四纹豆象的分子标记序列及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于农作物病害防治领域，具体设及一种四纹豆象的分子标记序列及检测 方法。
【背景技术】
[0002] 食用豆是人类重要的食物资源，是中国种植业结构调整、出口创汇和山区农民脱 贫致富的重要作物。
[0003] 四纹豆象（Callosobruchusmacula1:usF油ricius)，属銷翅目（Coleoptera)，豆 象科度ruchidae)，瘤背豆象属（Callosobruchus)主要通过被害种子的调运、藏匿于包装 物和交通工具的缝隙处进行远距离传播，通过成虫飞翔、搬运货物或工具作近距离扩散，在 胆藏室内1个月可产生1个世代，可造成60%W上的重量损失，由此可见，四纹豆象一旦在 我国广泛传播，必将对我国食用豆产业造成巨大损失。因此，2006年，四纹豆象被列入我国 农业部公布的《全国农业植物检疫性有害生物名单》，2007年被列入农业部与国家质量监督 检验检疫总局共同制定《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。因此对四纹豆象 的快速、准确检测对防治四纹豆象虫害具有重要意义。此外，与四纹豆象同属瘤背豆象属的 近似种绿豆象是世界性害虫，我国除西藏尚未发现外，其他各地均有发生危害。由于四纹豆 象与绿豆象外形极为相似，尤其是与明色型的绿豆象，形态特征更为相近，因此，从外观上 很容易将2种豆象混淆，从而可能在国内外食用豆种子的交流或贸易中造成四纹豆象的传 播与扩散，对我国食用豆的安全生产和储藏造成严重威胁。
[0004] 由此可见，获得能够准确、快速的将四纹豆象与其他豆象科害虫（特别是绿豆象） 进行区分的四纹豆象特异性分子标记，在口岸检疫、国内外引种交流和贸易中具有重要的 应用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种将四纹豆象与其他豆象科害虫进行区分的四纹豆象 特异性分子标记及方法。
[0006] 为达到W上目的，本发明提供了一种四纹豆象的分子标记序列，所述分子标记序 列含有如SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列，或者含有SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列中的 特异性序列。
[0007] 可选的，所述分子标记序列为SEQIDNo. 1所示的核巧酸序列。
[0008] 本发明还提供了一种四纹豆象检测方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA 中是否存在本发明所述的分子标记序列。
[0009] 所述检测方法可W为PCR方法或者分子杂交方法。
[0010] 可选的，所述方法包括W下步骤：
[0011] 1)W待测样品的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，获得扩增产物；
[0012] 2)检测扩增产物中是否存在本发明所述的分子标记序列。
[0013] 当所述扩增产物中存在所述四纹豆象分子标记序列时判定待测样品中含有四纹 豆象DNA。
[0014] 当所述扩增产物中不存在所述四纹豆象分子标记序列时判定待测样品中不含有 四纹豆象DNA。
[0015] 本发明还提供了一种所述分子标记序列的特异性引物，所述特异性引物的核巧酸 序列为：
[0016]正向引物：5 ' -TTACATCACCAGGCAGTCCA-3，；
[0017]反向引物：5 ' -ACCGGTATTCAAACGGATTC-3，。
[0018] 本发明还提供了所述分子标记序列或所述特异性引物在鉴别四纹豆象中的应用。
[0019] 可选的，所述应用包括对待测样品进行PCR扩增反应，其中，所述PCR扩增反应 在lOyL体系中进行jlOmmolLiTris-肥 1pH8. 3,50mMKCl，1.5mMMgCl2,50yMdNTPs， 0.2]iM正、反向引物，0. 5UTaqpolymerase和 20ngDM模板。
[0020] 扩增程序为：94°C5min;94°C30s，57°C30s，72°CImin，共 35 个循环；72°C 10min〇
[0021] 可选的，所述应用包括将四纹豆象与绿豆象、菜豆象和魏豆象中的至少一种进行 鉴别区分。
[0022] 可选的，所述应用为鉴别区分四纹豆象与绿豆象，从而将运两种种属相同，形态学 特征相近的豆象科害虫进行快速准确的区分。
[0023] 本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有本发明所述的特异性引物。
[0024] 可选的，所述试剂盒中还含有阳性标准品，所述阳性标准品可W为含有本发明所 述的分子标记序列的质粒DNA。
[0025] 可选的，本发明所述的试剂盒中还含有PCR试剂。
[0026] 利用本发明所提供的特异性标记、引物和方法可W准确、快速的检测待测样品中 是否存在四纹豆象，同时可W将四纹豆象与其他豆象科害虫进行明显的区分，能够将形态 学上极为相似的四纹豆象与绿豆象进行准确区分，在口岸检疫、国内外引种交流和贸易中 具有重要的应用价值。
【附图说明】
[0027] 图1特异性引物在四纹豆象、绿豆象和菜豆象中的扩增结果
[0028] 其中，M:100bpDNALadder;1-10泳道：四纹豆象；11-17泳道：绿豆象；18-25泳 道：菜豆象。
【具体实施方式】
[0029] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。 阳〇3〇] 实施例1
[0031] 1、四纹丑象和绿丑象基因组DNA提取 阳03引取单头豆象，除去其腹部，利用天根的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提 取单头豆象DNA，经琼脂糖凝胶电泳和UV-VISspectrophotometerQ5000紫外-可见分光 光度计（如awell，USA)双重检测其含量和纯度，于一20°C下保存备用。
[0033] 2、SSR引物筛选
[0034]SSR引物的PCR扩增在lOyL反应体系中进行aOmmolLiTris-肥1pH8. 3,50Mm KCl，1.5mMMgCl2,50yMdNTPs，0. 2yM上、下游引物，0. 5UTaqpolymerase和20ngDNA模 板。扩增反应在ABI9700热循环仪中进行：94°C4min;94°C30s，50-60°C(视引物退火溫 度而定）3〇3,72°(：1111111，35个循环；72°(：1〇111111。扩增产物用8%的非变性？466胶分离，然 后进行银染显色。DNA条带利用装有巧光灯的灯箱进行观察记录，根据10化PDNAladder 估测条带大小。
[0035] 发明人从自行开发的6000多对SSR引物中，选择在绿豆象个体中无扩增或没有多 态性的引物57对，对绿豆象和四纹豆象同时进行扩增，筛选在两种豆象之间扩