一种电化学生物传感器的制备方法及检测dna甲基转移酶活性的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，可以实现对DNA甲基转移酶活性的灵敏检测。
【背景技术】
[0002]肿瘤表观遗传学是一门新兴的学科，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质修饰、基因组印记和非编码RNA调控等几个方面。其中，DNA甲基化与肿瘤的关系是研究的热点。近年来，诸多研究表明DNA甲基化在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面发挥重要作用，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅速发展，DNA甲基化受到越来越多的关注。
[0003]对于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，大致可以分为两类:一类是从DNA甲基转移酶的角度，另一类是从DNA甲基化水平的角度进行研究；后者又分为总体DNA甲基化水平和特异基因序列DNA甲基化水平的检测。
[0004]已有研究表明，胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键，其与印迹的清除和重建、X染色体的失活、种系分化等等都有密切关系。经过近半个世纪的研究，DNA甲基化水平的变化目前已是人类癌症的一种典型改变，并伴随着恶性肿瘤细胞的产生、发展而变化。
[0005]因此，快速有效的检测DNA甲基化水平的变化对肿瘤的诊断、发生、发展都至关重要。目前检测DNA甲基化的方法费力，费时，灵敏度低和不够精确。因此，探讨甲基化形成与改变的可能机制，建立准确性好，灵敏度高，操作简单的DNA甲基化检测方法意义重大。
【发明内容】
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供一种电化学生物传感器的制备方法及检测DNA甲基转移酶活性的方法，利用DNA序列之间碱基的互补配对作用，甲基化后的发夹DNAl与电极上的发夹DNA2形成双链，发夹DNA2上修饰的亚甲蓝分子远离电极表面，加入二茂铁-抗甲基化抗体后修饰到发夹DNAl上的甲基化位点，从而构建了一个信号转换的电化学生物传感器，通过甲基化前后检测到的信号转换检测DNA甲基转移酶活性，实现了对DNA甲基转移酶的灵敏性、特异性、稳定性的检测。
[0007]本发明提供的一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤:
[0008](I)制备二茂铁-抗甲基化抗体；
[0009](2)制备发夹DNAl和发夹DNA2缓冲溶液；
[0010](3)将发夹DNAl甲基化；
[0011](4)制备发夹DNA2修饰的金电极；
[0012](5)构建得到电化学生物传感器。
[0013]步骤(I)包括以下步骤:将碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺加入含有二羧基二茂铁的PBS缓冲溶液中，反应物在室温下震荡I?2小时，将得到的产物重新分散在含有抗5-甲基胞嘧啶抗体的PBS缓冲溶液中，室温下震荡反应，再在4°C下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
[0014]进一步的，步骤(I)具体为:将0.03834g 20mM的碳二亚胺和0.03702g 32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的1mL 0.1M的PBS缓冲溶液(pH = 7.4)中，，在室温下震荡I?2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有1yL10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mL PBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4 °C下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
[0015]步骤(2)包括以下步骤:将购买的分别为2.50D的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到发夹DNAl缓冲溶液和发夹DNA2缓冲溶液，在4°C下保存备用;
[0016]进一步的，步骤(2)中发夹DNAl序列为:
[0017]5,-CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATA CCCGG-37 ;发夹DNA2序列为:5 ’-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTC TACCCGG-MB-3’。
[0018]进一步的，步骤(2)具体为:将购买的分别为2.50D的发夹DNA1、发夹DNA2序列分别溶解在0.1M pH = 7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为ΙΟΟμΜ的发夹DNAl缓冲溶液和浓度为ΙΟΟμΜ发夹DNA2缓冲溶液，在4 °C下保存备用；
[0019]步骤(3)为:将发夹DNAl加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37°C下反应2小时，清洗，发夹DNAl实现甲基化；
[0020]进一步的，步骤(3)具体为:将IyLΙΟΟμΜ的发夹DNAl缓冲溶液加入到200yL缓冲溶液里，得0.5μΜ发夹DNAl缓冲溶液，加入到含有160μΜ S-腺苷基甲硫氨酸和200yL M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37 0C湿润条件下反应2小时，之后，用1mM的Tris-HCl (pH=7.4)清洗3次，发夹DNAl实现甲基化。
[0021]步骤(4)包括以下步骤:将发夹DNA2缓冲溶液滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应，超纯水清洗后，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有6-巯基乙醇的Tris-HCl缓冲溶液中，以封闭剩余的空穴;得到发夹DNA2修饰的金电极。
[0022]步骤(4)具体为:在10yL的ΙΟΟμΜ发夹DNA2溶液中加入0.1yL的10mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应I小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用I3BS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μΜ，将5yL 0.5μΜ的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM 6-巯基乙醇的1mM Tris-HCl(pH=7.4)以封闭剩余的空穴。
[0023]所述抛光处理具体为:金电极先依次用0.3和0.5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HNO3IH2O= 1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中，进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3?5min。
[0024]步骤(5)为:将甲基化的发夹DNAl滴加到发夹DNA2修饰的金电极上，室温下培养后得到修饰的金电极，将步骤(I)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面，室温下培养，清洗，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。
[0025]进一步的，步骤(5)具体为:将5yL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNAl滴加到步骤
(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNAl和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5yL步骤(I)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养lh，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1M PBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换。
[0026]—种检测DNA甲基转移酶活性的方法，包括以下步骤:
[0027]a、制备二茂铁-抗甲基化抗体；
[0028]b、制备发夹DNAl和发夹DNA2缓冲溶液；
[0029]C、将发夹DNAl甲基化；
[0030]d、制备发夹DNA2修饰的金电极；
[0031]e、构建电化学生物传感器，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测检测DNA甲基转移酶活性。
[0032]步骤a具体为:将0.03834g 20mM的碳二亚胺和0.03702g 32mM的N-羟基琥珀酰亚胺加入含有2mM二羧基二茂铁的1mL 0.1M的PBS缓冲溶液(pH=7.4)中，在室温下震荡I?2小时，活化二羧基二茂铁的羧基之后，将2mL得到的产物重新分散在含有1yL 10mg/mL抗5-甲基胞嘧啶抗体的4mL PBS缓冲溶液中，将此溶液在室温下震荡2小时，之后，再在4°C下保存过夜，从而得到二茂铁-抗甲基化抗体。
[0033]进一步的，步骤b具体为:
[0034]将购买的分别为2.50D的发夹DNAl、发夹DNA2序列分别溶解在0.1M pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液中，分别得到浓度为ΙΟΟμΜ的发夹DNAl缓冲溶液和浓度为ΙΟΟμΜ发夹DNA2缓冲溶液，在4°C下保存备用；
[0035]步骤b中发夹DNAl序列为:
[0036]57 -CCGGGTAGAGCTCCCTTCAATCCAACATGATA CCCGG-37 ；发夹DNA2序列为:5，-SH-CCGGGTATCATGTTGGATTGAAGGGAGCTC TACCCGG-MB-3'。
[0037]步骤c具体为:将发夹DNAl加入到含有S-腺苷基甲硫氨酸和不同浓度的M.SssI甲基转移酶存储溶液，在37 °C下反应2小时，清洗，发夹DNAl实现甲基化。
[0038]]?.5881甲基转移酶存储溶液浓度为:01]/11^、0.251]/11^、0.3751]/11^、0.51]/11^，11]/mL、10U/mL、20U/mL、40U/mL。
[0039]步骤d具体为:在10yL的ΙΟΟμΜ发夹DNA2溶液中加入0.1yL的10mM硫醇类还原剂TCEP中，室温下反应I小时，防止DNA自身形成二硫键，然后用I3BS缓冲溶液将以上得到的发夹DNA2稀释到0.5μΜ，将5yL 0.5μΜ的发夹DNA2滴加到干净的金电极表面，在黑暗环境下室温反应2小时，用超纯水清洗，再将发夹DNA2修饰的金电极保存在含有1.0mM 6-巯基乙醇的1mM Tris-HCl(pH=7.4)以封闭剩余的空穴。
[0040 ]步骤e具体为:将5yL步骤(3)制备的甲基化的发夹DNAI滴加到步骤(4)制备的发夹DNA2修饰的金电极上，发夹DNAl和发夹DNA2实现碱基互补配对，室温下培养2小时后，得到修饰的金电极，将5yL步骤(I)得到的二茂铁-抗甲基化抗体标记物滴加到修饰的金电极表面室温下培养lh，标记物可以识别并连接到甲基化位点上，再用0.1MPBS缓冲溶液清洗电极，得到电化学生物传感器，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。
[0041]与现有技术相比，本发明通过甲基化的DNA修饰到电极上，从而使耦联了二茂铁-抗甲基化抗体修饰到电极上，实现亚甲蓝和二茂铁信号的转换，将二茂铁与亚甲蓝的电信号比例构建与DNA转甲基酶浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。本发明提供的检测方法对DNA转甲基酶的检测具有灵敏度高、检测限低、选择性好的特点。
【附图说明】
[0042]图1为基于信号转换检测DNA甲基转移酶活性的电化学生物传感器的制备示意图；
[0043]图2为制备的电化学生物传感器不同实验条件下的方波伏安法图；其中a为发夹DNAl/发夹DNA2/金电极;b为甲基化的发夹DNAl/发夹DNA2/金电极;c为二茂铁-抗甲基化抗体/发夹DNAl/发夹DNA2/金电极；
[0044]图3A为不同修饰电极的电化学阻抗图；
[0045]a为裸电极;b为发夹DNA2/金电极;c为发夹DNAl/发夹DNA2/金电极;d为二茂铁-抗甲基化抗体/发夹DNAl/发夹DNA2/金电极；
[0046]图3B为不同修饰电极的循环伏安图；
[0047]a为裸电极;b为发夹DNA2/金电极;c为发夹DNAl/发夹DNA2/金电极;d为二茂铁-抗甲基化抗体/发夹DNAl/发夹DNA2/金电极；
[0048]图4A为实验优化条件图，温度；
[0049]图4B为实验优化条件图，培养