准确称取烟草叶片0. 25g放入预冷的研钵中，加入3mL 0. 05M硼酸缓冲液（pH 8. 4)和少量石英砂，冰浴研磨成勾衆。4°C，12000rpm/min离心20min，取上清夜即粗酶液， 置于-20°C保存备用。
[0107] 测定PAL活性时，分别向比色管中加入3. 8mL 0. 1M硼酸缓冲液、lmL 0. 02M L-苯 丙氨酸和〇. 2mL粗酶液。40°C水浴60min后加入lmL盐酸终止反应，测定0D29。值，并计算 PAL活性。对照管用硼酸缓冲液代替粗酶液。
[0108] PAL活性（0.01A0D ? g1 .min1) = (100X AOD^XVTVCFWXtXVi)
[0109] 式中t:反应时间（min) ;VT:样液总体积（mL) ;Vi:测定时样品用量（mL) ;FW:样 品鲜重（g)。
[0110] 结果如图15所示，蕈状芽胞杆菌R2诱导后番茄叶片的PAL活性实验组的1级显 著高于对照组，是对照组的1. 59倍（P < 0. 01)，实验组的0级也显著高于对照组，是对照组 的2. 3倍（P < 0. 01)，说明蕈状芽胞杆菌R2可诱导番茄叶片PAL的活性提高。
[0111] ⑷检测番茄根系活力的变化
[0112] 蕈状芽胞杆菌R2发酵液灌根后60d，根据根结分级标准，将对照组的9级，实验组 的0级和1级植株的根用流水冲净，取根尖0. 5g，每次取3株作为重复。用TTC法测量根系 活力。将跟放入15ml烧杯中，加入0. 4% TTC溶液和磷酸缓冲液的等量混合液10ml，把跟 充分浸没，在37°下暗保温2h，加入lmol/L硫酸lml，以停止反应。同时做一空白实验，先 加硫酸，再加根样品，其他操作同上。把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯3-4ml和少量石英 砂一起在研钵内磨碎，最后加乙酸乙酯使总量为10ml，用分光光度计在波长485nm下比色， 以空白试验作参比测出吸光度，查标准曲线，即可求出四氮唑还原量。
[0113] 四氮唑还原强度（mg/(g. h))=四氮挫还原量（mg)/[根质量（g)*时间（h)]。根 系活力（mg/(g. h)) = C*V/(W*t)*100。其中：C为由标准曲线查得的浓度（mg/mL)，V为提 取液体积（mL)，W为根质量（g)，t为反应时间（h)。
[0114] 取对照组的9级番茄苗根尖和实验组的1级、0级新鲜的根部同条件处理后，测根 系活力。从图16中可以看出实验组的1级、0级根尖的酶活比对照组的9级根尖的酶活高。 且实验组i级和对照组间差异不显著，实验组〇级是对照组的L 34倍，两者间差异显著（P < 0? 05)〇
[0115] (5)检测番茄叶片叶绿素含量的变化
[0116] 蕈状芽胞杆菌R2发酵液灌根60d后，拔出番茄苗的根部，按照分级标准将植株根 结病情分级，取实验组对应级数植株的叶片与处理组9级的叶片，比较它们之间叶绿素含 量的多少。
[0117] 叶绿素含量的测定：准确称取0. 2g幼嫩叶片，加入少量CaC03和石英砂，5mL 95% 丙酮-乙醇溶液，冰浴研磨成匀衆，再加入5mL95 %丙酮-乙醇溶液，继续研磨，静置3min至 碎片无色。一层滤纸过滤，将滤液过滤至25mL容量瓶中（锡箱纸包裹或用棕色容量瓶）， 用溶剂冲洗研钵和滤纸，直至无色，定容至25mL，摇勾。用溶剂校零，分别于663nm和645nm 测定吸光度。按下列公式计算出叶绿素浓度：
[0118] 叶绿素a浓度（mg/L):Ca= 12. 7A663-2. 69A645
[0119] 叶绿素b浓度（mg/L) :Ca= 22. 9A645-4. 68A663
[0120] 叶绿素总浓度（mg/L) :Ca+b=Ca+Cb
[0121] 计算提取叶中叶绿素浓度，换算为每克鲜叶叶绿素含量（mg/L)，BP :
[0122] 叶绿素浓度（mg/L) *提取液总体积（mL) / [样品鲜重（g) *1000]
[0123] 结果如图17所示，蕈状芽胞杆菌R2灌根后番茄叶片的叶绿素含量处理组的1级 和〇级都高于对照组，说明蕈状芽胞杆菌R2可提高番茄植株对根结线虫的抗性，从而植株 长势更好，番茄叶片的叶绿素含量提高。
[0124] 实施例6
[0125] 蕈状芽胞杆菌R2在提高植物对线虫抗性中的应用，其步骤如下：
[0126] 取大小一致的塑料盆，先将营养土、沙土按1 :1的比例混匀成混合土，混合土与病 原土按2 :1的比例混匀成实验土待用，将实验土等量分装到各个塑料盆。移栽4-5片叶龄 的番茄苗于各盆，期间等量接种南方根结线虫。将苗置于20-30°C左右的环境中，保持土壤 湿度在40% -70%即可。实验设置处理组和实验组，处理组：蕈状芽胞杆菌R2发酵液；对照 组：清水灌根；每个处理3个重复，每个重复5株植株。处理组在移栽后15d，每株植株采用 灌根法将蕈状芽胞杆菌发酵液浇于植株根部。从移栽日算起，每隔15d用蕈状芽胞杆菌发 酵液灌根处理，共灌根3次。每棵苗灌根菌液SOmUK^CFU/ml)。60d后，记录并计算出每 株番茄的病情指数和防治效果。按以下病情分级标准计算蕈状芽胞杆菌的防治效果。
[0127] 表1根结病病情分级标准
[0128] Table2-lThe grading standrads of root knot
[0129]
[0130] 病情指数=[9六+78+50+30+1￡+(^/9扣\100%上式中八~？为对应级别的植株数 量，N为调查总植株数，N = A+B+C+D+E+F。
[0131] 防治效果（％) = [(对照组病情指数-处理组病情指数）/对照组病情指 数]X100%〇
[0132] 结果如表2所示，蕈状芽胞杆菌R2菌株盆栽生物防效为90. 90%，有很好的防效。 盆栽实验根结防治效果照片如图18,从图中可以看出对照组9级植株的根生长不健康，根 系发育不良，根结多且粗大；处理组〇级和1级植株根生长健康，根系发达，根结少且细小； 说明蕈状芽胞杆菌R2发酵液在盆栽实验中防治效果很好。
[0133] 表2蕈状芽胞杆菌R2菌株盆栽生物防效
[0134]
[0135] 其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描 述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经 创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
【主权项】
1. 一种蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides) R2菌株，其保藏编号为CCTCC NO :M 2015251。2. 根据权利要求1所述的蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株，其特征在于： 所述蕈状芽胞杆菌（Bacillus myc〇ideS)R2菌株发酵的发酵液中含有具有抗虫活性物质的 N，N-二乙基-间-甲苯甲酰胺和苯乙烯。3. -种权利要求1所述蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株在防治和杀灭植物 根结线虫中的应用。4. 根据权利要求3所述应用，其特征在于：包括以下步骤： 1) 将所述的蕈状芽胞杆菌（Bacillus myc〇ideS)R2菌株进行发酵培养，得到发酵液； 其中，每25ml的LB液体培养基中接种单菌落的蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides) R2 ;在 25~30°C，180~250rpm/min摇床中培养2~4d ; 2) 在作物移栽后15d，每株植株采用灌根法将蕈状芽胞杆菌R2菌株的发酵液浇于植株 根部；从移栽日算起，每隔15d用蕈状芽胞杆菌发酵液灌根处理，总共灌根3次；每棵苗灌 根菌液20ml ;60d后，记录并计算病情指数和防治效果。5. -种权利要求1蕈状芽胞杆菌（Bacillus mycoides)R2菌株在制备杀植物根结线虫 菌剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种蕈状芽胞杆菌(Bacillus？mycoides)R2菌株及其在防治植物根结线虫病中的应用。蕈状芽胞杆菌(Bacillus？mycoides)R2菌株，其保藏编号为CCTCC？NO：M？2015251。本发明所提供的蕈状芽胞杆菌(Bacillus？mycoides)R2菌株经16S？rRNA分析和其他形态学等分析，确定该菌株为蕈状芽胞杆菌(Bacillus？mycoides)，其命名为蕈状芽胞杆菌(Bacillus？mycoides)R2。本发明筛选到一株蕈状芽胞杆菌R2菌株对线虫有较好的抗虫活性，丰富了芽胞杆菌杀线虫剂的理论。蕈状芽胞杆菌R2菌株产生的N,N-二乙基-间-甲苯酰胺DEET和苯乙烯对线虫有驱避作用，为开发线虫驱避剂及其在线虫防治中的应用奠定理论基础。阐明病原微生物与宿主之间的相互关系及其作用分子机制，为信息化合物在线虫生物防治方面的应用奠定理论基础。CCTCC NO：M 201525120150427
【IPC分类】C12R1/07, A01N63/00, A01P5/00, C12N15/11
【公开号】CN105039326
【申请号】CN201510408821
【发明人】赵秀云, 杨丽, 高慧娟, 李林
【申请人】华中农业大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月13日