一种纤花线纹香茶菜的有效成分检测方法
【专利摘要】本发明提供一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法，该检测方法包括采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量，其中，所述高效液相色谱法的条件包括：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱；流动相：流动相A为甲醇，流动相B为0.1%（体积）的磷酸水溶液，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱程序如下，其中流动相的比例均为体积百分比：0~30min，流动相A为30%，流动相B为70%；30~70?min，流动相A为30%→50%，流动相B为70%→50%。该检测方法通过高效液相色谱法成功地实现了对纤花线纹香茶菜中黄酮类和迷迭香酸有效成分含量的同时测定，能够用来表征纤花线纹香茶菜的药材质量。
【专利说明】一种纤花线纹香茶菜的有效成分检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材检测领域，具体涉及一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法。
【背景技术】
[0002]纤花线纹香茶菜属唇形科香茶菜属植物(Isodon lophanthoides (Buch.-Ham.ex D.Don) Hara var.graciliflora (Benth.) H.Hara),为中药溪黄草的来源之一,其具有清热利湿、退黄祛湿、凉血散瘀的功效，可以用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、痢疾、肠炎等病症，是我国南方地区治疗乙型肝炎的常用草药。目前，纤花线纹香茶菜虽然使用广泛，但是查阅大量资料发现，《中国药典》历版均未收载。《广东省中药材标准》2011版和《广西省中药材标准》收载的纤花线纹香茶菜质量鉴别主要是通过考察其性状和薄层色谱法鉴别，单一依靠性状和薄层鉴别难以确定纤花线纹香茶菜中有效成分的含量，辨别其质量优劣，但目前尚未发现有关纤花线纹香茶菜有效成分的文献报道。
【发明内容】
[0003]为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种纤花线纹香茶菜的有效成分检测方法，该检测方法是通过高效液相色谱法成功地实现了对纤花线纹香茶菜中黄酮类和迷迭香酸有效成分含量的同时测定，能够用来表征纤花线纹香茶菜的药材质量。
[0004]本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:
[0005]一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法，该检测方法包括采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量，其中，所述高效液相色谱法的条件包括:
[0006]色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱；
[0007]流动相:流动相A为甲醇，流动相B为0.1% (体积)的磷酸水溶液，进行梯度洗脱；
[0008]所述梯度洗脱程序如下，其中流动相的比例均为体积百分比:
[0009](T30min，流动相A为30%，流动相B为70% ；
[0010]30?70 min,流动相 A 为 30% — 50%,流动相 B 为 70% — 50%。
[0011]优选地，所述高效液相色谱法的条件还包括:
[0012]流动相流速:0.5?1.5 ml/min ;优选为 lml/min ；
[0013]色谱柱柱温:15?40°C ;优选为15?35°C ；
[0014]紫外检测波长:20(T400nm ;优选为270nm。
[0015]优选地，在上述检测方法中，上述高效液相色谱法的供试品溶液按照以下步骤来制备:
[0016]取纤花线纹香茶菜lg，置于IOOml锥形瓶，加入提取溶剂25ml，超声提取30min，冷却，定容，过滤，取续滤液过0.22 μ m的微孔滤膜即得；
[0017]优选地，所述提取溶剂选自70% (体积)甲醇水溶液、50% (体积)甲醇水溶液或无水甲醇。
[0018]优选地，在上述检测方法中，上述高效液相色谱法的对照品溶液按照以下步骤来制备:
[0019]取异夏佛塔苷对照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；
[0020]取夏佛塔苷对照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；
[0021]取迷迭香酸对照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液。
[0022]具体而言，上述纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法包括以下步骤:
[0023]I)制备供试品溶液:
[0024]取纤花线纹香茶菜lg，置于IOOml锥形瓶，加入提取溶剂25ml，超声提取30min，冷却，定容，过滤，取续滤液过0.22 μ m的微孔滤膜即得；
[0025]优选地，所述提取溶剂选自70% (体积)甲醇水溶液、50% (体积)甲醇水溶液或无水甲醇。
[0026]2)制备对照品溶液:
[0027]取异夏佛塔苷对照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；
[0028]取夏佛塔苷对照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；
[0029]取迷迭香酸对照品10mg，置于IOOml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液；
[0030]3)采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中黄酮类化合物和迷迭香酸的含量:
[0031]精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ I注入高效液相色谱仪进行测定，所述高效液相色谱法的条件包括:
[0032]色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱；
[0033]流动相:流动相A为甲醇，流动相B为0.1% (体积)的磷酸水溶液，进行梯度洗脱；
[0034]所述梯度洗脱程序按如下，其中流动相的比例均为体积百分比:
[0035](T30min，流动相A为30%，流动相B为70% ；
[0036]30?70 min,流动相 A 为 30% — 50%,流动相 B 为 70% — 50%。
[0037]流动相流速:0.5?1.5 ml/min ;优选为 lml/min ；
[0038]色谱柱柱温:15?40°C ;优选为15?35°C ；
[0039]紫外检测波长:20(T400nm ;优选为270nm。
[0040]本发明经过大量实验研究，将黄酮类成分(即异夏佛塔苷和夏佛塔苷)和迷迭香酸确定为纤花线纹香茶菜中有效成分的检测指标，其中黄酮类化合物具有抗菌、抗炎、抗病毒和护肝等作用，迷迭香酸有很强的抗氧化、抗炎作用。本发明进而建立了一种有效检测纤花线纹香茶菜中黄酮类成分和迷迭香酸的含量高效液相色谱法，该方法简单、准确，可以根据有效成分含量的测定结果反映出纤花线纹香茶菜药材的功效。[0041]与现有技术相比，本发明提供的纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法具有以下积极效果:
[0042](I)本发明将其含量测定的指标选定为稳定可控的黄酮类成分和迷迭香酸，而黄酮类成分和迷迭香酸为纤花线纹香茶菜中有代表性的主要成分，其含量高、性质稳定，作为标示性成分控制纤花线纹香茶菜质量具有较好的专属性和质量相关性；
[0043](2)相对于紫外分光光度法、薄层扫描法等而言，本发明的高效液相色谱法具有分辨率高、灵敏性高、重现性好、选择性好，结果误差小等优点；
[0044](3)本发明的检测方法对样品的预处理快速，方便、易操作；
[0045](4)本发明的检测方法实现了对纤花线纹香茶菜中黄酮类和迷迭香酸的定性、定量分析，填补了纤花线纹香茶菜的有效成分分析方面的研究空白；
[0046](5)不同的色谱条件、不同的处理方法对于药材有效成分的检测结果会有很大影响，本发明经筛选优选获得的高效液相色谱法检测条件和步骤可以准确、简便地测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量。
【专利附图】
【附图说明】
[0047]以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中:
[0048]图1为异夏佛塔苷对照品HPLC色谱图；
[0049]图2为夏佛塔苷和迷迭香酸对照品HPLC色谱图；
[0050]图3为实施例3第(I)项所示梯度洗脱条件下的供试品HPLC色谱图；
[0051]图4为实施例3第(2)项所示梯度洗脱条件下的供试品HPLC色谱图；
[0052]图5为实施例3第(3)项所示梯度洗脱条件下的供试品HPLC色谱图；
[0053]图6为等度洗脱供试品HPLC色谱图；
[0054]图7为异夏佛塔苷对照品标准曲线；
[0055]图8为夏佛塔苷对照品标准曲线；
[0056]图9为迷迭香酸对照品标准曲线。
【具体实施方式】
[0057]以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
[0058]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
[0059]以下各实施例中所使用的对照品来源如下:
[0060]异夏佛塔苷、夏佛塔苷、迷迭香酸均购自成都曼斯特生物科技有限公司，纯度≥ 98% ；
[0061]其它仪器及试剂:
[0062]采用Waters 2695-2996高效液相色谱系统,包括:Empower工作站(Waters公司)，Dikma C18 (4.6 mmX 250 mm, 5 μ m)色谱柱，电子天平。
[0063]纤花线纹香茶菜全草来自广州白云山和记黄埔中药有限公司种植基地；
[0064]乙腈为色谱纯，甲醇为分析纯，磷酸为分析纯，水为蒸懼水。[0065]实施例1
[0066]采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中的异夏佛塔苷、夏佛塔苷、迷迭香酸
含量:
[0067]I)制备对照品溶液:
[0068]精密称取异夏佛塔苷对照品10mg，置于100mL容量瓶中，加入少量70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容至刻度，摇匀，配置成浓度为0.15mg/ml的异夏佛塔苷对照品溶液，并于4°C冰箱存放备用。
[0069]同法制得夏佛塔苷和迷迭香酸对照品溶液。
[0070]2)制备供试品溶液:
[0071]取纤花线纹香茶菜药材lg，精密称定，置于100mL锥形瓶，精密加入70% (体积)甲醇水溶液25ml，称定重量，超声提取30min，冷却后，加70% (体积)甲醇水溶液补足重量，过滤，取续滤液过0.22 μ m的微孔滤膜，并于4°C冰箱存放备用。
[0072]3)测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ I注入高效液相色谱仪进行测定，见图1、图2、图5 ；
[0073]所述高效液相色谱法的条件包括:
[0074]色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱；
[0075]流动相:流动相A为甲醇，流动相B为0.1% (体积)的磷酸水溶液，进行梯度洗脱；
[0076]梯度洗脱程序按如下，其中流动相比例均为体积百分比:
[0077](T30min，流动相A为30%，流动相B为70% ；
[0078]30~70 min,流动相 A 为 30% — 50%,流动相 B 为 70% — 50%。
[0079]流动相流速:lml/min ;
[0080]流动相柱温:15~35°C
[0081]紫外测定波长:270nm。
[0082]实施例2
[0083]本发明纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法的方法学考察:
[0084](I)线性关系
[0085]采用和实施例1相同的操作步骤和条件，分别精密量取异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸对照品溶液适量，进样分析，以进样量对色谱峰面积积分值进行线性回归处理，得异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的回归直线方程、相关系数及线性范围，见表1，结果表明三者在相应的范围内，具有良好的线性关系，见图7、图8、图9。
[0086]表1:线性考察实验结果
【权利要求】
1.一种纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法，该检测方法包括采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中异夏佛塔苷、夏佛塔苷和迷迭香酸的含量，其中，所述高效液相色谱法的条件包括: 色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱； 流动相:流动相A为甲醇，流动相B为0.1% (体积)的磷酸水溶液，进行梯度洗脱； 所述梯度洗脱程序如下，其中流动相的比例均为体积百分比: 0~30min，流动相A为30%,流动相B为70% ； 30~70 min,流动相A为30% — 50%,流动相B为70% — 50%。
2.根据权利要求1的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的条件还包括: 流动相流速:0.5"?.5 ml/min ;优选为lml/min ； 色谱柱柱温:15~40°C ;优选为15~35°C ； 紫外检测波长:20(T400nm ;优选为270nm。
3.根据权利要求1或2的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的供试品溶液按照以下步骤来制备: 取纤花线纹香茶菜lg，置于100ml锥形瓶,加入提取溶剂25ml,超声提取30min,冷却，定容，过滤，取续滤液过0.22 μ m的微孔滤膜即得； 优选地，所述提取溶剂选自70% (体积)甲醇水溶液、50% (体积)甲醇水溶液或无水甲醇。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的对照品溶液按照以下步骤来制备: 取异夏佛塔苷对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液； 取夏佛塔苷对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液； 取迷迭香酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述纤花线纹香茶菜有效成分的检测方法包括以下步骤: 1)制备供试品溶液: 取纤花线纹香茶菜lg，置于100ml锥形瓶,加入提取溶剂25ml,超声提取30min,冷却，定容，过滤，取续滤液过0.22 μ m的微孔滤膜即得； 优选地，所述提取溶剂选自70% (体积)甲醇水溶液、50% (体积)甲醇水溶液或无水甲醇； 2)制备对照品溶液: 取异夏佛塔苷对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液； 取夏佛塔苷对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液； 取迷迭香酸对照品10mg ，置于100ml容量瓶中，加入70% (体积)甲醇水溶液溶解，定容，制成浓度为0.15mg/ml的溶液，作为对照品溶液； 3)采用高效液相色谱法测定纤花线纹香茶菜中黄酮类化合物和迷迭香酸的含量: 精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μ I注入高效液相色谱仪进行测定，所述高效液相色谱法的条件包括: 色谱柱:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂C18反相色谱柱； 流动相:流动相A为甲醇，流动相B为0.1% (体积)的磷酸水溶液，进行梯度洗脱； 所述梯度洗脱程序按如下，其中流动相的比例均为体积百分比: 0~30min，流动相A为30%,流动相B为70% ； 30~70 min,流动相A为30% — 50%,流动相B为70% — 50% ； 流动相流速:0.5"!.5 ml/min;优选为lml/min ; 色谱柱柱温:15~40°C ;优选为15~35°C ； 紫外检测波长:20(T400nm·;优选为270nm。
【文档编号】G01N30/02GK103852526SQ201210506796
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月30日 优先权日:2012年11月30日
【发明者】匡艳辉, 林青, 黄琳, 姚小华, 王德勤 申请人:广州白云山和记黄埔中药有限公司