子偏好性构建高表达IGF-1基因的工程菌，其特征在于:所述表达菌株包括一株经偏好性改造的工程菌株，该工程菌株命名为RPP②，RPP②目的蛋白的表达量是所构建的未经改造人源原基因工程菌最高表达量的2.4倍。
【文档编号】C12N1/21GK103911338SQ201410118148
【公开日】2014年7月9日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】刘文洪, 叶志青, 王炜钢, 李俊峰, 张贝贝, 贾孟荻 申请人:浙江中医药大学