高盐溶液包括0.8mol/L的柠檬酸钠和1.2mol/L的NaCl)和上清液E3体积1/2倍的经_20°C预冷的异丙醇，混匀得混合液F，混合液F在_20°C放置lh，然后在4°C，转速为12000r/min离心1min得沉淀物Fl ；
[0067]7)将沉淀物Fl用浓度为70%乙醇洗涤2次，风干沉淀物Fl，再向沉淀物Fl中加500 μ L灭菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl体积1/10倍的浓度为3mol/L，pH为5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl体积2倍的无水乙醇，混匀得混合液G，40C下以转速为12000r/min离心1min得沉淀物Gl ；
[0068]8)沉淀物Gl用浓度为70 %乙醇洗涤2次，再用浓度为100 %乙醇洗涤I次，自然风干，风干后的沉淀物Gl中加入50 μ L 0.1 X TE溶液(包括浓度为1.0mmol/、L pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.lmmol/L, pH为8.0的EDTA)溶解后即为连香树基因组DNA溶液。
[0069]1.2本发明方法与常规方法提取连香树基因组DNA比较
[0070]1.2.1 DNA凝胶电泳检测分析
[0071]如图1，从6种方法提取DNA的琼脂糖电泳凝胶成像照片可见，本发明方法(图1中附图标记4处)提取的DNA质量较好，条带亮度较强，残留杂质少，因而能满足进一步的分子生物学研究需要。CTAB法(图1中标记I处)和PVP法(图1中标记5处)的条带亮度虽也较强，但点样孔有较多残留的糖类等杂质，表明DNA提取的质量不及本发明方法提取的DNA，糖类等杂质除去不彻底。而高盐低pH法(图1中标记2处)、SDS法(图1中标记3处)和尿素法(图1中标记6处)提取的DNA含量较少，电泳条带亮度较弱，点样孔也还有不少的杂质，无法满足进一步的分子生物学研究需要，因此通过本发明提取方法可获得较好的DNA。
[0072]1.2.2 DNA的RAPD-PCR扩增凝胶电泳检测分析
[0073]从PCR扩增反应后的电泳图谱看，如图2所示，本发明方法提取的DNA可用于RAPD-PCR扩增，扩增产物有较清晰的电泳条带(图2中标记I处)，且条带数较多，可用于进一步的分子生物学研究。CTAB法(图2中标记4处)和PVP法(图2中标记5处)扩增结果类似，电泳条带较本发明方法的少，而且点样孔由于含糖类等杂质较多出现明显亮带，扩增结果不理想，无法满足进一步的分子生物学研究需要。SDS法(图2中标记2处)、高盐低pH法(图2中标记3处)、尿素法(图2中标记6处)提取的DNA除了点样孔由于杂质的存在出现亮带外，并无RAPD-PCR扩增亮带，因此无法满足进一步的分子生物学研究需要。
[0074]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤: . 1)取30?50mg的连香树叶片，液氮研磨，研磨过程中加入I?2.5mg的PVP40、1?.2.5mg的抗坏血酸钠和I?2mg的石英砂，研磨均匀后得粉末A，将粉末A加入到经65°C预热的700 μ L提取缓冲液中，再加入100 μ L β -巯基乙醇，振荡混匀得混合液B，混合液B于.65°C恒温水浴I?1.5h，其间晃动3?4次； . 2)向混合液B中加入其体积1/3倍的浓度为5mol/L、pH为4.8的KAC溶液得混合液C，将混合液C置于-20°C冰浴0.5?lh，离心得上清液Cl ; . 3)向上清液Cl中加入其体积1/5倍的2X CTAB提取缓冲液，混匀得混合液D，混合液D于65°C恒温水浴10?20min，冷却至室温后，加入与混合液D等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液E，离心得上清液El ; .4)向上清液El中加入与上清液El等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E2 ; .5)向上清液E2中加入与上清液E2等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E3 ; . 6)向上清液E3中加入其体积1/2倍的高盐溶液和上清液E3体积1/2倍的经_20°C预冷的异丙醇，混匀得混合液F，混合液F在_20°C放置0.5?lh，离心得沉淀物Fl ; .7)将沉淀物Fl用浓度为70%乙醇洗涤，风干沉淀物Fl，再向沉淀物Fl中加500μ L灭菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl体积1/10倍的浓度为3mol/L、pH为5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl体积2倍的无水乙醇，混匀得混合液G，离心得沉淀物Gl ; .8)沉淀物Gl用浓度为70%乙醇洗涤2次，再用浓度为100%乙醇洗涤I次，自然风干，风干后的沉淀物Gl中加入0.1 XTE溶液溶解后即为连香树基因组DNA溶液。2.根据权利要求1所述的一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤.1)中提取缓冲液包括浓度为100mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为50mmol/L、pH为8.0的 EDTA，浓度为 1.0moI/L 的 NaCl, 2% SDS 及 2% PVP40。3.根据权利要求1所述的一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤.2)、3)、4)、5)、6)、7)中的离心条件为4°C，转速为 12000r/min 离心 1min04.根据权利要求1所述的一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤.3)中2XCTAB提取缓冲液包括浓度为100mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为20mmol/L、pH 为 8.0 的 EDTA，浓度为 1.4mol/L 的 NaCl，及 2% CTAB05.根据权利要求1所述的一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤.6)中高盐溶液包括0.8mol/L的柠檬酸钠和1.2mol/L的NaCl。6.根据权利要求1所述的一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤.8)中 0.lXTE溶液包括浓度为1.0mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl，浓度为0.lmmol/L、pH 为.8.0 的 EDTA07.根据权利要求1所述的一种连香树基因组DNA的提取方法，其特征在于，该方法具体包括以下步骤: I)取40mg的干样连香树叶片，液氮研磨，研磨过程中加入2mg的PVP40、2mg的抗坏血酸钠和1.5mg的石英砂，研磨均匀后得粉末A，将粉末A加入到经65°C预热的700 μ L提取缓冲液中，再加入100 μ L β -巯基乙醇，振荡混匀得混合液B，混合液B于65°C恒温水浴I?.1.5h，其间晃动3?4次； .2)向混合液B中加入其体积1/3倍的浓度为5mol/L、pH为4.8的KAC溶液得混合液C，将混合液C置于-20°C冰浴0.5?lh，离心得上清液Cl ; . 3)向上清液Cl中加入其体积1/5倍的2X CTAB提取缓冲液，混匀得混合液D，混合液D于65°C恒温水浴10?20min，冷却至室温后，加入与混合液D等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液E，离心得上清液El ; . 4)向上清液El中加入与上清液El等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E2 ; .5)向上清液E2中加入与上清液E2等体积的24: I的氯仿-异戊醇溶液得混合液，离心得上清液E3 ; .6)向上清液E3中加入其体积1/2倍的高盐溶液和上清液E3体积1/2倍的经_20°C预冷的异丙醇，混匀得混合液F，混合液F在_20°C放置0.5?lh，离心得沉淀物Fl ; .7)将沉淀物Fl用浓度为70%乙醇洗涤2次，风干沉淀物F1，再向沉淀物Fl中加.500 μ L灭菌水溶解，再加入溶解沉淀物Fl体积1/10倍的浓度为3mol/L、pH为5.2的NaAC溶液及溶解沉淀物Fl体积2倍的无水乙醇，混匀得混合液G，离心得沉淀物Gl ; . 8)沉淀物Gl用浓度为70%乙醇洗涤2次，再用浓度为100%乙醇洗涤I次，自然风干，风干后的沉淀物Gl中加入50 μ L 0.1 XTE溶液溶解后即为连香树基因组DNA溶液。
【专利摘要】本发明公开一种连香树基因组DNA的提取方法，属于分子生物学领域，包括：连香树叶片研磨后加PVP40、抗坏血酸钠和石英砂，粉末加到提取液中，再加β-巯基乙醇，混匀后水浴；混合液中加KAC溶液，冰浴后离心得上清液C1；上清液C1中加2×CTAB提取液，再加氯仿-异戊醇得混合液E，离心得上清液E1；重复加氯仿-异戊醇、离心操作两次得上清液E3；上清液E3中加高盐和异丙醇，混匀静置、离心得沉淀物F1；沉淀物F1洗涤风干、溶解，加NaAC溶液及无水乙醇，混匀、低温静置后离心得沉淀物G1；沉淀物G1洗涤风干，加0.1×TE溶解后得连香树DNA溶液。该方法提取连香树基因组DNA效果好、纯度高，操作简单。
【IPC分类】C12N15/10
【公开号】CN105039312
【申请号】CN201510503029
【发明人】黄绍辉, 刘艳
【申请人】徐州工程学院
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年8月14日