波长。
[0068] 3、C18反相高效液相色谱法
[0069] 收集萃取分离得到的石油醚相含抗虫活性物质的组分，真空旋转蒸发，用纯水溶 解之后，以〇. 22 ym的过滤器除去提取物中的杂质。流动相：乙腈，使用之前用抽滤装置 进行脱气，并用超声波振荡器破气泡。液相色谱仪为日本岛津公司产品，包括HPLC Pump 515和Dual AAbsorbance Detector 2487检测器。液相色谱柱为上海博纳艾杰尔生产 的C18(4. 6mmX250mm)柱。上样量为20yl，流动相为：乙腈，梯度为10% -80%，时间为 40min，洗脱速度为0. 5mL/min，检测波长为210nm，常温。根据C18的HPLC色谱图分别收集 每个峰，将收集的物质真空冻干之后，验证每个峰对应组分的抗虫活性。
[0070] 结果如图4所示，将石油醚萃取得到的样品通过HPLC分离，收集了 4个峰。分别 测其对秀丽隐杆线虫的校正致死率，结果如图5所示。从图中可以看出峰2和峰3都有较 好的抗虫活性。初步推测抗虫活性物质集中在峰2和峰3中，后续的实验从峰2和峰3中 分离出抗虫活性物质。
[0071 ] 通过HPLC色谱图收集分别峰2和峰3的物质，将峰2和峰3收集的物质再做HPLC， 进一步的分离纯化。
[0072] 以上测抗虫活性的方法均相同，秀丽隐杆线虫致死率的测定方法：在96孔细胞培 养板中每个孔里依次加入5 y 1 5-氟尿嘧啶（12. 5mg/L)，3 y 1氯霉素，1 y 1链霉素，200 y 1 R2上清液，最后加入30条生长状态相当且处于L4期的秀丽隐杆线虫，每个处理设三个重 复。72h后观察并计算秀丽隐杆线虫致死率。
[0073] 实施例3
[0074] 蕈状芽胞杆菌R2产生的杀线虫活性物质的结构分析：
[0075] HPLC-MS 分析：
[0076] 米用 Agilent Technologies 1260 和 Aglient Technologies 6540UHD Accurate-Mass Q-T0F LC-MS的液质联用系统正离子模式检测，离子源参数为气体温度 350°C，气体流速9. 0L/min，雾化器压力为0. 2756MPa，参比粒子的质核比（m/z)为121. 0509 和922. 0098,质谱检测范围100-1700m/z，采集速率1. 5spectrac/sec，测定上述经HPLC收 集到的含抗虫活性物质的组分。分离柱为美国安捷伦有限公司的C18(2. ImmXIOOmm)色谱 柱。上样量为lyL，流动相为10% -80%的乙腈，时间为40min，洗脱速度为0. 5mL/min，检 测波长为210nm。Meplin数据软件用于数据处理。
[0077]1、峰 2LC-MS 分析：
[0078] 峰2有较好的抗虫活性，将收集的峰2样品做LC-MS分析。对活性峰经质谱解析 发现活性物质有三种组分。结果如图6所示，化合物1的阳离子ESI-m(m/z) :105.0,化合 物2的阳离子ESI-m(m/z) :192. 1，化合物3的阳离子ESI-m(m/z) :383. 2,经meplin数据库 检索，和相关标准图谱的对比分析，可以确定化合物2为N，N-二乙基间甲苯酰胺。N，N-二 乙基间甲苯酰胺的分子式为C12H17N0,分子量为191. 27,匹配度为93. 33%。
[0079] 2、峰 3LC-MS 分析：
[0080] 峰3有较好的抗虫活性，将收集的峰3样品做LC-MS分析。分析结果如图7,对活 性峰经质谱解析发现活性物质有三种组分。化合物1的阳离子ESI-m(m/z) :105.0,化合物 2的阳离子ESI-m(m/z) :206. 1，化合物3的阳离子ESI-m(m/z) :411.3,经meplin数据库检 索，和相关标准图谱的对比分析，可以确定化合物1为苯乙烯，结构式如图8。苯乙烯的分子 式为C8H8,分子量为104. 1。
[0081] 实施例4 :抗虫活性的机制初步研究
[0082]1、DEET对根结线虫的抗虫活性测定
[0083] 菌株中分离出了抗虫活性物质，测定DEET标准品对根结线虫的校正致死率，来验 证活性物质的抗虫活性。在可拆卸的96孔板中，依次加3 y 1氯霉素，1 y 1链霉素，200 y 1 M9缓冲液，30条生长状态相当且处于L4期的秀丽隐杆线虫。剪一片滤纸片放在孔上，每 个孔的滤纸上分别滴加10 y 1，20 y 1，30 y 1，40 y 1DEET (对照组的滤纸上加对应量的无菌 水）。96孔板放在平板上，封膜。示意图如图9。
[0084] 从图10中可以看出，20y l，30y l，40y 1 DEET对根结线虫的抗虫活性均达到 80%以上，说明DEET对根结线虫有较好的抗虫活性。
[0085] 2、苯乙烯对根结线虫的抗虫活性检测
[0086] 方法同DEET对根结线虫的抗虫活性测定，从图11中可以看出，苯乙烯对根结线虫 有较好的抗虫活性。
[0087] 实施例5 :活性物质驱避线虫机制初步研究
[0088] 线虫驱避性检测：选用直径为10cm的1. 6%水琼脂正方形平板，距离平板中心每 间隔0. 75cm划分区域，共分为A、B、C、D、E、F六个区域，A、B、C为处理组区域，D、E、F为对 照组区域。在A区、F区边缘处分别做两个标记，分别作为样品和对照加样的位置。将2 yl 的DEET加至样品处，2 y 1无菌水加至对照。在样品前方两侧0. 75cm处加1 y 1叠氮钠作为 麻醉剂。将约50条生长状态相当且处于L4期的秀丽隐杆线虫加至平板的中间位置，60min 后计算六个区域的线虫数。驱避性指数（avoidance index) = (A+B)线虫数-(E+F)线虫 数/六个区域的总线虫数，设置6个重复，示意图如图12所示。
[0089] 1、DEET对秀丽隐杆线虫的驱避性检测
[0090] 设置6个重复，实验得到6个重复的平均驱避性指数为-0. 4,说明DEET对秀丽隐 杆线虫有驱避作用。
[0091 ] 2、苯乙烯对根结线虫的抗虫活性检测
[0092] 设置6个重复，6个重复的平均驱避性指数为-0. 26,说明苯乙烯对秀丽隐杆线虫 有驱避作用。
[0093] 实施例6 :蕈状芽胞杆菌R2菌株诱导的番茄系统抗性反应：（1)过氧化物酶（POD) 活性测定
[0094] 选取长势相当的4-5叶期番茄，每株植株25ml蕈状芽胞杆菌发酵液浇灌在其根 部，以蒸馏水处理为对照。每隔15d灌根一次，60d后统计病情。根据根结分级情况，对照组 的9级较多，实验组的0级、1级较多，说明蕈状芽胞杆菌R2发酵液对根结病有很好的防效， 取对照组的9级和实验组的0级、1级根尖测定P0D酶活性，比较对照组和实验组的根部酶 活，检测蕈状芽胞杆菌R2是否诱导番茄产生的抗病性反应。
[0095] 准确称取对照组9级、实验组0级和1级的番茄根尖各0. 4g，放入预冷的研钵中， 加入3mL 0. 05M预冷的PBS缓冲液（pH 7. 0)和0. lg聚乙烯吡咯烷酮（PVP)及少量石英砂， 冰浴研磨成匀浆。4°C，12000rpm/min离心20min，取上清液即粗酶液，置-20°C冰箱中备用。
[0096] 在比色管中，依次加入0. 05MPBS(pH7. 0) lmL、l%愈创木酚lmL和粗酶液lmL，摇 勾后于30°C恒温水浴5min。向管中加入0. 3% H202lmL，摇勾后迅速将反应液倒入lcm光径 比色杯中，于470nm下测定0D值增加速度。用加lmL蒸馏水的标准管校零，并计算P0D活 性。用蒸馏水校零。
[0097] P0D活性（A 0D ? g 1 ? min 3 = ( A〇D47。X VT) AFW X t X
[0098] 式中t:反应时间（min) ;VT:样液总体积（mL) ;Vi:测定时样品用量（mL) ;FW:样 品鲜重（g)。
[0099] 结果如图13所示，蕈状芽胞杆菌R2诱导后实验组的番茄根系POD酶活性高于对 照组，蕈状芽胞杆菌R2可诱导番茄根系P0D的活性提高。
[0100] (2)多酚氧化酶（PP0)活性测定
[0101] PP0粗酶液提取与P0D相同，不需稀释。测定时向比色管中加入0. 05M PBS(pH 7. 0) 1. 5mL和粗酶液0. lmL。30°C水浴2min后，加入0. 02M邻苯二酚1. 5mL，摇匀后迅速于 420nm下测定0D值增加速度，并计算PP0活性。用蒸馏水校零。
[0102] PP0活性（A 0D ? g 1 ? min 3 = ( A〇D420 X VT) AFW X t X V!)
[0103] 式中t:反应时间（min) ;VT:样液总体积（mL) ;Vi:测定时样品用量（mL) ;FW:样 品鲜重（g)。
[0104] 结果如图14所示，蕈状芽胞杆菌R2诱导后番茄根系的PP0活性实验组的1级显 著高于对照组，是对照组的1. 49倍（P < 0. 01)。实验组的0级也显著高于对照组，是对照 组的1. 6倍（P < 0. 01)，说明蕈状芽胞杆菌R2可诱导番茄根系PP0的活性提高。
[0105](3)苯丙氨酸解氨酶（PAL)活性测定
[0106]