CTAGA为Xbal的酶 切位点，且序列中没有BamHl的酶切位点，为方便PBI121+GUS的载体构建，选择Xbal和 BamHl两个酶切位点，把碱基TCTAGA改动成密码子频率次之的密码子，改为TCAAGG，得到 Xbal_VH_L_VL_BamH1 基因序列；
[0045] 所得Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列包括的核苷酸序列见SEQIDN07。
[0046] d、在Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列两端加保护碱基，且在ATG后加组氨 酸标签（组氨酸标签不可切除）、在5'端的酶切位点内加3个终止码子，修饰成 XbalHISVH-L-VL-BamHl基因序列，既全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列。
[0047] 所得全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N01〇
[0048] 实施例2
[0049] 酶切位点、氨基酸序列分析
[0050] 利用生物信息学软件BI0XM2. 6对全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列酶 切位点、氨基酸序列等分析。
[0051] 全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列编码后的氨基酸序列为：
[0052]SSRMHHHHHHMDFQVQIFSFLLISASVIISRGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSS⑶YYWT WIRQSPGKGLEWIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTM VTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETG VPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR***GSG
[0053] 可编码的氨基酸序列见SEQIDN08。
[0054] 全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码后的氨基酸序列为：
[0055]DFQVQIFSFLLISASVIISRGQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSVSS⑶YYWTWIRQSPGKGLE WIGHIYYSGNTNYNPSLKSRLTISIDTSKTQFSLKLSSVTAADTAIYYCVRDRVTGAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSG GGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASV⑶RVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSG TDFTFTISSLQPEDIATYFCQHFDHLPLAFGGGTKVEIKR
[0056] 可编码的氨基酸序列见SEQIDN09。
[0057] 结论：编码后的氨基酸序列与原氨基酸序列一致，说明本发明的全人源EGFRScFv 烟草密码子偏好基因序列正确。
[0058] 实施例3
[0059] 0RF分析
[0060] 利用在线软件BI0XM2. 6提供的ORFFinder对全人源EGFRScFv烟草密码子偏好 基因序列进行分析，预测其理化性质。
[0061] 结果：通过理化性质分析，可知全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列编码 蛋白是一种稳定蛋白。
[0062] 实施例4
[0063] 亲/疏水性分析
[0064] 利用在线软件ProtScale对全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列进行亲水 性/疏水性分析。
[0065] 结果：全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白是一种亲水性蛋白。
[0066] 实施例5
[0067] 跨膜区分析
[0068] 利用在线软件TMHMM对全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列进行分析跨膜 区。
[0069] 结果：全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白不是跨膜蛋白。
[0070] 实施例6
[0071] 亚细胞定位
[0072] 利用软件TargetP对全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列进行亚细胞定位 分析。
[0073] 结果表明，全人源EGFRScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋白是分泌到细胞周 质的蛋白。
[0074] 结论：实施例3-6的结果表明全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列编码蛋 白符合ScFv的特点。
[0075] 实施例7
[0076] 烟草表达及蛋白鉴定
[0077]a、通过OVERLAPPCR技术，引入连接肽，把VH与VL序列通过连接肽拼接获得 792bp的VH-L-VL基因序列。
[0078]b、构建pBI121-VH-L-VL重组烟草表达载体，将测序正确的VH-L-VL基因的PCR 回收产物和PBI121空载体以Xbal、BamHI双酶切，37°C水浴过夜后，进行琼脂糖凝胶电 泳并回收，然后在T4DNA连接酶作用下室温连接4h，转化E.coliDH5a，通过卡那霉素 (Kanamycin，Kan+)抗性筛选得到pBI121-VH-L_VL重组子。
[0079] c、将鉴定成功后的pBI121-HLL-YC质粒通过电转法转化农杆菌株。
[0080] d、将转化成功的农杆菌株通过叶盘法浸染烟草，并对阳性转基因烟草进行筛选。
[0081] e、将阳性转基因烟草的叶片在液氮中研磨，取上清液，用上清液对体外培养的乳 腺癌细胞处理。
[0082] 将体外培养的乳腺癌细胞平均分为A、B、C三部分，A部分癌细胞培养时培养基中 不加上清液；B部分癌细胞培养时培养基中加2%的上清液；C部分癌细胞培养时培养基中 加10%的上清液，在共聚焦显微镜下观察上清液对体外培养的乳腺癌细胞的增殖抑制影 响，结果如图1。
[0083] 结论：通过烟草表达及蛋白鉴定结果表明，烟草表达蛋白为全人源EGFRScFv烟草 密码子偏好基因序列编码蛋白，烟草表达蛋白对体外乳腺癌细胞的增值具有良好的抑制作 用。
[0084] 以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范 围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
[0085]
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[0090]
[0091]
[0092]
【主权项】
1. 一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列，其特征在于，包括的核苷酸序列 见 SEQ ID NOl。2. -种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方法，其特征在于，包括以 下步骤： a、 全人源EGFR ScFv基因序列的获得，通过连接肽（Linkr)将重链可变区（VH) DNA序 列与轻链全长（VL) DNA序列连接起来，得到VH-L-VL基因序列； b、 全人源EGFR ScFv基因序列的改变，对全人源EGFR ScFv基因序列进行烟草密码子 偏好性基因序列改变，得到改变的VH-L-VL基因序列； c、 对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xbal、BamHl，TCTAGA为Xbal的酶切 位点，且序列中没有BamHl的酶切位点，为方便PBI121+GUS的载体构建，选择Xbal和 BamHl两个酶切位点，把碱基TCTAGA改动成密码子频率次之的密码子，改为TCAAGG，得到 Xbal-VH -L-VL-BamH 1 基因序列； d、 在Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列两端加保护碱基，且在ATG后加组氨酸 标签（组氨酸标签不可切除）、在5'端的酶切位点内加3个终止码子，修饰成 XbalHISVH-L-VL-BamHl基因序列，既全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列。3. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方 法，其特征在于，所述重链可变区（VH) DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N02。4. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方 法，其特征在于，所述轻链全长（VL)DNA序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N03。5. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方 法，其特征在于，所述连接肽（Linkr)包括的核苷酸序列见SEQ ID N04。6. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方 法，其特征在于，所述步骤a所得VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N05。7. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得 方法，其特征在于，所述步骤b所得改变的VH-L-VL基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N06〇8. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方 法，其特征在于，所述步骤c所得Xbal-VH-L-VL-BamHl基因序列包括的核苷酸序列见SEQ ID N07。9. 根据权利要求2所述的一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的获得方 法，其特征在于，所述步骤d所得全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列包括的核苷酸 序列见SEQ ID NOl。10. -种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列的用途，其特征在于，该全人源 EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列高效表达后具有抗肿瘤作用。
【专利摘要】本发明公开了一种全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列及获得方法和应用。本发明的基因序列获得方法包括：全人源EGFR ScFv基因序列的获得，全人源EGFR ScFv基因序列的改变，对改变的VH-L-VL基因序列添加酶切位点Xba1、BamH1，加保护碱基，且在ATG后加组氨酸标签、在5’端的酶切位点内加3个终止码子。本发明的全人源EGFR ScFv烟草密码子偏好基因序列克服了鼠源性基因序列在体内易产生人抗鼠的抗体反应及其它源性基因序列导致的其它不良反应。本发明利用烟草这一植物生物反应器进行高效表达的全人源EGFR ScFv具有抗肿瘤作用。
【IPC分类】C07K16/30, C12N15/13, A61P35/00, C12N15/10
【公开号】CN104962562
【申请号】CN201510399864
【发明人】郭尚敬, 李素芬, 张付雷, 李妹芳, 冀芦沙
【申请人】聊城大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年7月9日