可用于检测与2型糖尿病相关的glud1基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种辅助诊断2型糖尿病的检测试剂盒，尤其是涉及一种可用于检测 与2型糖尿病相关的如7基因启动子区甲基化程度的试剂盒。
【背景技术】
[0002] 糖尿病（diabetes mellitus)是一种慢性代谢性疾病，是血中胰岛素绝对或相 对不足，导致血糖过高，出现糖尿，进而引起脂肪和蛋白质代谢紊乱，临床上可出现多尿、烦 渴、多饮、多食，消瘦等表现，重者容易发生酮症酸中毒等急性并发症或血管、神经等慢性并 发症。糖尿病是一种常见的内分泌代谢性疾病，其患病率随着生活条件的改善生活水平提 高都呈逐渐增长的趋势。据统计，目前中国糖尿病患病人数接近一亿，患病率高达9. 7%。糖 尿病不是单一疾病，是由遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。其中2型糖尿 病发病人数约占糖尿病总发病人数的97%。截至目前尽管能从遗传的角度证实不同基因的 表达能引起个体对2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus, T2DM )的易感性不同，相关 候选基因的单核苷酸多态性与T2DM的发生也具有关联性，然而遗传因素和环境因素等病 因对T2DM发病机制仍未被完全阐释清楚，这无疑妨碍了 T2D预防及治疗水平的提高。
[0003] 如7 (glutamate dehydrogenase 1)基因位于人类染色体10q23. 3能够编码谷 氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase,⑶H )，该蛋白在线粒体中以六聚体形式存在。⑶H 在脑组织星形胶质细胞中高表达，用于清除和代谢神经组织释放的谷氨酸；GDH在肝脏和 肾脏的氨代谢和解毒作用中也发挥了重要作用；GDH在胰岛0细胞中是引起胰岛素分泌 的关键酶，其作用是催化谷氨酰胺生成信号分子谷氨酸，从而激发胰岛素的分泌。国内外的 研究表明通过抑制胰岛0细胞GDH的活性或利用敲除了 0细胞特异GDH的转基因小鼠 PGludl -/-作为动物模型进行研究，结果发现GDH被抑制或缺失都会导致胰岛素的分泌 减少。目前，国内外还没有公开任何关于检测2型糖尿病相关的如7基因启动子区甲基 化程度的试剂盒相关研究报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种可用于检测与2型糖尿病相关的如7基 因甲基化程度的试剂盒及其应用，其中如7基因甲基化水平与女性人群2型糖尿病患病 率呈负相关，检测效率高，针对性强。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种可用于检测与2型糖尿病相 关的如7基因启动子区甲基化程度的试剂盒，该试剂盒包括如7基因启动子区的甲基 化特异性扩增上游引物及其甲基化特异性扩增下游引物和甲基化特异性测序引物，其中 所述的甲基化特异性扩增上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示： 5' - GTTGAAAGGGATAATAAAAGT -3'， 所述的甲基化特异性扩增下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示： 5' - Biotin-CACCCTAACCTATCCTCTAA-3'， 所述的甲基化特异性测序引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示： 5' - GTTAGTTAAGTATAATTTAAT -3'。
[0006] 上述可用于检测与2型糖尿病相关的如7基因启动子区甲基化程度的试剂盒的 应用，该试剂盒可用于2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。
[0007] 上述可用于检测与2型糖尿病相关的如7基因启动子区甲基化程度的试剂盒的 应用，该试剂盒可用于女性人群2型糖尿病辅助检测、诊断或药物治疗中。
[0008] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了可用于检测与2型糖尿 病相关的如7基因启动子区甲基化程度的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含一 对如7基因启动子区的甲基化特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物，外周血中 如7基因启动子区低甲基化水平导致如7基因的高表达，影响了⑶H活性，参与了胰岛 素的分泌，从而影响2型糖尿病的发生和发展。因此，如7基因启动子区甲基化水平与2 型糖尿病的患病率呈负相关，通过检测如7基因启动子区甲基化程度辅助诊断糖尿病， 简单、方便，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于的 糖尿病的早期预防、早发现和及时治疗。
[0009] 综上所述，以如7基因启动子区域甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快 捷地在分子水平上实现对2型糖尿病的检测，同时，以如7基因启动子区域DNA甲基化为 靶点的药物有望成为大肠癌辅助诊断、检测和筛选的一种新手段。
【附图说明】
[0010] 图1为如7基因被检测序列所在区域(具体位置为ChrlO:88855256-88855448) 及所检测的5个CpG点之间的相关性示意图(例如CpGl与CpG2的相关系数为0. 741，CpG2 与CpG3的相关系数为0. 692); 图2为如7基因甲基化水平检测结果示意图（图中所示百分数为对应CpG位点的甲 基化程度，如图示有CpGl到CpG5的甲基化程度分别为6%，15%，3%，19%，5%)。
【具体实施方式】
[0011] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。 具体实施例
[0012] 1、研究对象的收集 从深圳市某慢性病研究所收集2型糖尿病患者标本，2型糖尿病诊断标准依据2010年 美国糖尿病协会(ADA)指南，排除高血压、冠心病等心脏疾病、肾功能不全、药物滥用、肥胖 或其他严重的疾病等疾病后，最后确定T2D97例作为病例组（59. 74±9. 42岁），同时收集年 龄、性别、BMI相匹配且无其他疾病的97名正常者作为对照组（59. 74±9. 42岁）。对所有研 究对象在知情同意的前提下，抽血测总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、尿素和肌酐等一 般生化指标，同时抽取静脉血3ml入EDTA抗凝管中，-80°C低温储存，以备用于标本统一提 取基因组DNA。
[0013] 2、基因组DNA的提取 应用Lab-Aid 820全自动核酸提取仪（中国厦门，致善生物科技）提取上述步骤得到 的样本的全血基因组DNA，再通过NanoDrop2000超微量分光光度计（美国，Thermo Fisher Scientific)检测所得DNA的浓度，以供如7基因和/77W7基因启动子区DNA甲基化水平 的检测。
[0014] 3、DNA甲基化水平测定 本研究采用焦磷酸测序技术对汉^基因启动子区的5个CpG位点(如图1所示)进行 了 DNA甲基化水平分析。此技术的基本原理：用重亚硫酸盐处理DNA样品后，再应用聚合酶 链反应（PCR)扩增，可使发生甲基化的胞嘧啶（C)碱基保持不变，而使未发生甲基化的C转 变成了尿嘧啶（U)，然后通过测序引物进行PCR测序，从而得到哪个位点发生了甲基化。本 次研究采用PyroMark Assay Design软件进行引物设计， 用于实验的如7基因启动子区甲基化扩增引物和测序引物如下： (1) 甲基化特异性扩增上游引物（Forward primer) 5' - GTTGAAAGGGATAATAAAAGT -3'（SEQ ID NO. 1)， (2) 甲基化特异性扩增下游引物（Reverse primer) 5' - Biotin-CACCCTAACCTATCCTCTAA-3' （SEQ ID N0.2)， (3) 甲基化特异性测序引物（Sequencing primer) 5' - GTTAGTTAAGTATAATTTA