CR扩增产物进行测序检测，如果扩增产物序列中92bp处的碱基为C， 则待测晋南牛属于生长性状优的优势品种。s种基因型的测序峰图如图1所示。
[0049] 1.4基因型判定
[0050] 通过Snapshot方法检测待测晋南牛的基因型，具体步骤如下：
[0051] 根据NCBI数据库公布的Gli3基因序列（Gene 10:785371)和待测SNP位点的位 置设计用于Snapshot检测的延伸引物：5' -TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
[0052] 对1. 2中的PCR扩增产物进行纯化，取3y1PCR产物用Exol(核酸外切酶）和 化stAP(热敏碱性憐酸酶）进行纯化，其中Exol用来去除反应产物中的剩余引物，化stAP 用来去除反应中剩余的dNTP。反应体系为：3ylPCR产物，0.Exol，0. 8yl化stAP， 0. 7y1Exol反应缓冲液，3. 3y1dd&O;反应条件为：37°C15分钟；80°C15分钟。
[0053] 纯化后向上述纯化体系中加入延伸引物，进行延伸反应，反应体系为：2yl纯化 体系，lyl Snapshot Mix试剂，延伸引物，lyl (1地2〇;反应条件为：96°C1分钟； 96°C 10秒，52°C 5秒，60°C 30秒，30个循环。
[0054] 取1y1延伸产物，加10y1上样缓冲液，95°C变性3分钟，立即冰水浴，上测序仪 进行检测。 阳化5] 根据Snapshot的结果判定SNP位点在检测群体中的基因型。根据样品的峰图的 颜色，基因型可分为CC型、CT型和TT型。S种基因型的分型结果如图2所示。
[0056] 1. 5上述SNP标记在晋南牛优势品种选育中的应用
[0057] 该SNP可作为分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响生长性能的数量性 状基因座，W对晋南牛直接进行基因型选择或分子标记辅助选择，从而加快晋南牛优势品 种的选育。
[0058] 实施例2晋南牛不同基因型与生长性状的关联分析与检测应用
[0059] 按照实施例1的方法，对采自山西晋南地区不同晋南牛养殖场的361头晋南牛进 行Snapshot检测，Gli3基因如SEQ ID NO. 1所示序列92bp位点的分析结果如表1所示。
[0060] 运用SAS9. 2软件GLM程序进行线性模拟分析SNP多态位点的基因型与生长性状 的关联关系，采用的模型如下： 阳06U Yui= ji+gi+hj+ai+eui
[0062]其中，yui为生长性状的表型值；y为总体均值；g1为基因型效应；h,为场效应；a1 为年龄效应；eui为随机残差。分析结果如表2所示。
[0063] 表1SNP位点在晋南牛群体中的基因型频率及等位基因频率
[0064]
W65] 由表1可知，CC纯合型个体数显著高于TT型，C等位基因为优势基因。进行卡方 适合性检验，x2= 〇.675<x2。。5(1) = 3.84，可知该位点在群体中处于化'(17-胖61油6'邑平 衡状态。
[0066] 表2晋南牛Gli3基因SNP位点与生长性状关联分析
[0067]
[0068] 注：表2中的数值表示为最小二乘均值+标准误差；表中相同的字母表示差异不 显著，不同的字母表示差异显著，大写字母表示差异极显著（P<〇. 01)，小写字母表示差异显 著（P<0. 05)。
[0069] 由表2可知，基因型对体重、体斜长和胸围的影响均达到了显著水平（P<0. 05)。CC 型个体的体重和体斜长极显著高于TT型个体（P<0. 01)，CC型个体的胸围显著高于TT型个 体（P<0. 05)，CT型个体的体重显著高于TT型个体（P<0. 05)。
[0070] 实施例3用于检测与晋南牛生长性状相关的SNP标记的试剂盒
[0071] 试剂盒中的各成分组成如下：
[0072] 标准阳性模板，用于Snapshot检测的特异性PCR引物F/R，用于Snapshot检测的 延伸引物，Premixhq? (dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2\PCR反应缓冲液），测序酶，核酸外切 酶，热敏碱性憐酸酶，四种巧光标记ddNTP，dd&O等。 阳073] PCR反应使用的扩增体系W25y1计为：lOOng/y1模板DNA(提取的待测晋南牛 的基因组DNA)lyl，10pmol/yl引物F和R各lyl，Premixl'aq?12.5yl，d地20 9.5yl。[0074]引物F:5' -GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'（沈QIDNO. 2) 阳0巧]引物R:5' -GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3'（沈QIDNO. 3)
[0076]延伸引物：5'-TCATTCCCTCTGCTGCCACCGC-3'（沈QIDNO. 4)
[0077]PCR反应条件为：95°C10 分钟；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 个循环； 72°C10 分钟。
[0078]Snapshot检测：对PCR扩增产物进行纯化，取3y1PCR产物用Exol(核酸外切 酶）和化stAP(热敏碱性憐酸酶）进行纯化，其中Exol用来去除反应产物中的剩余引物， 化stAP用来去除反应中剩余的dNTP。反应体系为：3ylPCR产物，0.Exol，0. 8yl 化stAP，0. 7y1Exol反应缓冲液，3. 3y1d地2〇;反应条件为：37°C15分钟；80°C15分钟。
[0079] 纯化后向上述纯化体系中加入延伸引物，进行延伸反应，反应体系为：2yl纯化 体系，lylSnapshotMix试剂，延伸引物，lyl(1地2〇;反应条件为：96°C1分钟； 96°C10 秒，52°C5 秒，60°C30 秒，30 个循环。
[0080] 取1y1延伸产物，加10y1上样缓冲液，95°C变性3分钟，立即冰水浴，上测序仪 进行检测。根据PCR扩增产物序列第92bp位点上的碱基，从而判断样本的基因型，对待测 晋南牛的生长性能做出判断。
[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可w对之作一些修改或改进，运对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的运些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 与晋南牛生长性状相关的SNP标记，其特征在于，其位于晋南牛GLi3基因如SEQID NO. 1所示序列的92bp处，此处碱基为C的晋南牛的生长性能显著优于此处碱基为T的晋南 牛。2. 用于检测权利要求1所述与晋南牛生长性状相关的SNP标记的引物 对，其特征在于，包括正向引物F5' -GAGTCAGCCCAGCAGAATACTA-3'和反向引物 R5,-GGCTACAGAAGACAGCCCTGC-3, 。3. 含有权利要求2所述引物对的检测试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于SnaPshot检测 的延伸引物5' -TCAITCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。5. 根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA 聚合酶、Mg'PCR反应缓冲液、测序酶、核酸外切酶、热敏碱性磷酸酶、四种荧光标记ddNTP、 标准阳性模板中的至少一种。6. 权利要求1所述与晋南牛生长性状相关的SNP标记在鉴定生长性能优的晋南牛优势 品种中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测晋南牛的基因组DNA; 2) 以待测晋南牛的基因组DNA为模板，利用权利要求2所述引物F和R，通过PCR反应 扩增出晋南牛GLi3基因162bp片段； 3) 检测PCR扩增产物，如果扩增产物序列中92bp处的碱基为C，则待测晋南牛属于生 长性状优的优势品种。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，步骤2)中PCR反应使用的扩增体系 以 25y1 计为：IOOng/y1 模板DNAIy1，IOpmol/y1 引物F和R各Iy1，PremixTaq? 12. 5y1，CldH2O9. 5y1; PCR反应条件为：95°C10 分钟；94°C30 秒，60°C30 秒，72°C30 秒，35 个循环；72°C10 分钟。9. 权利要求1所述与晋南牛生长性状相关的SNP标记在晋南牛分子标记辅助育种中的 应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括以下步骤： (1) 提取待测晋南牛的基因组DNA; (2) 通过SnaPshot方法检测待测晋南牛的基因型； (3) 根据基因型进行生长性能优的晋南牛优势品种的选育； 其中，SnaPshot方法中使用的PCR引物对：包括正向引物 SnaPshot方法中使用的延伸引物为：5' -TCAITCCCTCTGCTGCCACCGC-3'。
【专利摘要】本发明提供了一种与晋南牛生长性状相关的SNP标记及其应用，其位于晋南牛GLi3基因如SEQ？ID？NO.1所示序列的92bp处，此处碱基为C的晋南牛的生长性能显著优于此处碱基为T的晋南牛。本发明还提供用于检测所述SNP标记的引物对、试剂盒以及检测方法。本发明提供的方法准确可靠，操作方便，且不受晋南牛年龄、性别等限制，可用于晋南牛的早期选育，显著促进育种进程。同时该SNP位点的检出也为晋南牛生长性状的分子标记辅助选择提供了科学依据。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105200136
【申请号】CN201510618808
【发明人】张元庆, 贺东昌, 王栋才, 王志俊, 刘文俊, 张喜忠
【申请人】山西省农业科学院畜牧兽医研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年9月24日